在斑马鱼发育的细胞追踪使用Photoconvertible蛋白

摘要

在这里，我们提出了一种在活斑马鱼胚胎中光转化荧光蛋白 （PCFPs） 进行光激活开关的方法，并在发育过程中的特定时间点进一步跟踪光转化蛋白。该方法允许监测活体脊椎动物生物体中不同发育过程背后的细胞生物事件。

摘要

胚胎发生是一个动态过程，最好通过使用允许记录体内发育变化的技术来研究。事实证明，使用基因编码的荧光蛋白是阐明完整生物体中发生的动态形态发生过程的宝贵策略。在过去十年中，可光激活和可光转化荧光蛋白的开发为研究标记蛋白的离散亚群的命运提供了可能性¹。与光激活蛋白不同，光转化荧光蛋白 （PCFP） 在光转化之前很容易以其天然发射状态进行跟踪和成像，从而更容易通过光学检查识别和选择区域。由于 His-Tyr-Gly 三肽序列形成绿色发色团，该发色团可以通过光催化的 β 消除和随后的 π 偶联系统的延伸，在 UV 或蓝光下从绿色变为红色，因此 PCFP （如 Kaede²、KikGR³、Dendra⁴ 和 EosFP⁵） 在暴露于紫外线或蓝光时可以从绿色变为红色³。PCFP 及其单体变体分别是追踪细胞^6-10 和研究蛋白质动力学^11-14 的有用工具。近年来，PCFP 已在不同的动物模型中表达，例如斑马鱼⁶、鸡^7,8 和小鼠^9,10，用于细胞命运追踪。在这里，我们报告了活斑马鱼胚胎中 PCFP 的细胞特异性光转化方案，并在后期发育阶段进一步跟踪光转化蛋白。该方法允许以组织特异性方式研究斑马鱼动物模型中形态发生的细胞生物事件。

方案

1. 获取胚胎进行光转化测定

在与表达 PCFP 的转基因斑马鱼杂交后，选择最亮的纯合子胚胎，并在 28.5 °C 下生长直至所需的胚胎阶段¹⁵。

注 1：这种预选将允许以低激光功率扫描胚胎，从而防止光毒性和光漂白。

注 2：我们建议在观察胚胎时使用低强度光，并将其保持在黑暗条件下，因为 PCFP（如 Kaede 和 KikGR）对包括日光在内的光照高度敏感。

2. 嵌入

1. 在装有鸡蛋水的玻璃容器中，使用镊子在立体显微镜下对胚胎进行去绒毛膜化。
2. 通过将脱毛胚胎转移到 0.16 mg/ml 三卡因（3-氨基苯甲酸乙酯，Sigma-Aldrich）溶液（40μl 4 mg/ml 储备溶液在 1 ml E3 培养基 1X 中）来麻醉胚胎。

注 1：使用玻璃移液管或切割尖端 （P1000） 转移胚胎，以尽量减少损坏胚胎的风险。

注 2： 年轻的去绒毛膜胚胎不应暴露在空气中或被抬到水/空气界面，因为鸡蛋在受到机械应力时很容易破裂。

3. 将麻醉的胚胎转移到培养皿的盖子上，并将胚胎保持在尽可能小的培养基体积内。
4. 通过在 30 °C 下用含有 0.16 mg/ml 三卡因的 1% 低熔点琼脂糖（LMA，Lonza）移液胚胎，将其转移到琼脂糖中，并将其放在盖玻片底部培养皿的盖玻片上（MatTek Corp. Ashland MA USA）。随后，借助光滑的塑料尖端（例如切割的 Microloader 移液器吸头，Eppendorf）定位胚胎，当 LMA 聚合时，用 0.16 mg/ml 三卡因溶液覆盖琼脂糖。

注 1：在 60 °C 下熔化 1% LMA，并在 30 °C 下保持熔化的琼脂糖。

3. 光转换

1. 在配备 405 nm、488nm 和 561nm 激光源（如蔡司 LSM 710）的倒置共聚焦显微镜上，通过覆盖样品整个结构的 z 堆栈扫描对样品进行可视化，然后使用 488 nm 激光（即 30 mW Ar 激光器，强度为 5-7 %，检测器设置为 493-540 nm）和 561 nm 激光（即，10 mW DPSS 561 激光器，强度为 7-9%，检测器设置为 587-651）分别扫描组织/器官以查找光转化蛋白的绿色和红色荧光。

