居民-入侵者范式：一种用于攻击性、暴力与社会应激的标准化测试

摘要

本视频展示了大鼠的居民-入侵者范式。该实验是一种在半自然环境中测量攻击性行为、防御行为和暴力行为的标准化方法。同时，也解释了该范式在社会应激实验中的应用。

摘要

本视频出版物详细说明了大鼠居住者-入侵者范式（resident-intruder paradigm）的实验方案。该测试是一种在半自然环境中测量攻击性行为和防御性行为的标准化方法。视频中展示了居住者与入侵者所表现出的最重要行为要素，并通过艺术绘图加以说明。同时解释了居住者-入侵者范式在急性与慢性社会应激实验中的应用。最后，介绍了一些简要的测试方法和判断标准，用于区分正常攻击行为与其更激烈、病理性形式之间的差异。

引言

攻击行为属于几乎所有动物物种自然行为谱系的一部分。从生物学角度来看，攻击行为可被视为一种高度功能性的社会交流形式，旨在主动控制社会环境。其特征是与对手密切互动时表现出一系列物种典型的行为。明显的攻击和身体冲突不仅对受害者，而且对攻击者本身都可能造成伤害。因此，在整个动物界，已演化出多种机制以最小化和控制身体攻击，从而避免其潜在的不良后果。这些机制包括例如威胁行为，此类行为通常可预示并因此防止身体攻击的发生。其他控制攻击的机制还包括禁忌、仪式化、屈服、和解与安抚行为。这一点尤其适用于进攻性攻击，即一种由攻击者主动发起的攻击行为，其特点是在实施最终攻击性撕咬前，会表现出一系列初始的、通常是威胁性的行为展示，而攻击的目标通常是背部和颈部等不易受伤的部位。尽管存在这些高度适应性的控制机制，但仍存在功能性攻击转变为暴力行为的例子。暴力可被定义为一种失控且脱离情境的伤害性进攻性攻击；它是一种病理性进攻行为，不再受抑制性控制机制的约束，且在社会交流中对正常的攻击行为并无额外的功能价值⁸。因此，暴力在数量和质量上均不同于正常的适应性进攻行为。这可能包括针对咽喉、腹部和脚掌等通常禁止攻击的脆弱身体部位的撕咬行为^{5, 13, 20, 24}。

防御性攻击是指在受到其他个体攻击时所表现出的攻击性行为。这种行为在行为表达和抑制控制方面与进攻性攻击有明显区别⁵。需要注意的是，防御性行为的极端形式可能具有暴力特征。

大部分临床前攻击行为研究是在具有领地性的雄性定居大鼠或小鼠与入侵的同种动物对峙的条件下进行的。这种所谓的“定居者-入侵者”范式，能够在半自然的实验室环境中，使实验啮齿类动物自发且自然地表现出进攻性攻击行为和防御性行为。通过记录对峙过程中双方个体所表现出的各种行为动作和姿势的频率、持续时间、潜伏期以及时间和序列模式，可以获得关于进攻性（定居者）和防御性（入侵者）攻击行为的详细定量图谱（行为谱）。有关各种行为的详尽描述，参见文献^{3, 12, 18}。该范式基于以下事实：当提供足够的生活空间时，成年雄性大鼠会建立领地。当存在雌性动物和/或具有性经验时，其领地性会显著增强¹。由于领地性的存在，定居者会攻击侵入其家园笼具的陌生雄性个体。因此，可通过将定居者作为实验动物来研究进攻性攻击行为。为了确定攻击行为的暴力性质，可采用不同类型的入侵者（如雌性、麻醉雄性）或更换为新环境，以评估攻击行为是否脱离情境且缺乏抑制性控制。要揭示所观察到的攻击行为在多大程度上失控，必须对其进攻性行为谱进行详细的定量分析。

在居民-入侵者范式中，入侵者会对居民的攻击性行为表现出防御性反应。因此，该范式也可用于以入侵者作为实验动物来研究防御行为和社会应激。通过反复将实验动物作为入侵者，或将其饲养在居民动物的笼子（领地）内并用金属网隔开，可建立一种慢性社会应激模型⁴。

