本文介绍了一种在活体斑马鱼胚胎中对光转化荧光蛋白（PCFPs）进行光激活转换，并在发育过程中的特定时间点追踪已光转化蛋白的方法。该方法可用于监测活体脊椎动物个体发育过程中不同发育事件所涉及的细胞生物学过程。
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摘要
摘要
胚胎发生是一个动态过程，最适合通过能够记录活体发育变化的技术进行研究。in vivo 使用基因编码的荧光蛋白已被证明是阐明完整生物体中动态形态发生过程的有效策略。在过去十年中，光激活和光转换荧光蛋白的发展使得研究标记蛋白特定亚群的命运成为可能1。与光激活蛋白不同，光转换荧光蛋白（PCFPs）可在光转换前以其天然发射状态被直接追踪和成像，从而更易于通过光学观察识别和选择目标区域。PCFPs（如 Kaede2、KikGR3、Dendra4 和 EosFP5）在紫外光或蓝光照射下可由绿色转变为红色，这是由于其含有 His-Tyr-Gly 三肽序列，可形成绿色发色团，并通过光催化β-消除反应及随后π共轭体系的延伸，转化为红色发色团3。PCFPs 及其单体变体分别是追踪细胞6-10 和研究蛋白质动态行为11-14 的有用工具。近年来，PCFPs 已在多种动物模型中表达，例如斑马鱼6、鸡7,8 和小鼠9,10，用于细胞命运追踪。本文报道了一种在活体斑马鱼胚胎中对 PCFPs 进行细胞特异性光转换，并在后续发育阶段追踪光转换后蛋白的实验方案。该方法可在组织特异性水平上研究斑马鱼模型中形态发生所依赖的细胞生物学事件。
方案
1. 获取用于光转化实验的胚胎
将表达PCFP的转基因斑马鱼进行同系交配后，选择荧光最强的纯合子胚胎，并在28.5 °C下培养至所需的胚胎发育阶段15。
注意 1：此预选将允许使用低激光功率扫描胚胎，从而避免光毒性和光漂白。
注意 2：由于光转换荧光蛋白（PCFPs）（如 Kaede 和 KikGR）对包括日光在内的光照高度敏感，建议在观察胚胎时使用低强度光源，并将胚胎保持在避光条件下。
2. 包埋
- 在装有卵水的玻璃容器中，使用镊子在体视显微镜下对胚胎进行去壳处理。
- 将已去壳的胚胎转移至 0.16 mg/ml 三卡因（3-氨基苯甲酸乙酯，Sigma-Aldrich）溶液（将 40μl 的 4 mg/ml 储备液加入 1 ml 的 1X E3 培养基中）中，以麻醉胚胎。
注意 1：使用玻璃移液管或剪去尖端的移液器吸头（P1000）转移胚胎，以尽量降低损伤胚胎的风险。
注意 2：去壳的幼期胚胎不应暴露于空气中，或被提升至水/空气界面，因为卵在受到机械应力时极易破裂。
- 将麻醉后的胚胎转移至培养皿盖上，并保持胚胎处于尽可能小体积的培养基中。
- 用含有0.16 mg/ml Tricaine、温度为30 °C的1%低熔点琼脂糖（LMA, Lonza）溶液吸取胚胎，将其转移至琼脂糖中，并置于底部为盖玻片的培养皿盖玻片上（MatTek Corp. Ashland MA USA）。随后借助光滑的塑料吸头（例如剪去尖端的Microloader Pipette Tip, Eppendorf）调整胚胎方向，待低熔点琼脂糖凝固后，用0.16 mg/ml Tricaine溶液覆盖琼脂糖。
注意 1：在 60 °C 下熔化 1% LMA，并将熔化的琼脂糖保持在 30 °C。
3. 光转化
- 在配备405 nm、488 nm和561 nm激光源的倒置共聚焦显微镜（如Zeiss LSM 710）上，使用488 nm激光对样品进行z轴层扫成像，覆盖待光转化并后续追踪的样本完整结构即，30 mW 氩离子激光器，强度5-7%，检测器设置为493-540 nm）和561 nm激光器（即，使用10 mW DPSS 561激光器（强度设为7-9%），检测器设置为587-651，分别扫描组织/器官中光转换蛋白的绿色和红色荧光。