注 1：对于光转换前的扫描，我们使用了 Plan Apochromat 20x/NA 0.8 物镜。

注 2：实验前务必扫描红色荧光，以排除存在任何意外生成的红色转化 PCFP。

2. 选择 时间序列 工具并设置为 2 个无间隔的周期（一个用于光转换前，一个用于光转换后）。
3. 选择 Regions 工具并定义一个或多个用于照片转换的感兴趣区域 （ROI）。

注 1：我们建议首先确定 ROI 中扫描激光实际光转换的区域与软件中选择的 ROI 相匹配的精度，方法是测量光转化组织/细胞在所有三个（xy 和 z 方向）上的面积在固定标本中预计不会发生细胞或蛋白质运动。对于此应用程序中描述的设置，ROI 非常精确地匹配光转换区域，但这取决于所使用的物镜和用于光转换的激光量。ROI 的大小可以缩小到单个单元的大小，具体取决于物镜的数值孔径、变焦因子和用于光转换的激光量。

4. 选择 Bleaching （漂白） 工具，并设置为 Scan 1 of 2 （扫描 2 次） 后开始漂白。我们使用 30 mW 405 nm 二极管激光器进行光转换，并针对完全光转换所需的最小激光量进行了仔细优化，这主要是通过改变激光的强度、ROI 的扫描迭代和像素时间（即扫描速度）来实现的。

注 1：对于光转换，我们使用了 Plan Apochromat 20x/NA 0.8 物镜。

注 2：对于每个实验设置，必须根据经验确定激光器的功率和迭代次数，并且应确保在 ROI 内以最少的必要激光量完成从绿色到红色 PCFP 的光转换，以减少光毒性。我们建议使用低激光功率（例如 3%，相当于物镜计划中中的 0.03 mW）结合低迭代次数（例如 20 次）开始测试，然后增加激光功率直到实现完全光转换，在我们手中为 10% 的激光功率（相当于物镜计划中为 0.1 mW）。在这些条件下，所有测试的胚胎都在治疗计划中存活下来。然而，我们观察到卵黄膜对激光脉冲很敏感，很容易受损，导致胚胎死亡。因此，如果靶组织的位置靠近卵黄体，则可能导致光转化后的胚胎致死。

5. 使用 488 nm 和 561 nm 激光通过 z-Stack 扫描样品，以可视化 PCFP 的任何剩余绿色和光转换红色荧光。

注 1：对于光转换后的扫描，我们使用了 Plan Apochromat 20x/NA 0.8。

4. 从琼脂糖中取出胚胎

1. 丢弃溶液，并在针头或光滑的塑料尖端的帮助下小心地从 1% LMA 中取出胚胎。
2. 将胚胎在 28.5 °C 的黑暗中保存在鸡蛋水中，直到所需的发育阶段。

注 1：胚胎在卵水中继续发育很重要，尤其是在胚胎体伸展的发育初期。事实上，一些胚胎组织/器官在发育过程中会改变位置，因此在包埋过程中需要特定的方向，这取决于感兴趣的特定组织/器官和所需的分析发育阶段。

