用于声致液滴汽化及气泡增强超声介导消融的窄分布相变型纳米乳液的合成

摘要

相变型纳米乳剂（PSNE）可通过高强度聚焦超声触发汽化，从而增强局部加热效果，提高肿瘤热消融效率。本报告描述了具有窄粒径分布的稳定PSNE的制备方法，并在模拟组织的体模中展示了汽化后PSNE对超声介导消融效果的影响。

摘要

高强度聚焦超声（HIFU）在临床上用于通过热效应消融肿瘤。为了增强局部加热效果并提高肿瘤内的热消融效率，已开发出可被HIFU汽化的脂质包覆全氟碳液滴。许多肿瘤的血管结构因快速生长而异常通透，纳米颗粒能够通过这些缝隙被动渗入并在肿瘤内积聚。因此，调控液滴的尺寸可实现其在肿瘤内更有效的富集。本文报道了一种制备粒径分布均一的相变型纳米乳液（PSNE）中稳定液滴的方法。PSNE通过在液态全氟碳存在下对脂质溶液进行超声处理而合成。通过使用孔径为100 nm或200 nm的滤膜多次挤出，获得粒径分布均一的PSNE。在7天内采用动态光散射法测定其粒径分布。制备了含有PSNE的聚丙烯酰胺水凝胶，用于 体外 实验中，水凝胶内的PSNE液滴通过超声波汽化，所产生的气泡增强了局部加热效果。PSNE的汽化可实现更快的升温，同时降低热消融所需的超声强度。因此，PSNE有望增强肿瘤中的热消融效果，从而可能改善HIFU介导的热消融治疗的疗效。

方案

1. 相变纳米乳液（PSNE）的制备

1. 将11 mg DPPC和1.68 mg DSPE-PEG2000溶解于氯仿中
2. 蒸发有机溶剂，在玻璃圆底烧瓶中形成干燥的脂质膜
3. 将脂质膜在真空条件下干燥过夜
4. 用5.5 ml磷酸盐缓冲液（PBS）重新水合脂质膜
5. 将溶液置于45 °C水浴中加热，直至脂质膜完全溶解，并定期涡旋混匀
6. 将脂质溶液转移至7 ml小瓶中
7. 在20%振幅下对脂质溶液进行2分钟超声处理
8. 将溶液均分为两个2.5 ml的小瓶（弃去剩余的0.5 ml）
9. 向每个小瓶中加入2.5 ml PBS
10. 将每个小瓶置于0 °C冰水浴中
11. 向每个小瓶中加入50 μl DDFP
12. 在冰水浴中对每个小瓶进行超声处理，设置如下：25%振幅，脉冲模式（开启10秒，关闭50秒），总开启时间为60秒
13. 将PSNE溶液转移至20 ml闪烁瓶中
14. 向每个小瓶中加入5 ml PBS，最终体积为10 ml
15. 按照制造商提供的说明组装挤出器
    1. 用去离子水冲洗各部件
    2. 将不锈钢支撑盘置于滤器支撑底座中央
    3. 将不锈钢筛网放置在不锈钢支撑盘上方
    4. 使用镊子将挤出器排水盘膜（光泽面朝上）放置在不锈钢筛网上
    5. 使用镊子将挤出器滤膜（光泽面朝上）放置在排水盘膜上
    6. 小心地将小O型圈放置在滤膜上，然后将热筒和挤出器上部组件置于支撑底座上方
    7. 先部分拧紧每个翼形螺母，然后以交替方式用手完全拧紧翼形螺母
    8. 将挤出器连接至氮气管线
    9. 为预润挤出器，用移液器将10 ml去离子水加入顶部样品口，盖紧开口，并关闭排气阀
    10. 缓慢打开氮气管线以增加压力，迫使样品通过膜，从出口管路收集样品
    11. 使用后按相反顺序拆卸，用去离子水冲洗挤出器各部件，并丢弃滤膜和排水盘膜
16. 仅针对100 nm液滴，先通过200 nm滤膜挤出10次以预处理PSNE
17. 通过100 nm或200 nm滤膜将PSNE挤出16次，以获得较窄的粒径分布

2. 含有PSNE的聚丙烯酰胺水凝胶的制备

1. 通过将 1.2 g BSA 粉末溶于 5 ml 去离子水中，配制 24% BSA 溶液
2. 通过将 0.1 g APS 粉末溶于 1 ml 去离子水中，配制 10% APS 溶液
3. 按以下顺序，在塑料容器中混合 2.1 ml 丙烯酰胺溶液、1.2 ml Tris 缓冲液、0.1 ml 10% APS、4.5 ml 24% BSA 溶液和 3.6 ml 去离子水
4. 加热至 40 °C，并在真空条件下放置 1 小时
5. 加入 480 μl PSNE，通过轻轻旋转塑料容器充分混匀
6. 加入 12 μl TEMED，将容器置于 12 °C 水浴中反应 2 小时