注意 1：在光转化前的扫描中，我们使用了 Plan Apochromat 20x/NA 0.8 物镜。
注意 2：实验前务必扫描红色荧光，以排除是否存在意外生成的红色转化PCFP。
- 选择时间序列工具，并设置为2个周期，无间隔（一个用于光转化前，一个用于光转化后）。
- 选择区域工具，并定义一个或多个用于光转化的兴趣区域（ROI）。
注意 1：我们建议首先通过测量固定样本中 ROI 内实际被扫描激光光转化的组织/细胞区域（在预期无细胞或蛋白质移动的情况下，测量 xy 和 z 三个方向）来确定光转化区域与软件中选定 ROI 的匹配精度。在本应用所述的设置下，ROI 与光转化区域具有很高的匹配精度，但该精度取决于所用物镜及光转化过程中施加的激光量。根据物镜的数值孔径、缩放倍数以及用于光转化的激光量，ROI 的大小可缩小至单个细胞的尺寸。
- 选择漂白工具，并设置在第2次扫描中的第1次扫描后开始漂白。我们使用30 mW的405 nm半导体激光器进行光转化，并仔细优化实现完全光转化所需的最低激光强度，主要通过调整激光强度、ROI的扫描次数和像素驻留时间（即，扫描速度）来实现。
注意 1：光转换实验中我们使用了 Plan Apochromat 20x/NA 0.8 物镜。
注意2：激光功率和迭代次数需针对每个实验条件通过实验确定，应确保在ROI内实现绿色至红色PCFP的完全光转化，同时使用尽可能少的激光照射以降低光毒性。我们建议从低激光功率开始进行测试例如 3%，对应物镜平面中的0.03 mW）结合较低的迭代次数（例如 20），随后逐渐增加激光功率，直至完成完全的光转化，据我们实验结果，此过程在10%激光功率下（相当于物镜平面0.1 mW）即可实现。在这些条件下，所有受试胚胎均能存活于处理方案。然而，我们观察到卵黄膜对激光脉冲较为敏感，容易受损，从而导致胚胎死亡。因此，若目标组织位置靠近卵黄体，则光转化后可能导致胚胎致死。
- 使用488 nm和561 nm激光，通过z轴扫描对样品进行成像，以观察残留的绿色荧光以及PCFP光转化后的红色荧光。
注意 1：光转化后的扫描使用了 Plan Apochromat 20x/NA 0.8 物镜。
4. 从琼脂糖中取出胚胎
- 弃去溶液，借助针头或光滑的塑料吸头小心地将胚胎从1% LMA中取出。
- 将胚胎置于避光的养鱼水中，在28.5 °C条件下培养至所需发育阶段。
注意1：胚胎在卵水中持续发育非常重要，尤其是在胚胎体伸长发育的最初几天。实际上，某些胚胎组织/器官在发育过程中会发生位置变化，因此包埋时需要特定的方向，这取决于所关注的特定组织/器官以及目标分析的发育阶段。
5. 重新包埋
- 按照本方案中第 2.) 步的操作进行。
6. 后续胚胎阶段中光转化组织的追踪
- 使用488 nm和561 nm激光分别对绿色和红色荧光信号进行感兴趣区域的扫描（z-Stack）。
注意 1：对于光转化后 x 小时的扫描，我们使用了 Plan Apochromat 20x/NA 0.8 物镜。
注意 2：由于本方案不影响胚胎的正常发育，因此可以在发育的后期阶段观察光转化后的胚胎（为此，请按照第 4 - 6 步所述步骤进行操作）。
7. 代表性结果
