在本报告中，我们展示了在新鲜全血上进行表型分析实验的染色与分析步骤，以计数主要的天然免疫和适应性白细胞群体。我们重点强调了在多中心临床试验背景下开展这些操作时的注意事项。
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摘要
摘要
外周血白细胞的冷冻保存在临床试验中被广泛用于保存细胞，以便进行免疫反应评估，该方法为免疫学检测的便捷性和标准化提供了诸多优势，但该过程已被发现对某些细胞亚群（如粒细胞、B细胞和树突状细胞）具有不利影响 1-3检测新鲜白细胞能够更准确地反映实际情况 体内 细胞状态，但在大规模临床试验中往往难以实施。新鲜细胞检测依赖于志愿者的配合及其时间安排，如果检测耗时较长，则可能因需要实验室人员投入大量工作时间而变得不切实际。此外，当试验在多个中心开展时，具备执行检测所需资源和培训条件的实验室可能与临床场所相距较远。为解决这些问题，我们开发了一种11色抗体染色 panel，可与Trucount管（Becton Dickinson；San Jose, CA）联合使用，用于对外周血中主要的白细胞亚群进行表型鉴定与计数，所提供的细胞类型特异性信息比全血细胞计数（CBC）或市面上针对Trucount管设计的仅标记少数细胞类型的商用panel更为全面。该染色流程简便，仅需100 μl新鲜全血，耗时约45分钟，适合常规血液处理实验室操作。本方法改编自BD Trucount管技术数据表（版本 8/2010). 染色抗体混合液可在中心检测实验室预先大量配制，并运送至各样本处理实验室。染色后的样本管可经固定并冷冻保存，随后运送至中心检测实验室进行多色流式细胞术分析。本染色方案所产生的数据可用于追踪干预措施下随时间变化的白细胞浓度变化，并可进一步拓展用于评估特定目标细胞类型的活化状态。本报告中，我们展示了血液处理实验室技术人员对新鲜全血进行染色的操作流程，以及在支持多中心临床试验的中心检测实验室中分析这些染色样本的具体步骤。视频内容详细描述了该操作流程在HIV疫苗临床试验网络（HVTN）临床试验采血背景下的实际执行过程。
方案
注意：为保护荧光染料偶联抗体免受光照，所有步骤均需在关闭光源的生物安全柜中进行。
1. 抗体染色面板制备
- 抗体染色方案见表1。抗体浓度应通过全血滴定确定，并使用与获取染色表型样本时相同的流式细胞仪设备和操作流程进行。
- 确定合适的染色滴度后，将所有抗体混合至一个带盖离心管中。加入流式洗涤缓冲液（含2%热灭活胎牛血清的杜氏磷酸盐缓冲液），使总体积达到100 μl。根据待染色样本数量对混合液进行比例放大。该混合液可在4 °C保存最多八周。
2. 染色
- 如果采集的血液除本检测外还需用于其他用途，请先留出一份等分试样，以便对剩余血液进行时间敏感性更高的操作。该等分试样可在静脉采血后室温保存长达4小时，而不会造成显著的细胞损失。
- 确认Trucount管底部有完整的微球沉淀，并标记该管以标识待染色的样本。在HVTN临床试验中，使用实验室数据管理系统（Frontier Science and Technology Research Foundation；Amherst, NY）对染色样本进行标记和追踪。
- 记录所有试剂的批号和有效期。记录制造商提供的Trucount管袋上标注的微球计数编号；确保袋子上的批号与管上的批号一致。
- 使用反向移液法，准确将100 μl全血加入Trucount管中，液滴置于金属固定环上方。避免将血液涂抹在管壁上。
- 使用常规（正向）移液技术，将100 μl混合的抗体染色组合（见表1）加入Trucount管中。盖紧管盖，低速涡旋震荡约15秒以充分混匀。目视检查，确保微球沉淀已完全溶解。
- 将Trucount管在室温（15–30 °C）避光条件下孵育15分钟。
- 如有必要，使用去离子水（diH2O）将10× FACS溶血液稀释至1×工作浓度。向管中加入900 μl 1× FACS溶血液。
- 盖紧管盖，低速彻底涡旋震荡约15秒以混匀。用力将管盖压紧至锁定位置，并用实验室封口膜密封。
- 将样本管储存于-65 °C至-95 °C，直至准备运送到中心分析实验室或进行内部分析。此阶段样本至少可稳定保存四周。若需立即运输或检测，可省略此步骤。
3. 运输
