鸣禽听觉刺激下的功能性磁共振成像（fMRI）

摘要

本文介绍了一种利用功能磁共振成像（fMRI）技术对鸣禽大脑中听觉刺激神经基础进行成像的优化流程。该方法涵盖了声音刺激的制备、受试动物的定位、fMRI数据的采集以及后续分析过程。

摘要

鸟类鸣唱的神经生物学作为人类语言的模型，是行为神经科学中一个重要的研究领域。电生理学和分子生物学方法虽然能够研究少数神经元对不同刺激的反应，或研究单一刺激在大脑大范围区域的效应，但只有基于血氧水平依赖（BOLD）的功能性磁共振成像（fMRI）能够结合这两者的优势，即一次性比较不同刺激在整个大脑中引发的神经活动。i.e. 比较不同刺激在整个大脑中引发的神经激活。在鸣禽中进行fMRI研究具有挑战性，因其脑体积较小，且其骨骼特别是颅骨含有大量气腔，容易引起显著的磁化率伪影。梯度回波（GE）BOLD fMRI已成功应用于鸣禽研究^1-5（综述见⁶），但这些研究主要集中在无磁化率伪影的一级和二级听觉脑区。然而，由于感兴趣的过程可能发生在这些区域之外，因此需要采用对伪影不敏感的MRI序列进行全脑BOLD fMRI。这可以通过使用自旋回波（SE）BOLD fMRI^7,8来实现。本文中，我们描述了如何在斑胸草雀（Taeniopygia guttata）中应用该技术，这是一种体重为15–25 g的小型鸣禽，被广泛用于鸟类鸣唱行为神经科学的研究。目前针对鸣禽的fMRI研究主要关注鸣唱的感知与学习。由于刺激具有听觉特性，而基于SE的fMRI序列（相较于GE）BOLD敏感性较弱，因此该技术的实施极具挑战性。

方案

1. 听觉刺激的制备

1. 首先记录在7T磁共振系统孔洞内播放的声音刺激。该孔洞为一个密闭空间，可能导致听觉刺激失真，从而增强某些听觉频率。图1展示了通过光纤麦克风（Optimic 1160, Optoacoustics）在磁体孔洞内鸟头位置记录白噪声所显示的增强与抑制的频率。为补偿这种人为增强效应，使用WaveLab软件对每个刺激应用均衡器函数。在我们的特定设置中，该函数包含一个高斯核，参数如下：最大振幅：-20 dB，中心频率：3,750 Hz，带宽：0.05 倍频程（对应我们系统中2,500–5,000 Hz的范围）。
2. 歌曲刺激由每只鸟的多个独立鸣唱动机交替插入静音段构成。这些静音段的持续时间经过调整，以确保所有刺激中的声音与静音总量保持一致。这种设计保留了个体内部和个体间鸣唱长度的自然变异性。每个刺激的总长度为16秒。在整合到完整刺激（包括歌曲和静音段）之前，每首歌曲的强度均通过均方根值归一化处理，并在400 Hz处进行高通滤波。这些操作使用Praat软件完成。
3. 实验采用ON/OFF区组设计，交替呈现听觉刺激期（ON区组）与静息期（OFF区组）（图2）。每个区组（ON和OFF）持续16秒，对应于2幅图像的采集时间（采集参数见下文）。每种刺激类型重复呈现25次，从而每名受试者每种刺激可获得50幅图像。各条件的呈现顺序应在受试者内部和之间随机化。这种随机化的刺激顺序可通过Presentation软件进行编码。

2. 受试者准备

2.1 受试对象与组大小

本文介绍了一种专门针对（成年）斑马雀使用的实验方案。物种的选择取决于具体的科学问题，但也需考虑其他因素，例如鸟类对麻醉的耐受性。斑马雀（Taeniopygia guttata）应饲养在 aviaries 中，光照周期为 12 小时光照：12 小时黑暗，并在整个研究期间可自由获取食物和水。每次实验所需的最少个体数量为 15 只，该数量考虑了自旋回波功能磁共振成像（fMRI）的敏感性以及实验中所测量生物学现象的自然个体间变异性。

