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方法文章

病毒纳米颗粒用于 在体 肿瘤成像

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DOI：

10.3791/4352

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2012年11月16日

 ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Biomedical Engineering, Case Western Reserve University , 2Department of Biomedical Engineering, Radiology, and Materials Science and Engineering, Case Western Reserve University

本文内容

摘要

植物病毒纳米颗粒（VNPs）是生物医学应用中有前景的平台。本文介绍了植物VNPs的增殖、纯化、表征及生物偶联的操作步骤。最后，我们展示了利用小鼠异种移植模型和荧光成像技术，将VNPs应用于肿瘤靶向与成像的研究。

摘要

纳米材料的应用有望彻底改变材料科学和医学领域。目前，多种不同的纳米颗粒正在被研究用于成像和治疗方面的应用。来源于植物的病毒纳米颗粒（VNPs）可被视为具有明确尺寸和形状的自组装生物纳米材料。Steinmetz 实验室正在研究的植物病毒包括由Cowpea mosaic virus（CPMV）和Brome mosaic virus（BMV）形成的二十面体颗粒，这两种颗粒的直径均为30 nm。我们还在开发来源于以下植物病毒的棒状和丝状结构：Tobacco mosaic virus（TMV）形成尺寸为300 nm × 18 nm的刚性棒状颗粒，而Potato virus X（PVX）则形成长度为515 nm、宽度为13 nm的丝状颗粒（有关VNPs的更多信息，请参见参考文献1和2）。

从材料科学家的角度来看，病毒纳米颗粒（VNPs）因其多种特性而成为极具吸引力的构建单元：这些颗粒具有单一分散性，且能够轻松实现大规模生产。 在植株中，具有极高的稳定性且生物相容性良好。此外，病毒纳米颗粒（VNPs）是可“编程”的单元，可通过基因改造或化学生物偶联方法进行特异性设计。 3VNPs 的结构已解析至原子分辨率，可在原子水平上进行空间精确定位的修饰。4，这种控制水平是目前最先进的技术所使用的合成纳米材料无法实现的。

本文中，我们描述了CPMV、PVX、TMV和BMV的增殖方法 Vigna unguiculata 和 Nicotiana benthamiana 植物。提供了每种病毒纳米颗粒（VNP）的提取和纯化方案。描述了对纯化后及化学标记的VNP进行表征的方法。本研究重点介绍使用荧光染料对VNP进行化学标记例如 Alexa Fluor 647）和聚乙二醇（PEG）。这些染料有助于追踪和检测VNPs 5-10，且聚乙二醇可降低蛋白质纳米颗粒的免疫原性，同时改善其药代动力学特性 8,11我们利用小鼠异种移植瘤模型展示了聚乙二醇化病毒纳米颗粒（PEGylated VNPs）的肿瘤靶向能力。通过组织荧光成像相结合的方法 离体 使用Maestro成像系统、匀浆组织中的荧光定量以及共聚焦显微镜来研究生物分布。病毒纳米颗粒（VNPs）通过网状内皮系统（RES）被清除；通过增强的通透性和滞留效应（EPR）实现肿瘤靶向。12VNP 纳米技术是一种强大的即插即用型技术，可用于成像和治疗疾病病灶 体内我们正在进一步开发病毒样颗粒（VNPs），以携带药物载荷和具有临床相关性的成像基团，以及组织特异性配体，用于靶向癌症和心血管疾病中过表达的分子受体。

方案

1. VNP（CPMV、BMV、PVX 和 TMV）的扩增

  1. 将室内植物培养室的控制参数设置为每日15小时光照期（100%光照，25 °C，65%湿度）和9小时黑暗期（0%光照，22 °C，60%湿度）。
  2. 根据表1中的时间线对植物进行接种。
CPMVPVX、TMV 和 BMV
第0天：每盆种植3粒豇豆种子。第0天：每盆播种约30粒弯叶烟（N. benthamiana）种子。每周施肥一次，每5升水加入1汤匙肥料。
第14天：将弯叶烟移栽至每盆1株。
第10天：通过机械接种法，使用少量碳化硅对豇豆的初生叶片接种CPMV（5 μg/50 μl/叶片）。第28天：通过机械接种法，使用少量碳化硅对3至5片叶片分别接种PVX、TMV或BMV（5 μg/50 μl/叶片）。
第20天：收获叶片并储存于-80 °C。第42天：收获叶片并储存于-80 °C。

