利用烟粉虱传播植物病毒

摘要

要更好地理解并有效防控多种由昆虫传播的植物病毒，必须使用其传播介体。昆虫传播植物病毒是一种三营养级相互作用，因此需要对昆虫、病毒和植物进行操作。必须大量饲养传播介体，并以确保向测试植物实现高传播率的方式对其进行操控。本文介绍了烟粉虱（Bemisia tabaci，Hemiptera: Aleyrodidae）的饲养与操作基本方法，该昆虫是多种新发植物病毒属的传播介体，涉及大量具有重要经济意义的植物病毒。

摘要

粉虱（Hemiptera: Aleyrodidae, Bemisia tabaci）是一类形态上难以区分的物种复合体⁵，可传播多种植物病毒。由粉虱传播的植物病毒包括多个属（Begomovirus, Carlavirus, Crinivirus, Ipomovirus, Torradovirus），其中包含数百种新发且具有重要经济意义的病原体，可侵染重要的粮食和纤维作物（综述见^9,10,16）。这些病毒不在其介体昆虫体内复制，但仍可通过成虫粉虱以多种方式在植株间高效传播（综述见^{2,6,7,9,10,11,17}）。对于大多数此类病毒，粉虱取食是病毒获毒和接种所必需的，而另一些病毒则仅需粉虱探针即可完成传播。许多这类病毒无法或难以通过其他方式有效传播。因此，病毒种群的维持、生物学与分子特征分析（如寄主范围和症状鉴定）^3,13以及生态学研究^2,12，均需依赖粉虱介体将病毒接种至实验寄主植物。此外，开发新的防控策略，例如评估新型化学药剂¹⁴或化合物¹⁵、探索新的农艺措施^1,4,19，或筛选与培育抗性品种^7,8,18，也都需要利用粉虱进行病毒传播。在育种项目中，利用粉虱传播植物病毒来筛选和培育抗性品种尤为具有挑战性⁷。有效的抗性筛选需要使用大量植株，且必须确保100%的植株均成功接种，以便从中发现少数携带抗性基因的基因型。此类研究每年通常需要使用大量带毒粉虱，且常需多次重复。

此处描述的粉虱保种方法可全年每周在植物上产生数百至数千只成虫，且不会受到其他植物病毒的污染。每周必须引入无粉虱和无病毒的植物植株进入粉虱种群。粉虱培养物必须避免粉虱病原体、寄生生物及拟寄生物的污染，这些生物可能降低粉虱种群数量和/或降低病毒传播效率。采用本方法建立的种群可根据需要快速扩大或缩小规模，并可根据病毒所依赖的寄主植物调整以适应粉虱的取食偏好。

可以维持两种基本类型的粉虱种群：非带毒粉虱种群和带毒粉虱种群。非带毒粉虱种群由饲养在无病毒植物上的粉虱组成，可每周提供可用于从不同病毒源传播病毒的粉虱。带毒粉虱种群由饲养在病毒感染植物上的粉虱组成，可每周提供已获得病毒的粉虱，从而省略了病毒传播过程中的一个步骤。

方案

1. 烟粉虱种群的维持

1. 环境条件：粉虱种群应维持在受控的生长室内。相对湿度、温度、光周期和光照强度的控制对种群的最佳生长至关重要（图1）。在28 °C、相对湿度30–50%、14小时光周期的条件下，粉虱从卵发育至成虫羽化需18天（该时间随寄主植物不同而变化）。相对湿度应保持在70%以下，以抑制昆虫和植物真菌病原体的生长。应减少施肥量和浇水量，以防止真菌病原体滋生和盐分积累。种群培养所需的光照强度应较高。使用足够数量的VHO荧光灯，在冠层高度处产生约800–1,000英尺烛光的光照强度，足以满足大多数植物（例如棉花、菜豆、利马豆、番茄）的生长需求。保持清洁对于维持粉虱种群的最佳饲养条件至关重要。
2. 种群饲养笼：粉虱应饲养在笼内的植物上，而非在生长室内自由活动。饲养笼可由多种材料制成，但必须具备以下特性：良好的通风性、便于操作、能有效防止粉虱逃逸或外来个体侵入，并具有足够空间以容纳足够数量的植物，从而维持所需粉虱种群规模。使用薄纱加铝网（增强强度）或专用防粉虱网纱材料均能获得良好效果（参见特定仪器与耗材列表）。
3. 种群植物准备：建立粉虱种群时，所选植物种类是重要考虑因素。所选植物应能支撑高密度昆虫种群而不致植株倒伏。用于饲养非带毒粉虱的植物应为所研究病毒的非寄主，以避免种群污染；若需维持带毒种群，则所选植物必须为该病毒的寄主。植物应生长较快，以保证在接入种群后18天内有新成虫羽化，但又不能生长过快，以免在四周内超出笼体空间。推荐使用矮生型、丛生型或庭院型栽培品种，因其通常能产生与高秆品种相似的叶面积，但茎秆伸长较少。
4. 用于种群饲养的植物必须在温室中、置于排除粉虱及其他昆虫的网笼内培育，这一点极为重要。若将已感染粉虱、蓟马或螨类的植物带入种群，可能导致种群崩溃。受虫害植物还可能携带虫传病毒，从而干扰病毒传播研究。