与任何一种应激范式一样，居民-入侵者范式也并非不存在伦理问题。因此，我们希望提出若干伦理方面的考虑。攻击、暴力和社会应激在人类社会中是严重的问题。世界卫生组织的一份报告表明，人际暴力不仅在全球范围内是导致死亡的主要原因之一，也是攻击行为幸存者出现严重健康问题的重要来源¹⁹。因此，有必要从其潜在的因果机制和调节因素角度来理解这些行为。动物模型对于获得生理和环境因素因果关系的实验证据至关重要。从生物学角度来看，攻击是一种自然的、具有生物学功能的社会行为形式，旨在建立领地、社会支配地位以及保护资源。居民-入侵者范式将这种自然行为形式引入实验室环境，使得对攻击者和受害者的可控研究成为可能。一个值得关注的伦理问题是，动物在经历该范式时其福利在多大程度上受到损害。多项研究表明，参与进攻性攻击行为并赢得打斗对动物而言具有高度的奖赏性或强化效应¹¹。从这一角度看，居民个体并不会经历痛苦。然而，攻击性互动还需要一个对手。防御行为和屈服属于应对支配地位的自然行为反应范畴。失败和被征服会触发一种适应性的行为和生理反应，旨在使个体在社会群体中采取从属地位。从这个角度来看，失败初期的反应将导致动物良好适应，并不一定经历痛苦¹⁵。只有在反复暴露于优势个体以及失败后长期社会隔离的情况下，才可能导致超出动物适应能力的状态。这使得该范式适合作为具有高度生态效度的应激病理动物模型¹⁷。尽管社会失败所造成的应激主要属于心理社会性质，但也可能造成身体伤害和损伤。在正常的（非暴力）社会互动中，这种身体伤害是有限的。咬伤主要发生在对手的背部和体侧——这些部位的皮肤厚而坚韧^5,6。实际上，咬伤只是短暂地啃咬皮肤，仅留下门齿的小型印记。这类皮肤损伤无需任何兽医治疗。然而，生物学上有功能的攻击行为可能转变为一种失控且脱离情境的病理性暴力攻击形式。在这种情况下，可能在脆弱的身体区域（如腹部、喉咙和足掌）造成更严重的伤口¹⁴。为了使针对暴力攻击行为的实验模型系统具有临床相关性，其必须具备有效性，而这恰恰构成了此类攻击研究的核心伦理困境，即伤害与损伤问题。此类研究受到两个相互矛盾的原则支配：当行为具有潜在伤害性和致伤性时，才能实现表观效度；但与此同时，所有伦理研究准则均强调应尽量减少和避免伤害或损伤的风险。每一个研究问题和实验方案都必须审慎评估，为产生可转化为公共卫生体系关切的科学有效信息，所需或可接受的伤害程度究竟为何。当实验的主要目的是研究暴力行为时，显然应对受害者给予高度关注，包括伤口护理甚至实施安乐死。一旦入侵者在脆弱身体区域出现严重伤口，即应作为人道终点终止实验。当实验的主要目的是研究社会应激时，若居民个体表现出造成脆弱部位严重咬伤的暴力迹象，则应立即终止互动。毕竟，该应激范式的心理社会本质不应与严重身体损伤带来的应激相混淆。一旦居民个体表现出此类暴力迹象，应将其排除出实验。

方案

1. 实验装置

1. 为每位居民动物提供一个面积约0.5平方米的笼子。攻击性行为是一种高度活跃的行为形式，需要足够的空间才能充分表现。笼子应由可消毒材料制成。
2. 在实验开始前至少一周，将每位居民动物与一只雌性共同饲养，以促进领地行为的形成。同时，这可以避免社会隔离，因为社会性动物长期隔离已被证实具有应激性，可能导致福利水平下降及出现异常的社会行为。
3. 使用通过输卵管结扎术进行绝育的雌性作为伴侶。这种方法可使雌性保持正常的激素状态，能够定期接受交配，而不会怀孕，从而避免母性攻击行为的产生。

2. 实验步骤

1. 在测试前至少一周，将留居雄性小鼠与其同伴雌性小鼠共同饲养于留居笼中。
2. 在最初一周内以及后续测试前，不要清理笼内垫料，因为领地行为高度依赖于嗅觉线索的存在。这些嗅觉线索对于留居小鼠建立自身领地以及入侵小鼠识别其处于留居小鼠的家中均至关重要。请注意，此项操作偏离常规动物护理程序，可能需要获得相关主管部门的特别许可。
3. 在测试开始前一小时，将同伴雌性小鼠从留居笼中移出。
4. 在测试开始时，将一只陌生的雄性小鼠引入留居小鼠的家中笼内。建议选择体型略小于留居小鼠的入侵者，且该入侵者此前未与同一只留居小鼠发生过互动。
5. 记录留居小鼠的行为，建议使用对光敏感的视频摄像机进行录制。
6. 通常10分钟的测试时长已足以展现完整的攻击性行为谱系。为实现标准化，可考虑在首次攻击发生后继续记录十分钟。
7. 测试结束后，将入侵雄性小鼠从笼中移出，并让留居雄性小鼠与其同伴雌性小鼠重新合笼。
8. 尽管攻击行为可能在一天中的任何时间发生，但最好仅在黑暗期（即大鼠的主要活动期）进行测试。
9. 每天可进行一次或两次测试。攻击行为水平通常在前几次测试中逐渐升高，但一般在经过三到四次测试后趋于稳定。