表1. 叶片培养、接种和收获的时间线。

注意：此处仅以 CPMV 的扩增作为示例进行说明。

2. VNP（CPMV、BMV、PVX 和 TMV）纯化

注意：所有步骤均在冰上或 4 °C 下进行。

  1. 使用标准搅拌机将100 g冷冻叶片与2倍体积的冷缓冲液（见表2）进行匀浆。用2-3层纱布过滤。
  2. 对于PVX，使用1 M HCl将pH值调节至6.5。加入0.2%（w/v）抗坏血酸和0.2%（w/v）亚硫酸钠。
  3. 将粗制植物匀浆在5,500 × g下离心20分钟。收集上清液。
  4. 对于BMV，将25 ml上清液铺在5 ml 10%（w/v）蔗糖溶液上。在9,000 × g下离心3小时，将沉淀重悬于38.5%（w/v）CsCl溶液中。振荡混合5小时，然后继续进行步骤2.12。
  5. 通过加入0.7倍体积的1:1（v/v）氯仿:1-丁醇萃取植物材料。搅拌混合物30-60分钟。
  6. 将溶液在5,500 × g下离心20分钟。收集上层水相。
  7. 加入NaCl至终浓度0.2 M，并加入8%（w/v）PEG（分子量8,000）。对于TMV，还需加入1%（v/v）Triton X-100。搅拌至少1小时，然后静置至少1小时。
  8. 将溶液在15,000 × g下离心15分钟。将沉淀重悬于10 ml缓冲液中。对于PVX，加入0.1% β-巯基乙醇，并加入尿素至0.5 M。
  9. 在8,000 × g下离心30分钟，收集上清液。
  10. 将上清液在160,000 × g下超速离心3小时。将沉淀在5 ml缓冲液中重悬，过夜。
  11. 用缓冲液配制等体积的10%、20%、30%和40%蔗糖溶液（从最重开始）形成10-40%蔗糖梯度。室温下静置过夜使梯度平衡。
  12. 将重悬后的沉淀在蔗糖梯度上于100,000 × g下超速离心2小时（BMV为24小时）。
  13. 收集光散射条带，并在缓冲液中透析。
  14. 对VNPs进行表征（见下文），并在4 °C保存。如需长期保存，应置于-80 °C。
CPMV 和 TMV0.1 M 磷酸钾缓冲液 (pH 7.0)
38.5 mM KH2PO4
61.5 mM K2HPO4
PVX0.5 M 硼酸缓冲液 (pH 7.8)
0.5 M 硼酸
用 NaOH 调节 pH
BMVSAMA 缓冲液 (pH 4.5)
250 mM 醋酸钠
10 mM MgCl2
2 mM β-巯基乙醇（新鲜添加）