2. 烟粉虱种群的建立

1. 首次建立种群时，使用洁净的粉虱——即无植物病毒、无其他昆虫及昆虫病原体的粉虱。这些粉虱可从合作者处获得，或从田间采集。若为田间采集，应将粉虱在目标植物病毒的非寄主植物上饲养至少8周，并检查植株是否出现症状，以确保其不携带植物病毒。
2. 第1周：将洁净粉虱引入第一组植株的饲养笼中。可根据实验需求，通过吸取已知数量的粉虱，或轻轻摇动来自其他源植株的粉虱，将其转移至新植株上。在第1周期间，粉虱会在叶片背面产卵。根据用于产卵的成虫数量以及雌性粉虱在特定寄主植物上平均产卵数，可大致预测每次羽化后的种群规模。
3. 第2周：将粉虱引入新的寄主植物饲养笼中开始第二组饲养。第1周建立的饲养笼中的植株将带有卵，且叶片背面可见部分未成熟粉虱（图2）。第1周引入的部分成虫仍存活。
4. 第3周：将粉虱引入新植株开始第三组饲养。第1周建立的饲养笼中的植株将同时存在未成熟粉虱及大量新羽化的成虫，成虫种群数量应有显著增加。第2周建立的饲养笼中的植株叶片背面将布满大量卵和未成熟粉虱。
5. 第4周：将粉虱引入新植株开始第四组饲养。第1周建立的饲养笼中的植株将有大量成虫，其羽化时间约为一周前。第2周建立的饲养笼中的植株将有大量新成虫羽化，粉虱种群数量应再次显著上升。第3周建立的饲养笼中的植株叶片背面将布满大量卵和未成熟粉虱。
6. 前4周之后的每周操作：每周将最老的第四个饲养笼（即第1周建立的笼）中的成虫转移至新的洁净饲养笼内的新植株上，以开始新一轮产卵。旧饲养笼应移除，其植株应丢弃。这些粉虱羽化时间约为一周。在带毒种群的情况下，这些粉虱在产卵繁殖下一代的同时，也会将病毒传播给新植株。
7. 规划传毒实验时，应使用第3周建立的饲养笼中即将羽化的粉虱。若需要更多粉虱，可增加植株数量，并向第1周的饲养笼中添加更多粉虱，以扩大粉虱种群规模。