3. 攻击性攻击行为

1. 原则上，任何品系的大鼠均可作为居民鼠使用。然而，不同品系在攻击行为的绝对水平上可能存在显著差异。此外，同一品系内个体间的变异也可能相当明显。
2. 在品系、年龄和体重方面尽可能标准化入侵者大鼠。应选用非攻击性品系且体重略低于居民雄鼠的大鼠。
3. 测定居民雄鼠以下行为参数的持续时间和发生频率：
   1. 攻击潜伏期：从入侵者引入到首次发生抓咬攻击之间的时间
   2. 朝向移动
   3. 社会性探究
   4. 肛殖区嗅探
   5. 直立
   6. 侧向威胁
   7. 直立姿势
   8. 抓咬攻击
   9. 压制
   10. 追逐
   11. 非社会性探究
   12. 静止或无活动
4. 分析
   1. 记录的行为参数应覆盖整个观察时间的100%。这有助于对结果进行无偏解释，i.e. 当一种行为增加时，必然伴随另一种行为的减少。
   2. 可通过计算不同行为类别的得分来实现数据简化；特别是：
      1. 总攻击得分：侧向威胁、直立、抓咬、压制和追逐的总和
      2. 社会性探究得分：社会性探究、肛殖区嗅探和社会性理毛的总和
   3. 数据可表示为占总观察时间的百分比

4. 暴力

1. 遵循第2节中所述的实验方案
2. 行为学测试与判定标准：
   1. 测定同居住雄性小鼠的攻击潜伏期。攻击潜伏期极短是攻击性强的第一个指标。
   2. 计算同居住雄性小鼠侧身威胁行为与抓斗行为的发生频率之比。若该比值低于1，表明动物未表现出任何前导性行为或预警即直接发起攻击，这是攻击失控（暴力行为）的可靠指标。
   3. 攻击目标部位：
      1. 若攻击行为集中于咽喉、腹部和爪子等易受伤部位，表明存在暴力倾向。
      2. 若攻击目标为对手的吻部，则提示行为个体处于防御状态。
   4. 非情境性测试：
      1. 使用陌生雌性作为入侵者。若同居住雄性攻击雌性，表明其具有暴力倾向。
      2. 使用麻醉雄性作为入侵者。若同居住雄性攻击麻醉雄性，表明其具有暴力倾向。
      3. 在新环境中测试同居住雄性的攻击行为。若其攻击性与在居住笼中的表现相比无变化，则提示存在暴力行为。 本测试的终点为首次攻击发生，或持续10分钟未发生攻击。

5. 防御行为

1. 选择若干只训练良好、攻击性强但非暴力的常驻雄性动物
2. 按照第2节所述方案进行操作
3. 在入侵者中测定以下行为参数的持续时间和发生频率（除3c外）：
   1. 屈服潜伏期
   2. 屈服姿势
   3. 退避
   4. 逃跑
   5. 防御性直立姿势
   6. 僵直
   7. 非社交性探索
   8. 直立
4. 分析
   1. 可通过计算防御得分来实现数据简化，该得分等于逃跑、防御性直立姿势、屈服和僵直所花费时间的总和

6. 社会应激

1. 按照第5节所述方案进行操作
2. 对于间歇性社会应激，重复该方案
3. 对于慢性社会应激，将入侵者保留在居住鼠的笼内，但用金属网筛将其与居住鼠隔开
4. 根据科学问题和假设的需要，持续进行步骤b和/或c

结果

不同品系之间以及同一品系内部在攻击性行为水平上存在显著差异。这一点在图1中得到体现，该图展示了实验室培育但起源于野生大鼠品系（格罗宁根野生型品系（WTG））（图1a）和一种更常见的实验室大鼠品系（Wistar品系，图1b）的攻击性得分频率分布。在WTG品系中，约有三分之一的动物表现出极度攻击性，而另外三分之一则无攻击性或攻击性极低。相比之下，Wistar品系的频率分布中不存在高度攻击性表型，约有50%的动物属于低攻击性或无攻击性¹⁶。

图2展示了以WTG品系为同巢鼠（图2a）、Wistar大鼠为入侵鼠（图2b）时，居民-入侵者实验范式中不同行为类别的分布情况。图中显示了WTG同巢鼠攻击行为的平均组成以及Wistar入侵鼠防御行为的平均组成，以各类行为所占用的相对时间比例表示。