表2. 每种VNP的缓冲液及其配方。

注意：此处仅以 CPMV 的扩增为例进行演示。

3. VNP（CPMV、BMV、PVX 和 TMV）表征

  1. 采用紫外/可见光谱法测定病毒纳米颗粒（VNPs）的浓度。
    1. 使用 NanoDrop 分光光度计测量 2 μl 样品的吸光度。
    2. 利用比尔-朗伯定律（A=εcl，其中 A 为吸光度，ε 为消光系数，c 为浓度，l 为光程）确定颗粒和染料的浓度。NanoDrop 的光程为 0.1 cm。
      病毒纳米颗粒特异性的消光系数如下：
      CPMV： 8.1 cm-1mg-1ml（在 260 nm 处）
      PVX： 2.97 cm-1mg-1ml（在 260 nm 处）
      TMV： 3.0 cm-1mg-1ml（在 260 nm 处）
      BMV： 5.15 cm-1mg-1ml（在 260 nm 处）
  2. 通过尺寸排阻快速蛋白液相色谱（FPLC）分析颗粒。
    1. 使用 Superose 6 尺寸排阻柱和 ÄKTA Explorer 系统，将 50–100 μg 的 VNPs 溶于 200 μl 的 0.1 M 磷酸钾缓冲液（pH 7.0）中上样。
    2. 将检测器设置为 260 nm（核酸）、280 nm（蛋白质）以及所连接染料的激发波长。
    3. 以 0.5 ml/min 的流速运行 72 分钟。
    4. 洗脱图谱及 A260:A280 比值可反映 VNP 制备物是否纯净，以及颗粒是否完整并正确组装。
      以下 A260:280 比值表明 VNP 制备物纯净：
      CPMV： 1.8±0.1
      PVX： 1.2±0.1
      TMV： 1.1±0.1
      BMV： 1.7±0.1
  3. 进行变性 Bis-Tris 聚丙烯酰胺 4–12% 梯度凝胶电泳（预铸 NuPAGE 凝胶）以分析制备物的纯度及与单个衣壳蛋白的偶联情况。
    1. 向 9 μl 磷酸钾缓冲液中的 10 μg 颗粒中加入 3 μl 4x LDS 上样缓冲液。对于 BMV，额外加入 1 μl 4x LDS 上样缓冲液和 3 μl β-巯基乙醇，以还原大量二硫键。
    2. 在 100 °C 的金属浴中孵育 5 分钟。
    3. 将样品上样至 SDS 凝胶。
    4. 在 1x MOPS 电泳缓冲液中以 200 V 电压运行 1 小时。
    5. 在紫外光下成像凝胶，以观察荧光标记的衣壳蛋白。
    6. 对于非荧光蛋白，使用考马斯亮蓝染色液（0.25% (w/v) 考马斯亮蓝 R-250，30% (v/v) 甲醇，10% (v/v) 乙酸）染色 1 小时。
    7. 用含 30% 甲醇和 10% 乙酸的溶液脱色过夜。必要时更换脱色液。
    8. 在白光下对凝胶进行成像。
  4. 通过透射电子显微镜（TEM）分析颗粒的完整性。
    1. 将样品用 20 μl 去离子水中稀释至 0.1–1 mg/ml。
    2. 将 20 μl 样品液滴置于 Parafilm 膜上。
    3. 将 TEM 铜网覆盖于液滴上，静置 2 分钟。用滤纸从铜网上吸去多余液体。
    4. 将铜网置于去离子水液滴上清洗一次，再用滤纸吸干。
    5. 将铜网置于 20 μl 的 2% (w/v) 醋酸铀酰液滴上染色 2 分钟，再用滤纸吸去多余染色液。
    6. 再次用去离子水清洗铜网一次。
    7. 在透射电子显微镜下观察铜网。

4. VNPs 与 PEG 及荧光染料的化学偶联、纯化与表征

  1. 对于以下反应的计算，VNPs 的摩尔质量为：
    CPMV： 5.6 × 106 g/mol
    PVX： 35 x 106 g/mol
    烟草花叶病毒 41 x 106 g/mol
    BMV： 4.6 × 106 g/mol
  2. 使用一步法将染料和聚乙二醇（PEG）偶联至CPMV和PVX表面的赖氨酸残基 NN-羟基琥珀酰亚胺偶联反应：将2,500摩尔当量（所有摩尔过量均指每VNP的摩尔过量）Alexa Fluor 647 琥珀酰亚胺酯和4,500当量NHS-PEG（分子量5,000）溶于DMSO中，加入至CPMV的0.1 M磷酸钾缓冲液中。处理PVX时，加入10,000摩尔过量的NHS-染料和NHS-PEG。调节缓冲液和DMSO体积，使CPMV和PVX的终浓度为2 mg/ml，DMSO含量为总体反应体积的10%。将反应混合物在室温避光条件下孵育过夜。CPMV和PVX分别具有300和1,270个可标记的赖氨酸残基。读者可参考以下文献，以进一步了解CPMV和PVX的化学修饰： 13-15).
  3. 通过重氮盐偶联反应将染料和聚乙二醇（PEG）连接至烟草花叶病毒（TMV）的酪氨酸残基，随后进行铜(I)催化的叠氮-炔烃环加成反应。
    1. 通过混合400 μl的0.3 M炔烃重氮盐来制备重氮盐（炔烃） p对甲苯磺酸一水合物，3.0 M 亚硝酸钠 25 μl，以及溶于乙腈的 0.68 M 蒸馏 3-乙炔基苯胺 75 μl，在 4 °C 下反应 1 小时。
    2. 向1.25 ml的TMV（20 mg/ml储备液）中加入3.3 ml含100 mM NaCl的硼酸盐缓冲液（pH 8.8）。
    3. 在冰浴中将烟草花叶病毒（TMV）与450 μl重氮盐（炔基）溶液反应3小时，通过重氮偶联反应在TMV上引入炔基连接基团。溶液将变为浅棕色。TMV含有2,140个可用于偶联的酪氨酸残基。
    4. 使用蔗糖垫纯化最终产物，具体步骤如4.4所述。
    5. 使用铜(I)催化的叠氮-炔烃环加成反应（CuAAC）连接叠氮功能化的Alexa Fluor 647和PEG-叠氮（分子量5,000）。每摩尔外壳蛋白加入2当量的染料叠氮和PEG-叠氮，并与1 mM CuSO₄孵育4，2 mM AMG 和 2 mM 抗坏血酸钠，室温孵育 15 分钟。调整缓冲液体积，使 TMV 的终反应浓度为 2 mg/ml。（读者可参考以下文献，以进一步了解烟草花叶病毒（TMV）的化学修饰： 16,17).
  4. 将染料偶联至BMV半胱氨酸突变体（cBMV）的赖氨酸，将聚乙二醇（PEG）偶联至其半胱氨酸：
    1. 向0.1 M TNKM缓冲液（50 mM Tris碱，50 mM NaCl，10 mM KCl，5 mM MgCl₂）中的cBMV加入2,000摩尔当量溶于DMSO的Oregon Green 488琥珀酰亚胺酯。2，pH 7.4）。调整缓冲液和DMSO的体积，使BMV的终浓度为1 mg/ml，DMSO含量占总反应体积的10%。将反应混合物在4 °C避光孵育过夜。
    2. 使用离心过滤器纯化颗粒，具体步骤如4.4所述。
    3. 加入2,000倍摩尔过量的PEG-马来酰亚胺（分子量2,000），反应条件与之前相同，在4 °C下孵育反应混合物2小时。cBMV含有180个可反应的赖氨酸和半胱氨酸。读者可参考以下文献以进一步了解BMV的化学修饰：18).
  5. 纯化： 以160,000 × g离心2.5小时，使溶液通过40%（w/v）蔗糖垫层。将沉淀物重新溶解于缓冲液中。或者，使用截留分子量为10 kDa的旋转过滤器对适当的缓冲液进行透析。
  6. 表征： 采用上述方法对聚乙二醇化并荧光标记的VNPs进行分析：紫外/可见光光谱法、SDS凝胶电泳、FPLC和TEM（未显示，但请参见 图6和图7) .