光转换实验的一个示例如下所示 图1我们追踪了斑马鱼发育过程中的内皮细胞（有关发育中斑马鱼血管解剖结构的综述，请参见16). 因此，我们使用了斑马鱼 Tg(kdrl:nlsKikGR)hsc7 表达KikGR的内皮细胞核报告基因小鼠品系17. 将纯合且高表达的胚胎在 28.5 °C 直至受精后48小时（hpf）。去壳后，将胚胎麻醉并包埋于低熔点琼脂糖（LMA）中，使胚胎的头侧背侧朝向盖玻片，以便更清晰地观察头部血管。我们使用配备405 nm、488 nm和561 nm激光器的倒置共聚焦显微镜（Zeiss LSM 710 Meta）以及Plan Apochromat 20x/NA 0.8物镜进行光转化实验及后续对光转化蛋白的追踪观察。如图所示 图1A，光转化前，KikGR 在内皮组织中表达，仅能通过 488 nm 氩激光检测到绿色荧光。使用 561 nm DPSS 561-10 激光进行红色荧光的对照扫描，在光转化前未检测到任何光转化的 KikGR图1A随后，使用405 nm激光二极管（强度10%，20次迭代）对ROI进行完全光转化，并再次利用488 nm和561 nm激光扫描头部血管。图1B）。如图所示 图1B，ROI 内的绿色 KikGR 已完全转化为红色。光转化实验后，将胚胎从琼脂糖中取出并继续培养于 28.5 °C 在卵水中。最后，在光转化后24小时（约72 hpf）再次观察胚胎，以追踪光转化后的内皮细胞在后续阶段的动态变化（图1C）。因此，将胚胎包埋于LMA中，并使用488 nm和561 nm激光对样品重新扫描。如图所示 图1C在由光转化ROI产生的内皮组织中，由于光转化后的红色荧光KikGR蛋白具有稳定性，同时又有新的绿色非光转化KikGR蛋白重新合成，因此可同时观察到非光转化与光转化的KikGR蛋白。
图 1. 斑马鱼发育过程中 KikGR 的光转化。 (A, B) 在 Tg(kdrl:nlsKikGR)hsc7 转基因胚胎中，于 48 小时（hpf）对头部内皮血管的特定区域进行光转化，并在光转化后 24 小时（约 72 hpf）再次观察 (C)。图中显示了 KikGR 的荧光（绿色）、光转化后的 KikGR（红色）以及通道合并图像。虚线圆圈分别标示了光转化前、光转化后以及光转化 24 小时后的感兴趣区域（ROI）。图像为斑马鱼胚胎的背侧视图，下方为头部。比例尺：50 μm。
| 蛋白（缩写） | 激发波长 (nm) | 发射波长 (nm) | 消光系数 (EC) | 量子产率 (QY) | 四级结构 | 亮度 | 应用 | 参考文献 |
| Kaede_G | 508 | 518 | 99 | 0.9 | tetramer | 259 | 细胞示踪 | 2,6 |
| Kaede_R | 572 | 580 | 60 | 0.3 | tetramer | 59 | ||
| KikGR_G | 507 | 517 | 54 | 0.7 | tetramer | 112 | 细胞示踪 | 3,6,8-10 |
| KikGR_R | 583 | 593 | 35 | 0.6 | tetramer | 68 | ||
| mKikGR_G | 505 | 515 | 49 | 0.7 | monomer | 101 | 动态示踪 超分辨成像 | 13 |
| mKikGR_R | 580 | 591 | 28 | 0.6 | monomer | 53 | ||
| EosFP_G | 506 | 516 | 72 | 0.7 | tetramer | 150 | 细胞示踪 | 5,20 |
| EosFP_R | 571 | 581 | 41 | 0.5 | tetramer | 67 | ||
| tdEos_G | 506 | 516 | 34 | 0.7 | tandem dimer | 165 | 超分辨成像 | 12,14,21 |
| tdEos_R | 569 | 581 | 33 | 0.6 | tandem dimer | 59 | ||
| mEos2_G | 506 | 519 | 56 | 0.7 | monomer | 140 | 动态示踪 超分辨成像 | 11,18 |