3. 试验植物接种方法

1. 为确保高传播率：1）必须尽可能轻柔地处理烟粉虱，以防止昆虫受损，否则会降低传播率；2）必须提供充足的叶片面积，供烟粉虱进行取食或探针。在获毒或接种获取阶段，若因植株密度过高而限制活动空间，可能会导致试验植株的侵染率偏低；延长获毒时间或增加获毒寄主植物数量，可能有助于提高侵染率。
2. 烟粉虱的采集。 以下为实验所需精确数量烟粉虱的采集与转移操作流程。若需转移大量烟粉虱（例如用于抗性筛选），只需将烟粉虱侵染的植株轻轻摇动，使烟粉虱落入待测植株或病毒感染的获毒寄主（之后再转移至待测植株）上即可。摇动时应覆盖多个位置，以尽量减少聚集效应。
3. 新羽化的成虫（羽化后1–3天）活动性强，取食频繁，通常可获得最高的传播率⁴。较老的成虫仍具备传播能力，但频率较低。为实现高传播率，每株试验植株应使用多只烟粉虱（每株15–40只），因为每株仅放1只烟粉虱常导致传播率过低，无法满足实验要求^3,4。具体所需数量取决于病毒种类以及获毒寄主和试验植株的物种。
4. 组装吸虫装置和收集管。（图3）
5. 一手将黄色塑料卡片插入含有待采集烟粉虱的种群饲养笼内，轻轻敲击植株以促使成虫飞起。烟粉虱会被黄色卡片吸引，从植株飞向卡片，此时可用吸虫器配合极轻柔的吸气将其收集。切勿吸取正在植株上取食的烟粉虱，因其口针已插入植物组织中，强行吸离会导致口针断裂，使其无法完成病毒的获取或传播（图4）。
6. 每次收集约20只成虫至同一收集管中，以减少因反复吸取造成的机械损伤（图5）。
7. 更换收集管时，将管子在硬物表面轻敲，使烟粉虱因震动而暂时失去方向感，随即用Parafilm封口。
8. 将新的收集管接至吸虫器，重复操作直至获得所需数量的烟粉虱。收集后的烟粉虱可在室温下存放数小时。
9. 获毒。 将烟粉虱置于病毒感染的植株上，使其取食48–72小时。超过72小时的获毒期通常不会进一步提高传播率。对于以非持久性或半持久性方式传播的病毒，分别只需1小时或数小时的获毒期即可（表1）。最佳效果通常在将烟粉虱自由置于笼内、限制其仅接触单株或多株植物时获得。但某些实验需从特定叶片获毒，此时可使用夹式笼。使用夹式笼时，应注意满足烟粉虱偏好在叶片背面取食的习性。此外，夹式笼内烟粉虱密度过高会降低传播率；直径2.5 cm的夹式笼中放入10只雌性烟粉虱可达到可接受的传播率。
10. 接种。 根据接种规模准备合适的笼具，并将试验植株放入其中。若仅需接种一株植物，可使用单株笼；若需接种多株，则可考虑使用小型PVC 框架/雪纱布袋笼或铝制笼（图6）。接种所用笼具的尺寸应略大于待接种植株（或植株群）。当烟粉虱被限制在靠近植株冠层的位置、而非拥有大量自由空间时，传播率更高。
11. 从获毒寄主上收集烟粉虱的方式取决于实验需求。若所需数量较少，可按上述方法用吸虫器采集。将装有烟粉虱的收集管放入笼内靠近植株处，打开管盖（图7），倾斜管体并轻敲，使烟粉虱自行爬出或倒出。若需大量烟粉虱，可直接将带有烟粉虱的获毒寄主植株移入含有试验植株的笼中，轻轻摇动使烟粉虱脱离获毒寄主。无论采用何种引入方式，均应将烟粉虱均匀分布在各植株上，以减少聚集，确保接种均匀。
12. 让烟粉虱在试验植株上进行适当时间的探针或取食，具体时间仍取决于病毒种类及一定程度上的寄主植物种类（表1）。
13. 在接种获取期间至少检查一次烟粉虱状态，打开笼具并翻转每株植物的部分叶片，确认烟粉虱正在进行探针或取食。
14. 对于较长的接种获取期，可使用竹签或其他等效工具轻轻扰动植株顶部，促使烟粉虱在植株间重新分布。烟粉虱的再分布有助于抵消其自然聚集倾向，从而提高传播率。
15. 终止。 接种获取期通过使用批准的化学药剂杀死烟粉虱来结束。应依次施用两种杀虫剂：先使用触杀型杀虫剂快速杀死成虫，再使用内吸型杀虫剂杀灭后续数周内可能孵化或未被触杀剂杀死的个体（图8）。实践中已成功使用如杀虫皂类触杀剂，以及吡虫啉或吡蚜酮等内吸型杀虫剂。

结果

这些用于建立和维持粉虱种群以及传播植物病毒的操作方法已在多项研究中成功应用^4,11,12,14，此外还有许多未引用的研究也使用了这些方法。在利用这些方法处理持久性传播病毒时，我们通常可获得高达100%的期望传播率，用于抗性筛选、筛选能够干扰病毒传播的杀虫剂（以及评估诱导抗性的化合物）^13,14,17,18（图9）。本文所述的操作流程可在公共和私营研究机构的多种实验环境中进行调整并应用。

传播类型	获毒期（小时）	接毒期（小时）	参考文献
非持久性传播	1	2-24	10
半持久性传播	6-24	8-24	10, 16
持久性传播	48-72	48-72	3, 6, 8, 9

表1. 可用于实现不同类型的与烟粉虱（Bemisia tabaci）种团关系的病毒高效传播的估计时间。 估计时间基于已发表文献中实现80-100%传播率所需的最短时间，并在某些情况下根据潜伏期以及烟粉虱种群、病毒和寄主植物之间的差异进行了调整。

图 1. 携毒烟粉虱种群示例。 该生长室包含感染双生病毒并被携毒烟粉虱侵染的植物笼。

图 2. 左：粉虱（Bemisia tabaci MEAM 支系，按 De Barro 定义⁶）羽化后约 1 周的未成熟阶段，右：成虫粉虱，多种植物病毒的有效传播媒介。