5. 使用小鼠异种移植模型进行肿瘤靶向与成像

  1. 在含有5%胎牛血清（FBS）、1%青霉素-链霉素和1% L-谷氨酰胺的RPMI培养基中，于37 °C、5% CO2条件下，使用175 cm2细胞培养瓶培养HT-29人结肠癌细胞。
  2. 用无菌PBS洗涤细胞两次，加入5 ml胰蛋白酶-EDTA溶液，在37 °C孵育5分钟以消化细胞。加入5 ml RPMI培养基终止胰蛋白酶反应。在4 °C下以500 × g离心5分钟收集细胞，并用新鲜RPMI培养基重悬至5×106个细胞/50 μl（使用台盼蓝染色和血细胞计数板确定总细胞数）。注射前与等体积Matrigel混合（所有溶液和试剂均保持无菌）。
  3. 获取6周龄NCR nu/nu小鼠，并给予无苜蓿饮食喂养2周。[注意：所有动物实验操作必须经IACUC批准。] 使用18½号无菌针头，在小鼠侧 flank 部位皮下注射5×106个细胞/100 μl（每只小鼠接种2个肿瘤）以建立肿瘤异种移植模型。定期监测动物状态，使用游标卡尺测量肿瘤大小，并让肿瘤生长至平均体积达20 mm3（约在接下来的12天内）。将小鼠随机分为两组：PBS组和VNP组（每组每时间点n = 3只动物）。使用1 ml 28号胰岛素注射器，经尾静脉注射100 μl无菌PBS或10 mg/kg VNP制剂。