| mEos2_R | 573 | 584 | 46 | 0.7 | monomer | 90 | ||
| Dendra2_G | 490 | 507 | 45 | 0.5 | monomer | 67 | 动态示踪 超分辨成像 | 4,11 |
| Dendra2_R | 553 | 573 | 35 | 0.55 | monomer | 57 |
表 I. 光转换荧光蛋白的性质。 表中列出了每种光转换荧光蛋白（PCFP）的常用名称和/或缩写、最大激发波长（Ex）、最大发射波长（Em）、摩尔消光系数（EC，10⁻³ M⁻¹ cm⁻¹）、量子产率（QY）、生理相关四级结构、相对亮度（以EGFP亮度的百分比表示）、应用领域及参考文献。本表改编自 Day 和 Davidson，20101。
| PCFP | 斑马鱼转基因品系 | 来源 |
| Kaede | Tg(elavl3:Kaede)rw0130a | Okamoto 实验室 |
| Tg(EPV.TP1-Mmu.Hbb:Kaede) | ||
| Tg(ins:Kaede) | ||
| Tg(isl1:Gal4-VP16,14xUAS:Kaede) | ||
| Tg(lhx5:Kaede)b1204/+ | ZIRC | |
| Tg(myl7:kaede) | ||
| Tg(olig2:Kaede) | ||
| Tg(UAS-E1b:Kaede)s1999t | ZIRC | |
| Tg(UAS:Kaede)rk8 | ZIRC | |
| Tg(vsx2:Kaede)nns2 | Higashijima 实验室 | |
| KikGR | Tg(kdrl:nlsKikGR) | |
| Tg(krt4:NTR-KikGR) | ||
| Tg(myl7:nlsKikGR) | ||
| Tg(sox10:KikGR) | ||
| Tg(UAS:KikGR) | ||
| EosFP | Tg(sox10:EosFP) | |
| Tg(sox10:nlsEosFP) | ||
| Dendra | Tg(-8mpx:Dendra2) | |
| Tg(UAS:Dendra-kras) |
表 II. 表达 PCFP 的转基因斑马鱼品系。数据来源于斑马鱼模式生物数据库（ZFIN，http://zfin.org/）。斑马鱼国际资源中心（ZIRC，http://zebrafish.org/zirc/）中品系的可获取情况已作标注。
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讨论
近年来，已成功构建出表达光转化蛋白（如 Kaede 或 KikGR）的转基因动物模型。这些动物发育正常，表明这些蛋白对胚胎发育无毒性作用。首次关于利用光转化实验追踪动物胚胎中细胞的研究由 Hatta 及其合作者完成，他们将编码 Kaede 的 mRNA 或 DNA 注射到单细胞期斑马鱼胚胎中以实现广泛表达，或利用 Gal4-UAS 系统在神经组织中表达 Kaede 和 KikGR6。该研究成功实现了细胞运动的可视化以及神经形态的追踪，证明了该工具在研究神经管形成、感觉板发育以及早期联合轴突在后脑中的导航等形态发生过程中的广泛应用价值6。在鸡胚模型中，通过电穿孔将 KikGR 导入神经管，并在神经嵴或神经管中进行光转化，用于选择性地标记鸡胚迁移流中神经嵴细胞的亚群8。在小鼠中也对 Kaede 和 KikGR 的光转化性能进行了比较，结果表明 KikGR 是最适合用于胚胎干细胞和小鼠细胞标记及谱系研究的光转化蛋白，因其在发育过程中呈中性、荧光亮度高，并能快速且完全地完成光转化9。最近，Griswold 及其合作者构建了转基因小鼠品系 iUBC-KikGR...
