本文描述了切伦科夫发光成像（CLI）在临床前癌症治疗监测中的应用。该方法利用切伦科夫辐射（CR）与光学成像（OI）技术来可视化放射性标记探针，从而为临床前治疗监测和药物筛选提供了一种替代正电子发射断层扫描（PET）的手段。
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摘要
摘要
在分子成像领域，正电子发射断层扫描（PET）和光学成像（OI）是两种最重要且应用最广泛的成像方式1-3。PET 以其优异的灵敏度和定量能力著称，而 OI 则因无辐射、相对成本较低、扫描时间短、通量高以及对基础研究人员广泛可用等优势而受到关注。然而，这两种成像方式也均存在局限性。PET 的空间分辨率较差且成本较高，而 OI 由于光信号在活体组织中穿透深度有限且存在显著散射，主要局限于临床前研究应用。
近年来，随着切伦科夫发光成像（Cerenkov Luminescence Imaging, CLI）技术的发现，正电子发射断层扫描（PET）与光学成像（OI）之间建立起了一座桥梁4-6。CLI 是一种新型成像方式，利用切伦科夫辐射（Cerenkov Radiation, CR）通过光学成像仪器对放射性核素进行成像。俄罗斯诺贝尔奖得主阿列克谢耶维奇·切伦科夫（Alekseyevich Cerenkov）及其同事于1934年首次发现了CR。当带电粒子在电介质中以超光速运动时，会发射一种电磁辐射，即为CR7,8。该带电粒子（无论是正电子还是电子）通过扰动介质原子中的电子，从而改变其电磁场。当扰动通过后，被激发的电子回到基态时会释放出光子。例如，据估计，一次18F衰变在水中平均可产生3个光子5。
自出现以来，CLI 已被研究用于多种临床前应用，包括 在体 肿瘤成像，报告基因成像，放射性示踪剂开发，多模态成像，以及其他4,5,9,10,11迄今为止，化学发光成像（CLI）之所以取得巨大成功，最重要的原因是这一新技术利用了光学成像（OI）成本低廉且广泛可用的优势，实现了对放射性核素的成像，而这些核素过去只能通过成本更高且设备更少的核医学成像方式（如PET）进行成像。
本文介绍了利用切伦科夫发光成像（CLI）监测癌症药物治疗的方法。我们课题组近期研究了这一新应用，并通过概念验证研究证实了其可行性12。我们证明，在不同肿瘤异种移植模型和成像探针中，CLI 与正电子发射断层扫描（PET）呈现出极好的相关性。这与切伦科夫发光的基本原理一致：CLI 本质上可视化的是与 PET 相同的放射性核素。我们选择贝伐珠单抗（Bevacizumab，商品名 Avastin；由 Genentech/Roche 公司生产）作为治疗药物，因为它是一种广为人知的血管生成抑制剂13,14。该技术在不久的将来若得以进一步成熟，有望对临床前药物研发、药物筛选以及接受治疗患者的疗效监测产生重要影响。
方案
1. 肿瘤模型
- 将H460细胞（American Type Culture Collection）培养于添加了10%胎牛血清和1%青霉素/链霉素（Invitrogen Life Technologies）的RPMI 1640培养基中。需要注意的是，细胞系的选择、培养基类型、接种部位、每只小鼠接种异种移植瘤的数量及其他相关因素均应根据具体研究目标进行优化调整。本文仅介绍一种特定的实验设计方案，以作示例。
- 在含5% CO₂的湿润环境中培养细胞系2 在 37 °C 每隔一天更换一次新鲜培养基。
- 当细胞形成75%融合的单层时，用胰蛋白酶消化并解离细胞，制成单细胞悬液，用于后续细胞培养。
- 重悬约 1 × 106 H460 细胞置于磷酸盐缓冲液（PBS；Invitrogen）中，于裸鼠（雌性无胸腺裸鼠）左右肩部皮下接种移植nu/nu），4至6周龄，Charles River Laboratories, Inc.）。
- 让肿瘤生长至150 - 200 mm³3H460 肿瘤异种移植瘤生长至该大小约需 2 周。采用标准游标卡尺测量法监测肿瘤大小。