2.2 实验装置的安装与动物准备

（关于所用设备的规格说明，我们参考本文末尾列出的特定试剂和设备清单）

1. 将喙部面罩安装在7T磁共振系统的MRI床面上，并使用塑料管将其连接至气体控制器设备。打开氧气和氮气气瓶，启动气体控制器设备（氧气流速：200 cc/min；氮气流速：400 cc/min）。

如上所述，本实验装置采用7T磁共振系统。也可使用其他不同磁场强度的磁共振系统，但在7T条件下，信噪比与磁化率伪影程度之间可达到较好的平衡（见讨论部分）。在更高磁场强度下，信噪比将随之磁化率伪影的增加而提高。

2. 打开反馈控制系统和热空气装置。
3. 将斑胸草雀的喙部置于面罩中，使用含3%异氟烷的氧气与氮气混合气体对其进行麻醉，并固定其头部直至鸟类完全麻醉。可通过轻拉其足部来验证麻醉程度：当鸟类完全镇静时，足部不会回缩。此外，鸟类的眼睛将部分闭合。
4. 插入泄殖腔温度探头以监测体温，并将气动传感器置于斑胸草雀腹部下方以监测呼吸频率。合上固定夹克以固定鸟类身体（图3）。
5. 将呼吸频率维持在每分钟40至100次之间，并将体温稳定在40 ± 0.5 °C的狭窄范围内。若呼吸频率过低或过高，应相应调整麻醉深度（异氟烷浓度%）。若问题持续存在，应立即停止实验并将动物从装置中移出，使其恢复。
6. 将非磁性动态扬声器置于斑胸草雀头部两侧，并将其连接至放大器。确保扬声器导线远离温度探头，因为若距离过近可能影响温度读数。
7. 将表面射频线圈放置在斑胸草雀头部上方，并将斑胸草雀置于磁体中心（同时也自动位于位于磁体中部的发射线圈中心）。
8. 将麻醉水平降低至1.5%异氟烷与氧气和氮气的混合气体。

3. 数据采集

1. 获取一组1幅矢状面、1幅水平面和1幅冠状面的梯度回波（GE）定位像（三平面定位序列），以及水平面、冠状面和矢状面的多层图像（采用T₂加权快速采集弛豫增强（RARE）自旋回波序列进行定位），以确定脑部在磁体中的位置（图4）。
2. 通过将梯度上升时间增加至1,000 μs，降低梯度噪声。
3. 设置fMRI序列：RARE T₂加权序列，有效TE：60 msec，TR：2,000 msec，RARE因子：8，视野（FOV）：16 mm，矩阵大小：64 × 32，方位：矢状面，层厚：0.75 mm，层间间隙：0.05 mm，共15层，覆盖几乎整个脑部（图4）。
4. 在刺激呈现软件中选择听觉实验方案（听觉刺激内容及刺激呈现时间）。该方案包含一系列指令，用于启动特定的听觉刺激，并在特定扫描编号时执行。在fMRI序列的每一次重复中，扫描仪软件会向听觉刺激呈现软件发送一个触发信号，后者记录扫描编号并执行相应的指令。
5. 为确保听觉刺激呈现软件不会遗漏任何来自扫描仪的触发信号，应首先启动听觉实验方案。待方案完全加载后，再启动fMRI序列。
6. 每次fMRI实验开始前，先采集12幅伪影图像（dummy images），以使与扫描仪噪声相关的信号在开始听觉刺激前达到稳态。
7. 采集完成后，将数据零填充至64 × 64。
8. 使用Paravision的功能工具（处理/功能成像选项）初步查看结果。计算所有“开启”（ON）区段与基线（“关闭”（OFF）区段）之间的差异性BOLD反应。该分析可初步反映实验质量。若在此阶段未在初级听觉区域观察到激活信号，则可能由于刺激呈现技术问题、麻醉深度不当等原因导致鸟类未能听到或处理听觉刺激。此时应检查实验装置并重复测量。
9. 在与前述fMRI扫描相同的空间方位上，运行一次解剖成像用的3D RARE T2加权序列，参数设置为：有效TE：60 msec，TR：2,000 msec，RARE因子：8，FOV：16 mm，矩阵大小：256 × 128 × 64。
10. 将数据零填充至256 × 256 × 256。
11. 将斑胸草雀从MRI扫描床上取出，置于装有红色灯泡的笼中恢复麻醉。通常情况下，斑胸草雀在异氟烷麻醉后的恢复相对较快（最长5分钟）。数分钟后，鸟类会尝试站立；当完全恢复时，会站在栖木上而非蹲在笼底。本实验中麻醉持续时间约为2小时。本实验室对斑胸草雀应用异氟烷麻醉的最长时间为6小时，此后鸟类亦可在5分钟内完全恢复。