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披露
未声明任何利益冲突。
致谢
我们感谢加拿大安大略省多伦多市病童医院的 Ian C. Scott 博士慷慨提供转基因斑马鱼品系 Tg(kdrl:nlsKikGR)hsc7。我们感谢马克斯·德尔布吕克分子医学中心共聚焦与双光子显微镜核心设施及 Zoltan Cseresnyes 博士在技术操作和整体成像方面提供的出色支持。S.A.-S. 获得德国研究基金会（DFG）海森堡学者奖学金资助。本研究获得德国研究基金会（DFG）项目基金 SE2016/7-1 支持。
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 材料： | |||
| 饲养鱼类和收集鱼卵所需的设备（详见《斑马鱼手册》22）。 | |||
| 体视显微镜 | Leica | Leica MZ6 体视显微镜 | 配备 488 nm 激光器 |
| 共聚焦激光扫描显微镜 | Zeiss | Zeiss LSM 710 NLO | 配备 488 nm、561 nm 和 405 nm 激光器 |
| 加热块 | |||
| Dumont #5 镊子 | |||
| 玻璃底培养皿 | MatTek Corp | Ashland MA USA | |
| 微量移液器加样头（Microloader） | Eppendorf | ||
| 涡旋振荡器 | |||
| 针头 | |||
| 试剂： | |||
| 鱼卵水培养基 | |||
| 60 μg/ml Instant Ocean 海盐溶于 ddH2O | |||
| E3 培养基 | |||
| 5 mM NaCl | |||
| 0.17 mM KCl | |||
| 0.33 mM CaCl2 | |||
| 0.33 mM MgSO4 | |||
| 0.00001% (w/v) 亚甲蓝 | |||
| 4 mg/ml 三卡因储备液 | |||
| 400 mg 三卡因（3-氨基苯甲酸乙酯） | Sigma-Aldrich | ||
| 97.9 ml ddH2O | |||
| 2.1 ml 1M Tris (pH9) | |||
| 调节 pH 至 7，分装后于 -20 °C 保存 | |||
| 1% LMA（低熔点琼脂糖，Lonza） | |||
| 1 g LMA / 100 ml 1× E3 培养基 | |||
| 分装后于 4 °C 保存 |
参考文献
- Day, R. N., Davidson, M. W. The fluorescent protein palette: tools for cellular imaging. Chem. Soc. Rev. 38, 2887-2921 (2009).
- Ando, R., Hama, H., Yamamoto-Hino, M., Mizuno, H., Miyawaki, A. An optical marker based on the UV-induced green-to-red photoconversion of a fluorescent protein. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 99, 12651-12656 (2002).
- Tsutsui, H., Karasawa, S., Shimizu, H., Nukina, N., Miyawaki, A. Semi-rational engineering of a coral fluorescent protein into an efficient highlighter. EMBO Rep. 6, 233-238 (2005).
- Gurskaya, N. G., Verkhusha, V. V., Shcheglov, A. S., Staroverov, D. B., Chepurnykh, T. V., Fradkov, A. F., Lukyanov, S., Lukyanov, K. A. Engineering of a monomeric green-to-red photoactivatable fluorescent protein induced by blue light. Nat. Biotechnol. 24, 461-465 (2006).
- Wiedenmann, J., Ivanchenko, S., Oswald, F., Schmitt, F., Rocker, C., Salih, A., Spindler, K. D., Nienhaus, G. U. EosFP, a fluorescent marker protein with UV-inducible green-to-red fluorescence conversion. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 101, 15905-15910 (2004).
- Hatta, K., Tsujii, H., Omura, T. Cell tracking using a photoconvertible fluorescent protein. Nat. Protoc. 1, 960-967 (2006).