注意： 以下说明使用 Saf-T-Pak, Inc. 的隔热运输系统，该系统专为根据国际航空运输协会（IATA）规定运输B类豁免生物物质而设计。如果在染色操作的同一地点进行样本分析，请转至第4节。
- 样本可在染色后立即运输，或在 -65 °C 至 -95 °C 冻存后运输。用铝箔将每支试管完全包裹，并放入染色样本盒中。将染色样本盒放入带有吸水材料的防漏塑料袋中。
- 将防漏塑料袋及其内容物放入特卫强（Tyvek）袋中，并尽可能排出袋内空气后密封。
- 将样本包装（样本置于次级包装内）放入内层棕色盒中。
- 将内层棕色盒放入泡沫箱的凹槽内，并固定到位以防止移动。
- 在泡沫箱内加入干冰（约 8 kg），并紧密盖上箱盖。
- 用胶带牢固封好运输箱，并按照B类生物物质（UN3373）进行运输，同时正确标注干冰（UN1845）信息；请遵循IATA PI-650操作指南。
- 样本接收后，应储存在 -65 °C 至 -95 °C 环境中，直至进行分析。
4. 解冻与流式细胞术分析
- 从冷冻箱中取出染色样本，在避光条件下于室温解冻，然后上流式细胞仪检测。若需检测多个样本，应通过错开解冻时间的方式对所有样本管进行标准化处理，确保每管样本在室温下放置不超过1小时。
- 应使用配备适当滤光片的四激光流式细胞仪（如BD LSR II）获取样本数据。数据采集时采用标准的流式细胞仪校准和荧光补偿方法4。
注意：在采集过程中不要设置前向散射或侧向散射的阈值5。Trucount微球的信号可能低于这些参数的最低可设阈值，导致分析时部分微球未被计入。如果仪器要求设置阈值，请设置最低可能的Am Cyan通道阈值。由于使用该试剂 panel 染色的CD45+白细胞在Am Cyan通道呈阳性，且Trucount微球在Am Cyan通道也有荧光信号，因此该设置可确保所有相关数据被正确采集。
- 上样至流式细胞仪前，将样本管涡旋振荡5秒。Trucount微球在多个通道中具有强烈的荧光信号。采集数据时通过寻找在PE Cy5和APC双通道均呈强阳性的细胞群来圈选微球（微球与细胞最易区分的两个荧光通道可能因仪器不同而有所差异）。将微球圈门设为终止门，持续采集数据直至至少获得20,000个微球事件。
- 使用适当的软件（如FlowJo，Treestar；Ashland, OR）分析数据。图1展示了从一次代表性对照血样中分析不同白细胞亚群所采用的设门策略。
5. Trucount 计算
- 每个 Trucount 管中含有荧光微球的冻干颗粒。向管中加入液体并涡旋震荡后，微球应在样本中均匀分布。颗粒中微球的数量因批号略有差异，可在试管的储存袋上找到具体数值。
- 如图1所示，对 Trucount 微球和细胞群体设门，以确定各群体的事件数。将微球门中的事件数与管中原始微球总数进行比较，可计算出所采集样本的比例，进而用于确定各群体的绝对浓度（即，细胞/μl）。可使用以下公式进行计算：细胞浓度（# 细胞/μl 全血）= [# 目标群体事件数 /（# 微球事件数 / 颗粒中微球总数）] / 100 μl。
6. 典型结果
图1. 用于分析主要白细胞群体的设门策略，展示来自一名健康志愿者的代表性数据。A) Trucount 微球（i）被设门并从细胞中排除。粒细胞（ii）被圈定，淋巴细胞和单核细胞被分为三个群体：CD14阴性淋巴细胞（iii）、所有CD14阴性细胞（iv）以及非淋巴细胞（v）。B) 对CD14阴性淋巴细胞设门，以区分CD4+ T细胞（vi）、CD8+ T细胞（vii）、B细胞（viii）、CD56亮表达NK细胞（ix）、CD56弱表达NK细胞（x）和CD56阴性NK细胞（xi）。C) 对所有CD14阴性细胞设门，以区分髓系（xii）和浆细胞样（xiii）树突状细胞。D) 对非淋巴细胞设门，以区分非经典型（xiv）、中间型（xv）和经典型（xvi）单核细胞。 点击此处查看大图。