- 当肿瘤生长至理想大小后，荷瘤小鼠即可开始接受治疗。 体内 通过PET和CLI成像。
2. PET
- 根据本时间表或根据具体项目调整的任何变体进行 PET 研究（图 1）12。多种因素可能影响时间表的设计，包括但不限于肿瘤异种移植细胞系的选择、抗癌药物及给药方案。此处仅展示一种特定的成像时间表。CLI 研究应按照与 PET 研究相同的时间表进行，在相应的 PET 检测完成后立即进行 CLI 检测。还需注意，PET 研究的主要目的是验证 CLI 结果。对于仅希望使用 OI 仪器对放射性标记探针进行成像的普通用户而言，无需进行 PET 检测。然而，如果需要进行 PET 验证，则必须强调 PET 与 CLI 仪器必须非常接近，以确保验证成功，因为 18F 的半衰期较短（109.77 分钟）。
- 将小鼠分为治疗组和对照组（每组 n ≥ 3）。在第 0 天和第 2 天，对治疗组小鼠分别注射两次贝伐珠单抗，剂量为 20 mg/kg。第 0 天定义为首次注射当天。请注意，在第 -1 天应通过 PET 和 CLI 进行预扫描。
- 使用 R4 型啮齿类动物模型扫描仪（Siemens Medical Solutions USA, Inc.）对荷瘤小鼠进行小动物 PET 成像。
- 使用 2% 异氟烷（Aerrane；Baxter）麻醉所有小鼠，并通过尾静脉注射 3'-脱氧-3'-18F-氟代胸苷（18F-FLT；7.3 - 8.0 MBq [198 - 215 μCi]）。PET 探针在注射前需用 PBS 稀释。
- 1 小时后再次麻醉小鼠，将麻醉后的小鼠俯卧位放置，靠近小动物 PET 扫描仪视野中心。
- 获取三分钟静态扫描图像，并采用二维有序子集期望最大化算法重建图像。无需进行背景校正。
- 在衰变校正后的全身冠状面图像上，于肿瘤区域绘制感兴趣区（ROIs；冠状面和横断面切片均为 5 像素）。从 ROIs 中获取每分钟每像素的最大计数，并利用校准常数转换为每分钟每毫升计数。假设组织密度为 1 g/ml，将 ROIs 转换为每分钟每克计数。通过将每分钟每克计数除以注射剂量，计算图像 ROI 衍生的 %ID/g 值。无需进行衰减校正。
3. CLI
- 应使用 IVIS Spectrum 系统（Caliper Life Sciences）进行化学发光成像（CLI）。图像的采集与分析应使用 Living Image 3.0 软件（Caliper Life Sciences）完成。采用一套包含18个窄带发射滤光片（490 - 850 nm）的系统进行波长分辨光谱成像。若实验方案中包含 PET 检测，应于每只小鼠完成 PET 后立即进行 CLI，以尽量减少放射性衰变的影响。
- 将动物置于密闭避光的成像室内，并在异氟烷麻醉下进行操作。可同时放置多只小鼠以提高通量。
- 使用3分钟曝光时间（f/stop=1，binning=4）采集图像。所有图像应采用相同的照明设置（光源电压、滤光片、f/stop、视野范围、binning）。利用背部皮肤区域计算背景组织的信号强度。将荧光发射信号归一化为每秒每平方厘米每球面度的光子数（p/s/cm2/sr）。
4. 代表性结果
CLI 与 PET 图像之间的视觉比较可轻松完成。将同一模态图像的标尺统一后，并将 CLI 与 PET 图像并列放置，可在本代表性图示（图 2A）中观察到，在经治疗的小鼠中，从治疗前到第 3 天，H460 异种移植瘤的 CLI 和 PET 信号均显著降低，提示存在显著的治疗效果。相比之下，在相同时间段内，未经治疗的小鼠肿瘤信号表现为轻度增加或无明显变化（数据未显示）。仅通过肉眼观察即可发现，CLI 与 PET 所显示的肿瘤对比度具有良好的一致性。事实上，这种视觉相关性具有足够的分辨率，能够显示由抗癌治疗方案引起的肿瘤中心坏死（请比较第 3 天的 CLI 与 PET 图像）。为验证影像学结果，可进一步进行定量分析及相关性分析。