注意：不会演示组织培养实验和活体动物研究。实际操作演示仅限于组织处理和数据采集。有关HT-29肿瘤异种移植模型的参考文献，请参见文献19。

评估VNPs肿瘤归巢能力的三种技术：

  1. 使用Maestro成像系统进行荧光成像： 在不同时间点（2、24 和 72 小时）使用 CO 处死小鼠2 气体。解剖动物，取出所有主要器官（脑、心、肺、脾、肾和肝）以及 flank 部位的肿瘤，将组织置于 Parafilm 上，使用黄色激发和发射滤光片（曝光时间 800 ms）通过荧光成像仪器检测组织中是否存在荧光信号（来源于与 VNPs 偶联的 A647 标记）。保存图像，并使用 ImageJ 1.44o 软件分析荧光强度http://imagej.nih.gov/ij比较VNPs在肿瘤与其他主要组织中随时间的摄取模式。
  2. 成像后，将每份组织切成两半，其中一半置于OCT包埋剂中用于冷冻切片和共聚焦分析；另一半收集至预先称重的冻存管中，并立即用液氮冷冻2-80 °C 保存，直至进行后续处理。
  3. 荧光定量： 记录组织重量。将冷冻组织在室温下解冻后，分别放入含有1 ml PBS的50 ml Falcon管中。使用手持式组织匀浆器在PBS中匀浆2–3分钟，然后将匀浆液转移至微量离心管中。在13,000 × g离心10分钟，以去除未匀浆的组织。
  4. 将每组（PBS 和 VNP 制剂/时间点）组织的上清液各 100 μl 用移液器转移至 384 孔黑色紫外板中。使用酶标仪检测荧光强度（激发/发射波长 600/665）。将获得的荧光值按组织重量进行归一化处理。
  5. 免疫组织化学 制备冷冻切片机切片（10 μm），并于 -20 °C 保存。对组织切片进行细胞核染色（DAPI）和内皮细胞标志物染色（FITC 标记的小鼠抗 CD31 抗体）。进行共聚焦显微镜分析，以绘制荧光标记的 VNPs 在血管及肿瘤内部的分布定位。

注意： 本操作步骤将不进行演示，代表性数据见图8。有关免疫组织化学及所述染色方法的参考文献，读者可参阅文献19。

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结果

植物生长比较分析；实验设置，叶片颜色变化研究，黄化方法。
图1. 植物病毒感染的植株。 感染CPMV的豇豆（Vigna unguiculata）植株（A）；感染PVX（B）、TMV（C）和BMV（D）的本氏烟（Nicotiana benthamiana）植株。图片拍摄于机械接种感染后约10天。

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讨论

本方案提供了一种对VNPs进行化学修饰的方法及其应用 体内 肿瘤成像。本文介绍的动物荧光成像、荧光定量和免疫组织化学技术可用于研究纳米颗粒的生物分布并评估其向肿瘤的靶向性。这些技术能够提供有关纳米颗粒通过EPR效应进入肿瘤组织的重要信息。结合多种分析方法的结果，可形成一种强大的综合策略，用于评估病毒样纳米颗粒（VNPs）的定位及其在体内的生物分布。

然而，在进行这些研究之前，必须首先获得高纯度的病毒制备物。除了机械接种外，病毒样颗粒（VNP）扩增的一种可能替代方法是农杆菌渗入法，该方法可具有较高的转化效率和积累速率。在扩增VNPs时，应注意将感染不同病毒的植株分开，以避免交叉污染。特别是烟草花叶病毒（TMV）极易通过机械方式传播和扩散。另一个需要特别注意的关键步骤是在冰上或4 °C条件下进行病毒纯化，所有缓冲液均应预冷至冰冻状态。较低的温度对于防止植物材料中存在的蛋白酶和氧化酶对VNPs造成损伤至关重要。

纯化病毒纳米颗粒（VNPs）的产量较低可能由多种因素引起。其中一个可能的原因是用于扩增的VNPs保存...

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披露

未声明任何利益冲突。

致谢

本工作得到了美国国立卫生研究院/国立生物医学成像与生物工程研究所（NIH/NIBIB）R00 EB009105（授予NFS）和P30 EB011317（授予NFS）基金、NIH/NIBIB培训基金T32 EB007509（授予AMW）、凯斯西储大学跨学科联盟投资基金（授予NFS）以及凯斯综合癌症中心基金P30 CA043703（授予NFS）的支持。我们感谢斯坦梅茨实验室的本科学生研究人员提供的实际协助：Nadia Ayat、Kevin Chen、Sourav (Sid) Dey、Alice Yang、Sam Alexander、Craig D'Cruz、Stephen Hern、Lauren Randolph、Brian So 和 Paul Chariou。