5. 重新嵌入

1. 按照本协议第 2 点进行。

6. 追踪胚胎后期的光转化组织

1. 使用 488 nm 和 561 nm 激光分别扫描绿色和红色荧光信号的感兴趣区域 （z-Stack）。

注 1：对于光转换后 x 小时的扫描，我们使用了 Plan Apochromat 20x/NA 0.8。

注 2：由于该方案不会影响胚胎的正常发育，因此可以在发育的后期观察光转化胚胎（为此，请按照第 4 - 6 点所述进行）。

7. 代表性结果

光转化测定的实例如图 1 所示。我们在斑马鱼发育过程中追踪了内皮细胞（有关发育中的斑马鱼血管解剖结构的回顾，请参见¹⁶）。因此，我们使用了在内皮核¹⁷ 内表达 KikGR 的斑马鱼 Tg（kdrl：nlsKikGR）^hsc7 报告基因系。纯合子和明亮表达的胚胎在 28.5 °C 下培养至受精后 48 小时 （hpf）。去绒毛膜后，胚胎被麻醉并嵌入 LMA 中，将胚胎的前后侧定位到盖玻片上，以便更好地观察头部血管。我们使用配备有在 405 nm、488 nm 和 561 nm 工作的激光器的倒置共聚焦显微镜（Zeiss LSM 710 Meta）和 Plan Apochromat 20x/NA 0.8 物镜进行光转化测定和进一步跟踪光转化蛋白。如图 1A 所示，在光转化之前，KikGR 在内皮组织中表达，并且只能使用 488 nm 氩激光检测为绿色荧光。使用 561 nm DPSS 561-10 激光进行红色荧光的对照扫描在光转化之前未检测到任何光转化的 KikGR（图 1A）。随后，使用 405 nm 二极管激光器（强度为 10%，20 次迭代）对 ROI 进行完全光转换，并使用 488 nm 和 561 nm 激光器再次扫描头血管（图 1B）。如图 1B 所示，绿色 KikGR 在 ROI 中已完全变为红色。光转化测定后，从琼脂糖中取出胚胎，并在 28.5 °C 下在鸡蛋水中培养。最后，在光转化后 24 小时再次观察胚胎，约为 72 hpf，以跟踪后期的光转化内皮细胞（图 1C）。因此，将胚胎嵌入 LMA 中，并使用 488 nm 和 561 nm 激光重新扫描样品。如图 1C 所示，在由光转化 ROI 产生的内皮组织中，由于红色荧光光转化 KikGR 的稳定性和新的绿色非光转化 KikGR 的重新合成，观察到非和光转化的 KikGR 蛋白。

图 1.斑马鱼发育过程中 KikGR 的光转化。（A，B） 在 Tg（kdrl：nlsKikGR）^hsc7 转基因胚胎中以 48 hpf 的光转化，以及 （C） 在光转化后 24 小时（约 72 hpf）再次观察。显示了 KikGR（绿色）、光转换的 KikGR（红色）和合并通道的荧光。虚线圆圈显示光转换前、转换后和后 24 小时的 ROI。图像是斑马鱼胚胎的背视图，位于底部前方。比例尺：50 μm。

<表 border="1"> 蛋白质（首字母缩略词） 防爆 （nm） Em （纳米） 电子商务 QY 四元结构 亮度 应用 裁判 Kaede_G 508 元 518 元 99 0,9% 四聚体 259 元 Cell 跟踪 ^2,6 Kaede_R 572 元 580 元 60 0,3 四聚体 59 元 KikGR_G 507 元 517 元 54 0,7% 四聚体 112 元 Cell 跟踪 ^3,6,8-10 KikGR_R 583 元 593 元 35 0,6 四聚体 68 mKikGR_G 505 元 515 元 49 0,7% 单体 101 元 动态跟踪超分辨率图像 ¹³ mKikGR_R 580 元 591 元 28 0,6 单体 53 元 EosFP_G 506 元 516 元 72 0,7% 四聚体 150 元 Cell 跟踪 ^5,20 EosFP_R 571 元 581 元 41 0,5% 四聚体 67 tdEos_G 506 元 516 元 34 0,7% 串联二聚体 165 元 超分辨率图像 ^12,14,21 tdEos_R 569 元 581 元 33 0,6 串联二聚体 59 元 mEos2_G 506 元 519 元 56 0,7% 单体 140 元 动态跟踪超分辨率图像 ^11,18 mEos2_R 573 元 584 元 46 0,7% 单体 90 Dendra2_G 490 507 元 45 0,5% 单体 67 动态跟踪超分辨率图像 ^4,11 Dendra2_R 553 元 573 元 35 0,55 单体 57 元

表 I. 光转化荧光蛋白的特性。 除了每种 PCFP 的通用名称和/或首字母缩略词外，表中还显示了峰值激发 （Ex） 和发射 （Em） 波长、摩尔消光系数 （EC， 10-3 M-1 cm-1 ）、量子产率 （QY）、生理相关的四元结构、相对亮度（以 EGFP 的百分比）、应用和参考文献。表格改编自 Day 和 Davidson，2010^{年 1}.

