本文介绍了一种在活体斑马鱼胚胎中对光转化荧光蛋白（PCFPs）进行光激活转换，并在发育过程中的特定时间点追踪已光转化蛋白的方法。该方法可用于监测活体脊椎动物个体发育过程中不同发育事件所涉及的细胞生物学过程。
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本文内容
摘要
摘要
胚胎发生是一个动态过程，最适合通过能够记录活体发育变化的技术进行研究。in vivo 使用基因编码的荧光蛋白已被证明是阐明完整生物体中动态形态发生过程的有效策略。在过去十年中，光激活和光转换荧光蛋白的发展使得研究标记蛋白特定亚群的命运成为可能1。与光激活蛋白不同，光转换荧光蛋白（PCFPs）可在光转换前以其天然发射状态被直接追踪和成像，从而更易于通过光学观察识别和选择目标区域。PCFPs（如 Kaede2、KikGR3、Dendra4 和 EosFP5）在紫外光或蓝光照射下可由绿色转变为红色，这是由于其含有 His-Tyr-Gly 三肽序列，可形成绿色发色团，并通过光催化β-消除反应及随后π共轭体系的延伸，转化为红色发色团3。PCFPs 及其单体变体分别是追踪细胞6-10 和研究蛋白质动态行为11-14 的有用工具。近年来，PCFPs 已在多种动物模型中表达，例如斑马鱼6、鸡7,8 和小鼠9,10，用于细胞命运追踪。本文报道了一种在活体斑马鱼胚胎中对 PCFPs 进行细胞特异性光转换，并在后续发育阶段追踪光转换后蛋白的实验方案。该方法可在组织特异性水平上研究斑马鱼模型中形态发生所依赖的细胞生物学事件。
方案
1. 获取用于光转化实验的胚胎
将表达PCFP的转基因斑马鱼进行同系交配后，选择荧光最强的纯合子胚胎，并在28.5 °C下培养至所需的胚胎发育阶段15。
注意 1：此预选将允许使用低激光功率扫描胚胎，从而避免光毒性和光漂白。
注意 2：由于光转换荧光蛋白（PCFPs）（如 Kaede 和 KikGR）对包括日光在内的光照高度敏感，建议在观察胚胎时使用低强度光源，并将胚胎保持在避光条件下。
2. 包埋
- 在装有卵水的玻璃容器中，使用镊子在体视显微镜下对胚胎进行去壳处理。
- 将已去壳的胚胎转移至 0.16 mg/ml 三卡因（3-氨基苯甲酸乙酯，Sigma-Aldrich）溶液（将 40μl 的 4 mg/ml 储备液加入 1 ml 的 1X E3 培养基中）中，以麻醉胚胎。
注意 1：使用玻璃移液管或剪去尖端的移液器吸头（P1000）转移胚胎，以尽量降低损伤胚胎的风险。
注意 2：去壳的幼期胚胎不应暴露于空气中，或被提升至水/空气界面，因为卵在受到机械应力时极易破裂。
- 将麻醉后的胚胎转....
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讨论
近年来，已成功构建出表达光转化蛋白（如 Kaede 或 KikGR）的转基因动物模型。这些动物发育正常，表明这些蛋白对胚胎发育无毒性作用。首次关于利用光转化实验追踪动物胚胎中细胞的研究由 Hatta 及其合作者完成，他们将编码 Kaede 的 mRNA 或 DNA 注射到单细胞期斑马鱼胚胎中以实现广泛表达，或利用 Gal4-UAS 系统在神经组织中表达 Kaede 和 KikGR6。该研究成功实现了细胞运动的可视化以及神经形态的追踪，证明了该工具在研究神经管形成、感觉板发育以及早期联合轴突在后脑中的导航等形态发生过程中的广泛应用价值6。在鸡胚模型中，通过电穿孔将 KikGR 导入神经管，并在神经嵴或神经管中进行光转化，用于选择性地标记鸡胚迁移流中神经嵴细胞的亚群8。在小鼠中也对 Kaede 和 KikGR 的光转化性能进行了比较，结果表明 KikGR 是最适合用于胚胎干细胞和小鼠细胞标记及谱系研究的光转化蛋白，因其在发育过程中呈中性、荧光亮度高，并能快速且完全地完成光转化9。最近，Griswold 及其合作者构建了转基因小鼠品系 iUBC-KikGR.......
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披露
未声明任何利益冲突。
致谢
我们感谢加拿大安大略省多伦多市病童医院的 Ian C. Scott 博士慷慨提供转基因斑马鱼品系 Tg(kdrl:nlsKikGR)hsc7。我们感谢马克斯·德尔布吕克分子医学中心共聚焦与双光子显微镜核心设施及 Zoltan Cseresnyes 博士在技术操作和整体成像方面提供的出色支持。S.A.-S. 获得德国研究基金会（DFG）海森堡学者奖学金资助。本研究获得德国研究基金会（DFG）项目基金 SE2016/7-1 支持。
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 材料： | |||
| 饲养鱼类和收集鱼卵所需的设备（详见《斑马鱼手册》22）。 | |||
| 体视显微镜 | Leica | Leica MZ6 体视显微镜 | 配备 488 nm 激光器 |
| 共聚焦激光扫描显微镜 | Zeiss | Zeiss LSM 710 NLO | 配备 488 nm、561 nm 和 405 nm 激光器 |
| 加热块 | |||
| Dumont #5 镊子 | |||
| 玻璃底培养皿 | MatTek Corp | Ashland MA USA | |
| 微量移液器加样头（Microloader） | Eppendorf | ||
| 涡旋振荡器 | |||
| 针头 | |||
| 试剂： | |||
| 鱼卵水培养基 | |||
| 60 μg/ml Instant Ocean 海盐溶于 ddH2O | |||
| E3 培养基 | |||
| 5 mM NaCl | |||
| 0.17 mM KCl | |||
| 0.33 mM CaCl2 | |||
| 0.33 mM MgSO4 | |||
| 0.00001% (w/v) 亚甲蓝 | |||
| 4 mg/ml 三卡因储备液 | |||
| 400 mg 三卡因（3-氨基苯甲酸乙酯） | Sigma-Aldrich | ||
| 97.9 ml ddH2O | |||
| 2.1 ml 1M Tris (pH9) | |||
| 调节 pH 至 7，分装后于 -20 °C 保存 | |||
| 1% LMA（低熔点琼脂糖，Lonza） | |||
| 1 g LMA / 100 ml 1× E3 培养基 | |||
| 分装后于 4 °C 保存 |
参考文献
- Day, R. N., Davidson, M. W. The fluorescent protein palette: tools for cellular imaging. Chem. Soc. Rev. 38, 2887-2921 (2009).
- Ando, R., Hama, H., Yamamoto-Hino, M., Mizuno, H., Miyawaki, A. An optical marker based on the UV-induced green-to....
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