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材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
病毒纳米颗粒的制备
室内植物培养室Percival ScientificE-41L2
豇豆（V. unguiculata） 种子（California black-eye no. 5）伯比51771A
N. benthamiana 种子N. benthamiana 种子由 Salk 研究所惠赠。种子通过植物繁殖获得。
碳化硅FisherC192-500
Pro-mix BX 育苗土普雷米尔园艺713400
杰克牌专业20-10-20泥炭轻质肥料JR Peters77860
设备
50.2 Ti 转子贝克曼337901
SW 32 Ti 转子贝克曼369694
Optima L-90K 超速离心机贝克曼365672
SLA-3000 转子赛默飞世尔科技07149
SS-34 转子赛默飞世尔科技28020
Sorvall RC-6 Plus 离心机Thermo Scientific46910
聚丙烯瓶贝克曼355607对于 SLA-3000 转子
聚碳酸酯瓶贝克曼357002对于 SS-34 转子
超清晰管贝克曼344058用于蔗糖梯度和SW 32 Ti转子
聚碳酸酯瓶贝克曼355618用于沉淀和 50.2 Ti 转子
NanoDrop 分光光度计Thermo ScientificNanoDrop2000c
PowerEase 500 预制胶系统InvitrogenEI8675EU
Superose 6 10/300 GL（24 ml）凝胶过滤层析柱GE Healthcare17-5172-01
ÄKTA Explorer 100 色谱仪GE Healthcare28-4062-66
Allegra X-12R贝克曼392302台式离心机
冷冻切片机LeicaCM1850
Maestro 2Caliper Life Sciences体内 成像系统
组织撕裂器Biospec Products985370-395
微孔板读板仪TecanInfinite-200
透射电子显微镜ZEISSLibra 200FE
FluoView 激光扫描共聚焦显微镜奥林巴斯FV1000
化学试剂与试剂
3-乙炔基苯胺Sigma Aldrich498289-5G
384孔黑色板BD Biosciences353285
4-12% Bis-Tris NuPAGE SDS 凝胶InvitrogenNP0321BOX
4X LDS 上样缓冲液InvitrogenNP0008
乙酸FisherA385-500
乙腈Sigma Aldrich271004-1L
Alexa Fluor 647 叠氮化物InvitrogenA10277
Alexa Fluor 647 羧酸琥珀酰亚胺酯InvitrogenA20006
Amicon Ultra-0.5 ml 离心滤器MilliporeUFC50109610 kDa 截留分子量
盐酸氨基胍Acros Organics36891-0250
硼酸FisherA74-500
考马斯亮蓝 R-250FisherBP101-25
CsClAcros Organics42285-1000
DAPIMP Biomedicals157574
二甲基亚砜FisherBP231-100
滤纸Fisher09-801KP5 级别
FITC 标记的抗小鼠 CD31BioLegend102406
山羊血清Invitrogen16210-064
KClFisherBP366-500
L-抗坏血酸钠盐Acros Organics35268-0050
甲醇FisherA412P-4
MgCl₂2FisherBP214-500
显微镜载玻片Fisher12-544-3
显微镜盖玻片VWR48366-277
MOPS缓冲液InvitrogenNP0001
mPEG-malNanocsPG1-ML-2k分子量 2000
mPEG-N3NanocsPG1-AZ-5k分子量 5000
mPEG-NHSNanocsPG1-SC-5k分子量 5000
NaClFisherBP358-212
俄勒冈绿 488 琥珀酰亚胺酯 *6-异构体*InvitrogenO-6149
对甲苯磺酸一水合物Acros Organics13902-0050
佩尔蒙特FisherSP15-100
磷酸氢二钾FisherBP363-1
磷酸二氢钾FisherBP362-1
乙酸钠FisherBP333-500
亚硝酸钠Acros Organics42435-0050
亚硫酸钠Amresco0628-500G
蔗糖FisherS6-500
透射电子显微镜载网Ted PellaFCF-400Cu
Tris 碱FisherBP152-500
Triton X-100EMD ChemicalsTX1568-1
β-巯基–乙醇FisherO3446I-100
组织培养
胎牛血清Invitrogen12483-020
血细胞计数板Fisher0267110
HT-29细胞ATCCHTB-38
L-谷氨酰胺Invitrogen25030-080
PBSCellgro21-040-CV
青霉素-链霉素Invitrogen10378-016
RPMI-1640Invitrogen31800-089
组织培养瓶康宁431080175 cm2
台盼蓝Thermo ScientificSV30084.01
胰蛋白酶，0.05%（1X）含EDTA 4Na，液体Invitrogen25300-054
动物实验
18% 蛋白质啮齿类动物饲料Harlan TekladTeklad Global 2018S苜蓿-free饮食
胰岛素注射器BD Biosciences32941028 号规格
异氟烷BaxterAHN3637
基底膜基质胶BD Biosciences356234
NCR nu/nu 小鼠凯斯西储大学学校
医学院无胸腺动物与异种移植核心设施
无菌注射器BD Biosciences30519618½ 号规格
Tissue-Tek CRYO-OCT 包埋剂Andwin Scientific4583

参考文献

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