未在图1中显示的更特异的细胞亚群（例如，NKT细胞或中性粒细胞）也可通过本方案提供的抗体组合进行区分，且设门策略可根据具体研究需求进行扩展或调整。某些设门步骤为此方法所特有。特别需要注意的是，在Trucount微球周围分别绘制一个包含门和一个排除门，并将二者叠加，其中一个用于微球计数，另一个用于在细胞分析中排除微球（图1A）。此外，由于在全血样本中，淋巴细胞、单核细胞和粒细胞在前向散射光和侧向散射光上的区分不如在外周血单个核细胞中清晰，因此通常需要结合CD45表达与侧向散射光进行设门（图1A）。在某些图中，通过CD45和侧向散射光无法与淋巴细胞和单核细胞完全分离的污染性粒细胞（以圆圈标出）可通过其高表达CD16加以识别（图1C和图1D）。这类污染性粒细胞数量通常较少，不会干扰单核细胞和NK细胞的设门分析。
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讨论
本报告中，我们介绍一种基于微球的方法，通过流式细胞术对新鲜全血中的白细胞亚群进行计数，并阐述该方法在多中心临床试验中用于集中样本分析时所需的关键参数。该方法在BD Trucount方案的基础上进行了优化，使其能够在多中心临床试验环境中实现可靠应用。染色实验操作简便，耗时约45分钟，便于血液处理实验室技术人员完成样本处理、冻存及寄送至中心检测实验室进行分析。本实验仅需100 μl全血，无需耗时且成本较高的外周血单个核细胞（PBMC）分离步骤，且所需血量远少于常规表型分析实验。此外，由于使用新鲜全血，该方法能更真实地反映细胞的体内状态，并避免了某些细胞类型在冻存过程中所受到的不利影响1-3。该染色方法可准确测定细胞浓度，同时相较于全血细胞计数（CBC）及其他计数方法，还能更清晰地区分更多类型的细胞。获得准确且一致结果的关键在于严格标准化实验流程中的关键步骤，并采用一套记录系统，对所有操作步骤进行追踪，以便在发现异常时能够追溯至误差来源。
在整个实验过程中，有多个关键步骤会影响由此检测所获得数据的质量。首先，从血液采集到染色的处理和操作过程的标准化...
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致谢
感谢 Jessica Jones、Erica Clark、Constance Ducar、Donna Smith、Roy Lewis、Lily Apedaile、Joanne Wiesner、Devin Adams、Corey McBain 和 Stephen Voght 在本方法、论文及视频的开发过程中提供的帮助。
本工作由比尔和梅琳达·盖茨基金会CAVD资助项目38645（M.J.M.）以及美国国立卫生研究院资助项目UM1 AI068618和U01 AI069481（M.J.M.）支持。E.A-N. 获美国国立卫生研究院T32 AI007140资助项目支持。我们感谢詹姆斯·B·彭德尔顿慈善信托基金慷慨捐赠的设备。
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| Trucount 绝对计数管 | BD 生物科学 | 340334 | |
| 10X FACS 溶解液 | BD 生物科学 | 349202 | |
| B类 &和免运费系统，绝缘 | Saf-T-Pak | STP-320 | |
| CD45 AmCyan 单克隆抗体 | BD 生物科学 | 339192 | |
| CD3 FITC 单克隆抗体 | BD 生物科学 | 349201 | |
| CD8 PerCp-Cy 5.5 单克隆抗体 | BD 生物科学 | 341051 | |
| CD4 Alexa Fluor 700 单克隆抗体 | BD Biosciences | 557922 | |
| HLA-DR ECD 单克隆抗体 | 贝克曼库尔特 | IM3636 | |
| CD14 v450 单克隆抗体 | BD 生物科学 | 560349 | |
| CD19 PE 单克隆抗体 | BD Biosciences | 555413 | |
| CD16 APC-H7 单克隆抗体 | BD Biosciences | 560195 | |
| CD56 PE-Cy7 单克隆抗体 | BD 生物科学 | 335791 | |
| CD11c APC 单克隆抗体 | BD 生物科学 | 559877 | |
| CD123 PE-Cy5 单克隆抗体 | BD 生物科学 | 551065 |
参考文献
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