CLI 和 PET 图像的定量分析以及通过线性回归进行的简单拟合表明，这两种成像方式确实具有极好的相关性（图 2B，R2=0.9309，针对18F-FLT 探针处理组）。值得注意的是，在我们使用不同肿瘤模型和不同抗癌药物开展的所有 CLI 和 PET 成像研究中，拟合曲线的斜率也极为接近，这表明即使将所有数据合并在一起，线性回归仍具有极佳的拟合效果（数据未显示）。两幅代表性图像均改编自我们之前的发表文献12。
图1. PET与CLI研究实验设计示意图。肿瘤接种于肩部两侧，待其生长至150–200 mm³后进行实验。3，荷瘤小鼠被实施 体内 在第 -1、1 和 3 天通过 PET 和 CLI 进行成像。贝伐珠单抗治疗于第 0 天和第 2 天各注射一次，剂量为 20 mg/kg。
图2.（A） 在体 携带H460异种移植瘤的小鼠在贝伐珠单抗治疗前（治疗前扫描）和治疗后（第3天）的CLI和PET图像。 （B） CLI与PET结果的定量分析（n=3）及其相关性。图片改编自 (6). 单击此处查看大图.
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讨论
化学发光成像（CLI）作为一种前景广阔的分子成像技术，已在众多基础科学研究领域甚至临床应用中展现出巨大潜力4,5,15,16,17。与传统的核成像技术（如PET）相比，CLI的主要优势在于其采用光学成像（OI）仪器，这类仪器操作简便、采集时间短、通量高、成本显著更低，且研究人员更容易获得。此外，与一般的光学成像不同，CLI使用β射线发射标记分子作为成像探针，其中许多探针已获得美国食品药品监督管理局（FDA）批准，而传统的光学成像试剂则不具备这一优势。凭借这些独特且理想的特性，CLI已迅速引起分子成像领域的广泛关注。然而，其在临床前及临床应用中的潜力仍有待深入探索。
癌症治疗监测是切伦科夫发光成像（CLI）具有重要应用价值的领域之一。这是一个至关重要的研究方向，对探针开发、药物筛选乃至为患者个体化定制癌症治疗方案均具有关键意义。目前，临床前癌症治疗监测几乎完全依赖核医学成像技术，如正电子发射断层扫描（PET）。因此，CLI 为 PET 提供了一种极具吸引力的替代方案，特别是因为 CLI 与 PET 图像之间存在极好的相关性。此外，CLI 在治疗监测中的另一个优...
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致谢
我们感谢美国国家癌症研究所（NCI）R01 CA128908 和斯坦福医学学者研究奖学金的支持。本文未报告其他潜在的利益冲突。
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| H460 细胞系 | 美国典型培养物保藏中心 | ATCC 编号：HTB-177 | |
| RPMI 1640 培养基 | 英潍捷基生命技术公司 | 12633-012 | |
| 胎牛血清 | 英潍捷基生命技术公司 | 10091-148 | |
| 青霉素/链霉素 | 英潍捷基生命技术公司 | 15640-055 | |
| 磷酸盐缓冲液 | 英潍捷基生命技术公司 | 10010-023 | |
| 雌性裸鼠 | 查尔斯河实验动物公司 | 品系编号：088 | |
| 贝伐珠单抗（Avastin） | 基因泰克/罗氏 | 不适用 | |
| MicroPET Rodent R4 | 西门子医学解决方案美国公司 | 不适用 | |
| 异氟烷（Aerrane） | 百特公司 | 百特编号：AHN3637 | |
| IVIS Spectrum | Caliper 生命科学公司 | 不适用 |
参考文献
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