图3展示了在行为药理学中使用居民-入侵者范式的一个示例。选择性5-羟色胺1a受体激动剂Alnespirone可诱导攻击性行为呈剂量依赖性减少，同时伴随社会探索行为呈剂量依赖性增加。该化合物对非社会性探索和静止状态均无显著影响，表明其行为效应特异性地作用于攻击性行为⁹。

在某些个体中，攻击性行为可能升级为暴力形式的攻击。高水平攻击性与暴力攻击之间的区别如图4所示。尽管在攻击得分上没有统计学差异，但暴力型攻击的特征表现为极短的攻击潜伏期、对麻醉雄性或雌性的攻击、造成严重伤害以及极低的威胁性攻击比例⁸。

图1. 实验室培育但起源于野生大鼠品系（A - 上图）与雄性Wistar大鼠品系（B - 下图）个体攻击性水平的频率分布¹⁶。

图 2. 在为期十分钟的同居入侵者实验中，野生型G型大鼠（WTG）居民雄性（A）与Wistar品系入侵者大鼠（B）的行为特征谱。

图3. 5-HT1a激动剂Alnespirone以剂量依赖方式减少攻击性行为⁹。 点击此处查看高清大图.

图4. 高度攻击性雄性与暴力性雄性之间的比较⁸。

讨论

居民-入侵者范式可用于研究大鼠的攻击性行为、防御行为、暴力行为及社会应激，经过少量修改后也可用于其他啮齿类动物。在研究攻击行为时，原则上所有大鼠品系均可使用，但不同品系的适用性并不相同。根据实验的具体目的，应考虑动物的某些特定特征。需要注意的是，不同品系作为居民时所表现出的攻击性水平和强度存在显著差异。图1展示了源于野生大鼠品系（图1a）与标准实验室Wistar品系（图1b）在攻击性行为上的频率分布。这两个品系在表现出攻击行为的动物数量上存在明显差异。此外，在攻击行为的绝对程度上也有很大差别。在我们标准的10分钟测试中，野生大鼠品系的攻击性比例范围从0%到80%，而Wistar品系最高仅为25%；后者品系中缺乏高度攻击性的表型¹⁶。

当使用居民-入侵者范式研究入侵者的防御行为和社会应激时，需要选择具有高度攻击性表型的个体作为居民。毕竟，居民必须能够可靠地击败进入其领地的任何入侵者。当然，应选择攻击性最强的个体，并且需要认识到，即使在高度攻击性的品系中，并非所有个体都适合此目的。应使用至少四个月龄的真正成年雄性¹⁰，也可考虑使用曾参与繁殖的雄性个体。建议在正式开始社会应激实验前的数天内，让居民雄性与入侵者进行一些预先接触以积累经验。任何品系均可用作入侵者。然而，为了确保居民能够明确获胜并使入侵者被彻底击败，建议选择体重略低于居民雄性的个体作为入侵者。由于嗅觉线索在社会交流和领地行为中具有重要作用，因此在测试前清洁居民的笼子将构成严重的混杂因素。

建议在实验过程中对实验动物的全部行为谱进行录像记录。这有助于对结果进行无偏倚的分析，即当一种行为增加时，另一种行为往往会减少。例如，图3所示结果表明，药物处理后攻击行为的减少伴随着社交探索行为的增加，而非静止不动。这表明药物引起的攻击性降低并非由镇静作用或运动抑制效应所致。总攻击评分是攻击强度的指标，而首次攻击的潜伏期及发生攻击的动物数量可用于评估攻击倾向²²。

在进行社会应激实验时，应明确社会挫败的判定标准。当入侵者采取屈服姿态（见上文）且即使在领地鼠离开后仍保持该姿态时，即可作为社会挫败的可靠判断依据。需要注意的是，入侵者的饲养条件在社会应激研究中极为重要。首先，社会应激实验不应在饲养非应激对照动物的同一房间内进行。对照动物若目睹其他个体经历（社会）应激，其自身也可能遭受显著应激^{7, 21}。其次，社会应激的后果易受到社会缓冲效应的影响。在经历社会应激后继续群养的动物，其长期后果与应激后被社会隔离的动物不同，后者表现出更明显的长期影响²³。

综上所述，居民-入侵者范式可用于研究攻击性行为的成因及其后果。该模型具有较高的表面效度和构念效度，不仅涵盖社会行为的适应性生物学机制，还可用于研究暴力和社会应激病理等非适应性方面的表现。