- Stark, D. A., Kulesa, P. M. An in vivo comparison of photoactivatable fluorescent proteins in an avian embryo model. Dev. Dyn. 236, 1583-1594 (2007).
- Kulesa, P. M., Teddy, J. M., Stark, D. A., Smith, S. E., McLennan, R. Neural crest invasion is a spatially-ordered progression into the head with higher cell proliferation at the migratory front as revealed by the photoactivatable protein, KikGR. Dev. Biol. 316, 275-287 (2008).
- Nowotschin, S., Hadjantonakis, A. K. Use of KikGR a photoconvertible green-to-red fluorescent protein for cell labeling and lineage analysis in ES cells and mouse embryos. BMC Dev. Biol. 9, 49(2009).
- Griswold, S. L., Sajja, K. C., Jang, C. W., Behringer, R. R. Generation and characterization of iUBC-KikGR photoconvertible transgenic mice for live time-lapse imaging during development. Genesis. 49, 591-598 (2011).
- Baker, S. M., Buckheit, R. W. 3rd, Falk, M. M. Green-to-red photoconvertible fluorescent proteins: tracking cell and protein dynamics on standard wide-field mercury arc-based microscopes. BMC Cell Biol. 11, 15(2010).
- Watanabe, S., Punge, A., Hollopeter, G., Willig, K. I., Hobson, R. J., Davis, M. W., Hell, S. W., Jorgensen, E. M. Protein localization in electron micrographs using fluorescence nanoscopy. Nat. Methods. 8, 80-84 (2011).
- Habuchi, S., Tsutsui, H., Kochaniak, A. B., Miyawaki, A., van Oijen, A. M. mKikGR, a monomeric photoswitchable fluorescent protein. PLoS One. 3, e3944(2008).
- Fang, Z., Takizawa, N., Wilson, K. A., Smith, T. C., Delprato, A., Davidson, M. W., Lambright, D. G., Luna, E. J. The membrane-associated protein, supervillin, accelerates F-actin-dependent rapid integrin recycling and cell motility. Traffic. 11, 782-799 (2010).
- Kimmel, C. B., Ballard, W. W., Kimmel, S. R., Ullmann, B., Schilling, T. F. Stages of embryonic development of the zebrafish. Dev. Dyn. 203, 253-310 (1995).
- Isogai, S., Horiguchi, M., Weinstein, B. M. The vascular anatomy of the developing zebrafish: an atlas of embryonic and early larval development. Dev. Biol. 230, 278-301 (2001).
- Lazic, S., Scott, I. C. Mef2cb regulates late myocardial cell addition from a second heart field-like population of progenitors in zebrafish. Dev. Biol. 354, 123-133 (2011).
- McKinney, S. A., Murphy, C. S., Hazelwood, K. L., Davidson, M. W., Looger, L. L. A bright and photostable photoconvertible fluorescent protein. Nat. Methods. 6, 131-133 (2009).
- Godinho, L. Live imaging of zebrafish development. Cold Spring Harb Protoc. 2011, 770-777 (2011).
- Curran, K., Lister, J. A., Kunkel, G. R., Prendergast, A., Parichy, D. M., Raible, D. W. Interplay between Foxd3 and Mitf regulates cell fate plasticity in the zebrafish neural crest. Dev. Biol. 344, 107-118 (2010).
- Nienhaus, G. U., Nienhaus, K., Holzle, A., Ivanchenko, S., Renzi, F., Oswald, F., Wolff, M., Schmitt, F., Rocker, C., Vallone, B., Weidemann, W., Heilker, R., Nar, H., Wiedenmann, J. Photoconvertible fluorescent protein EosFP: biophysical properties and cell biology applications. Photochem. Photobiol. 82, 351-358 (2006).
- Westerfield, M. The zebrafish book. A guide for the laboratory use of zebrafish (Danio rerio). , 4th ed, Univ. of Oregon Press. Eugene. (2000).
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