<表 border="1"> PCFP 系列 斑马鱼转基因系 源 Kaede Tg（elavl3：Kaede）^rw0130a 冈本实验室 Tg（EPV.TP1-Mmu.Hbb：枫）   Tg（ins：Kaede）   Tg（isl1：Gal4-VP16,14xUAS：Kaede）   Tg（lhx5：枫）^b1204/+ ZIRC 系列 Tg（myl7：枫）   Tg（olig2：枫）   Tg（UAS-E1b：Kaede）^s1999t ZIRC 系列 Tg（UAS：枫）^rk8 ZIRC 系列 Tg（vsx2：Kaede）^nns2 东岛实验室 KikGR 吨位（kdrl：nlsKikGR）   总量（krt4：NTR-KikGR）   Tg（myl7：nlsKikGR）   Tg（sox10：KikGR）   总吨位（UAS：KikGR）   EosFP 总谐波失真（sox10：EosFP）   tg（sox10：nlsEosFP）   Dendra Tg（-8mpx：Dendra2）   Tg（UAS：Dendra-kras）  

表 II.表达 PCFP 的斑马鱼转基因系。在斑马鱼模式生物数据库（ZFIN，http://zfin.org/）中获得的数据。标明了斑马鱼国际资源中心 （ZIRC， http://zebrafish.org/zirc/） 中品系的可用性。

讨论

近年来，已经产生了表达光转化蛋白（如Kaede或KikGR）的转基因动物模型。这些动物发育正常，表明这些蛋白质对胚胎发育没有毒性作用。关于动物胚胎中跟踪细胞的光转换测定的第一份报告是由 Hatta 和合作者通过将编码 Kaede 的 mRNA 或 DNA 注射到单细胞斑马鱼胚胎中进行普遍表达，或通过使用 Gal4-UAS 系统在神经组织中表达 Kaede 和 KikGR 进行的⁶。他们能够可视化细胞运动和神经形状的追踪，这证明了该工具在跟踪形态发生过程方面的通用性，例如后脑早期连合轴突的神经形成、平台形成和导航⁶。在鸡模型中，KikGR通过电穿孔引入神经管，并在神经嵴或神经管中进行光转换，并用于选择性地标记雏鸡胚胎8迁徙流中的神经嵴细胞亚^群。在小鼠中还比较了 Kaede 和 KikGR 的光转化，得出的结论是 KikGR 是最适合胚胎干细胞和小鼠细胞标记和谱系研究的光转化蛋白，因为它在发育中性、明亮并经历快速和完整的光转化⁹。最近，Griswold及其合作者产生了转基因小鼠品系iUBC-KikGR，该系在人泛素C启动子¹⁰的控制...

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
材料：
养鱼和收集鸡蛋的必要设备（详见斑马鱼书22）。
立体显微镜	Leica	Lecia MZ6 体视显微镜	配备在 488 nm 下工作的激光器
共聚焦激光扫描显微镜	Zeiss	Zeiss LSM 710 NLO	配备在 488 nm、561 nm 和 405 nm 下工作的激光器
加热块
一对 Dumont #5 镊子
盖玻片底培养皿	MatTek Corp		美国马萨诸塞州阿什兰
Microloader 移液器吸头	Eppendorf
涡旋
针
试剂：
蛋类水介质
60 μddH2O
E3 培养基中 g/ml 速溶海洋海盐
5 mM NaCl
0.17 mM KCl
0.33 mM CaCl2
0.33 mM MgSO4
0.00001% （w/v） 亚甲蓝
4 mg/ml 三卡因储备溶液
400 mg 三卡因（3-氨基苯甲酸乙酯）	Sigma-Aldrich
97.9 ml ddH2O
2.1 ml 1M Tris （pH9）
在 pH 7 下调节，分装并储存 -20 °C;C
1% LMA（低熔点琼脂糖，Lonza）
1g LMA/100 ml E3 培养基 1X
等分试样并储存在 4 °C;丙