图3. 可用于采集粉虱以进行植物病毒传播的收集装置类型。

图 4. 左：用于采集成虫烟粉虱的黄色塑料板，显示烟粉虱已准备就绪可供采集。 右：从黄色塑料板上收集烟粉虱。烟粉虱在板上呈现为微小的白色/灰色斑点。

图 5. 通过吸虫法从种群中采集的烟粉虱（每管20头），可用于取毒或接毒实验。

图6. 左上方：用于获取或接种的单株植物笼具。 右上方：由PVC管和薄纱制成的较大笼具。下方：在温室中用于饲养烟粉虱种群的铝网/纱网和细棉布笼具。

图7. 烟粉虱被转移到单株植物上进行接种（或获毒）。

图8. 添加系统性杀虫剂灌根处理以终止烟粉虱接虫获取期。

图9. 正在评估抗性的田间植株 番茄黄化曲叶病毒. 所有植株均在五周龄幼苗期进行接种，随后移栽至田间进行评估。前景中的植株为抗性种质系，背景中的植株为感性种质系。

讨论

本文所述方法是在过去二十年间逐步发展起来的，其基础是大量关于烟粉虱传毒、行为及生物学特性的研究提供的基本信息。由于相关文献众多，本论文主要参考了综述性文章以及少数精选的具体研究，以说明本技术开发所依据的数据类型。在本操作过程中，必须轻柔处理烟粉虱，因为其足和触角的损伤可能导致行为异常并降低传毒效率。使用真空泵及其他机械吸虫装置进行收集从未获得理想效果。另一个影响成功的关键因素是：为实现向测试植株100%传毒所需的烟粉虱数量，必须针对每一种植物寄主与病毒的组合进行确定。该最佳比例只需建立一次即可。使用新羽化的成虫（羽化后1–3天）可获得最佳效果，因其传毒率最高。虽然也可使用较老的成虫，但需增加个体数量以弥补其较低的传毒效率。已知雌性个体的传毒率高于雄性，因其取食频率高于雄性。然而，通常不值得花费时间进行性别分离以用于传毒实验。本操作流程可根据研究人员的资源和具体需求进行多种调整和修改。

在同时操作多种病毒时，最好维持一个饲养在非寄主植物上的单一烟粉虱种群。这些烟粉虱可被采集后放置于病毒感染的植株上以获取病毒，待获毒完成后，再将其转移至待测植株上。用于饲养种群的植株应在温室中的网罩内培养，以防止外来烟粉虱侵入并可能携带其他病毒。若这些种群植株遭受螨类、蓟马及其他植物害虫的侵染，可能会影响种群健康，甚至导致种群崩溃。最后，对种群植株的浇水需格外谨慎。由于大量烟粉虱取食以及低于正常水平的光照条件，这些植株已处于极度胁迫状态。若浇水过量，即使是单次，土壤混合物中泥炭所携带的根腐真菌便可能引发问题。在植株种植前使用杀菌剂灌根处理，可消除部分潜在问题。

尽管粉虱传播植物病毒的方法可能耗时较长，并需要宝贵的资源（如生长室），但对于某些目前尚无其他传播手段的病毒而言，这种方法至关重要。此外，该方法在筛选植物抗病毒性方面也具有重要价值，因为它采用的是与田间植物所面临的自然传播相同的方式。相比之下，使用更为人工的传播方式在评估种质资源的抗病毒性时，往往无法获得最佳结果。

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
物品名称	公司	目录编号	备注（可选）
防粉虱网纱	Klayman Meteor Ltd. Petah Tikva 49130, Israel	---	BioNet 50 目防病毒昆虫网纱
防粉虱网纱	Hummert International (www.hummert.com)	27-4050-1 - 27-4062-1	BioNet 50 目防病毒昆虫网纱
粉虱采集装置	BioQuip	1135A	也可使用滴管、柔性塑料管、塑料真空接头和纱布自制
采集管	BioQuip	8909	所用采集管取决于所使用的吸虫器类型
黄色塑料卡片	任意公司	---	任何亮黄色塑料卡片均可使用，可在多处购买
粉虱饲养笼	---	---	此类饲养笼无商业产品，需自行制作。60 cm × 60 cm × 60 cm 的笼子对我们而言效果良好。我们倾向于使用铝制窗纱、尼龙薄纱、乙烯基塑料制成，并以铝制窗框构建支撑结构。门使用钢琴铰链连接，并用密封条密封；笼顶使用乙烯基塑料。饲养笼也可采用以下方式制作：1）将有机玻璃板边缘用胶粘合，侧面切割带网孔的通风口以提供通风；2）使用尼龙薄纱、雪纺或50目粉虱专用网纱制成的大袋，内部以按所需长度裁剪并组装的PVC管件提供支撑；3）木质框架配合尼龙薄纱、雪纺或50目粉虱专用网纱。