3. 代表性结果

用于组织模拟水凝胶仿体超声实验的装置示意图如图所示 图1该方案可制备出具有窄粒径分布的脂质包覆全氟碳液滴，其在溶液中至少可稳定保存一周。通过动态光散射法（90Plus 粒径分析仪，Brookhaven Instruments，Holtsville，NY）测得的粒径分布如图所示。 图2 使用100和200 nm滤膜挤出的PSNE。通过动态光散射测得的PSNE随时间变化的有效直径列于表1中，表明PSNE至少在一周内保持稳定。PSNE在聚丙烯酰胺水凝胶中汽化前后B模式成像结果如图所示 图3此外，还展示了在含有白蛋白和PSNE的聚丙烯酰胺凝胶中，经15秒HIFU介导加热后形成的病灶。 图4病灶的不对称形状是由于超声路径中存在气泡云导致焦点前加热所致。需要注意的是，通过降低发射的声功率，可以尽量减少气泡散射引起的焦点前加热和病灶形成。

图1. 采用仿组织水凝胶进行超声实验的实验装置示意图。

图 2. 聚苯乙烯纳米颗粒乳液（PSNE）经100 nm或200 nm滤膜挤出后的粒径分布，通过动态光散射法测定。纵坐标单位基于特定尺寸颗粒散射光强度相对于样品总散射光强度的比例。

图3. 聚丙烯酰胺水凝胶中PSNE汽化前（a）和汽化后（b）的B型超声图像。箭头指示由PSNE汽化形成气泡云的焦点区域。

图4. 含有白蛋白和PSNE的聚丙烯酰胺水凝胶在（a）超声诱导汽化与HIFU声处理前和（b）处理后的图像，显示了因超声加热导致的病灶形成。超声中心频率为3.3 MHz。超声信号包括一个初始的30个周期、6.4 W脉冲用于汽化PSNE，紧接着是15秒、0.77 W的连续超声。

挤出后天数	使用 200 nm 滤膜挤出		使用 100 nm 滤膜挤出
	平均直径 (nm)	标准偏差 (nm)	平均直径 (nm)	标准偏差 (nm)
1	182.9	4.9	118.0	0.9
7	177.7	2.5	124.8	3.1

表1. 使用100 nm和200 nm滤膜挤出后第1天和第7天PSNE的平均直径及标准差。

讨论

高强度聚焦超声（HIFU）在临床上用于对肿瘤进行热消融。¹ 为了增强局部加热效果并提高肿瘤内的热消融效率，已开发出脂质包被的全氟碳化物液滴，这类液滴可被HIFU汽化。许多肿瘤的血管结构由于其快速生长而异常通透。² 因此，纳米颗粒能够穿透这些孔隙并在肿瘤内被动富集，这一过程称为增强渗透与滞留（EPR）效应。³ 研究表明，粒径在70至200 nm之间的纳米颗粒在肿瘤中的富集效率最高。⁴ 本报告所述方法可制备出具有窄粒径分布的稳定相变型纳米乳剂（PSNE），即脂质包被的全氟碳化物液滴。以往大多数研究使用的是粒径分布较宽的PSNE，但近期研究则集中于制备粒径分布较窄的PSNE。^5,6 本实验方案中描述的挤出法可精确控制颗粒尺寸，从而提高经系统给药后能在肿瘤内富集的液滴比例。

纳米液滴的核心成分为十二氟戊烷，其沸点为 29 °C⁷。因此，在PSNE制备的每一步中均需保持较低温度。超声处理会使溶液温度升高，但采用脉冲式超声程序并在超声过程中将样品置于冰水浴中，可减...

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
DPPC	Avanti Lipids，阿拉巴斯特，AL，美国	850355P	1,2-二棕榈酰-sn-甘油-3-磷酰胆碱
DSPE-PEG2000	Avanti Lipids，阿拉巴斯特，AL，美国	880120P	1,2-二硬脂酰-sn-甘油-3-磷–乙醇胺-N-[甲氧基(聚乙二醇)-2000]（铵盐）
DDFP	Fluoromed，朗德罗克，TX，美国	CAS: 138495-42-8	十二氟戊烷（C5F12）
PBS	Sigma-Aldrich，圣路易斯，MO，美国	P2194	磷酸盐缓冲液
氯仿	Sigma-Aldrich，圣路易斯，MO，美国	372978	氯仿
丙烯酰胺	Sigma-Aldrich，圣路易斯，MO，美国	A9926	40% 19:1 丙烯酰胺/双丙烯酰胺
Tris 缓冲液	Sigma-Aldrich，圣路易斯，MO，美国	T2694	1 M，pH 8，三羟甲基氨基甲烷盐酸盐和三羟甲基氨基甲烷碱
BSA	Sigma-Aldrich，圣路易斯，MO，美国	A3059	牛血清白蛋白
APS	Sigma-Aldrich，圣路易斯，MO，美国	A3678	过硫酸铵溶液
TEMED	Sigma-Aldrich，圣路易斯，MO，美国	87689	N,N,N',N'-四甲基乙二胺
仪器
超声波破碎仪（3 mm 探头）	Sonics Materials, Inc.，纽顿，CT，美国	Vibra-Cell
水浴锅	Thermo Fisher Scientific，沃尔瑟姆，MA，美国	Neslab EX-7
挤出器	Northern Lipids，伯纳比，BC，加拿大	LIPEX
挤出器滤膜	Whatman，皮斯卡特维，NJ，美国	Nuclepore #110605 和 #110606
挤出器排水盘	Sterlitech Corporation，肯特，WA，美国	#PETEDD25100
塑料腔室	U.S. Plastic Corporation，利马，OH，美国	#55288，1 3/16" × 1 3/16" × 2 7/16"