4. 数据处理

1. 将MR数据转换为Analyze或Nifti格式。
2. 由于SPM是为处理人类功能磁共振成像（fMRI）数据而开发的，适用于约2 mm的体素大小。SPM中的许多设置均针对这一近似的体素尺寸进行了优化。如果不想更改所有这些设置，最简单的方法是人为增大鸟类fMRI数据的体素尺寸。使用MRIcro工具，将头部信息中的体素尺寸乘以10进行调整。需要注意的是，这种调整不会影响数据本身，不涉及重采样或对数据的任何其他修改。

另一种选择是使用“SPMMouse”，这是一个工具箱，可使 SPM 打开并分析任意体素尺寸的文件。该工具允许基于任意图像生成 SPM“玻璃脑”图像，并根据图像文件的头部信息或用户输入的数据自动调整默认的长度尺度。因此，该工具箱的工作方式与我们提出的方法相反：它不是更改图像的体素尺寸以适配 SPM，而是更改 SPM 的默认设置，以兼容不同体素尺寸的图像。

3. 重新对齐 fMRI 数据。将解剖学 3D 数据集与 fMRI 时间序列进行共配准。将 3D 数据（以及共配准后的 fMRI 时间序列）标准化至斑胸草雀脑部 MRI 图谱。将变换矩阵应用于 fMRI 数据集。以上步骤均可使用统计参数映射（Statistical Parametric Mapping, SPM）8 软件完成。
4. 使用 SPM8 软件，以 0.5 mm 宽度的高斯核对数据进行平滑处理。
5. 使用 SPM8 进行基于体素的统计分析。将数据建模为方波函数（不使用血流动力学响应函数）。采用经典的限制性最大似然算法估计模型参数。计算每位受试者每种听觉刺激的平均效应（固定效应分析），随后根据需要进行组水平统计分析（混合效应分析）。
6. 在 SPM8 中将统计参数图投影至斑胸草雀图谱（图 5）⁹，以定位功能激活区域（图 6）。

结果

本文以可视化方式展示了一套优化的实验流程，用于成功成像斑胸草雀大脑中对听觉刺激产生响应的神经基础。首先，所描述的听觉刺激制备方法可生成适用于ON/OFF区组设计（图2）的刺激材料，并经过归一化处理，以消除声压水平差异可能引发的大脑差异性反应。在完成斑胸草雀的MRI扫描准备并将其置于磁体孔道内（图1）后，即可进行fMRI数据采集。此外，还需获取一幅三维高分辨率图像，以便将数据标准化至斑胸草雀脑图谱⁹。最后，通过对数据进行预处理和统计分析，可实现对实验结果的可视化呈现（图6）。

讨论

本报告中，我们描述了一种优化的实验方案，用于在麻醉的斑胸草雀中对听觉刺激的神经基础进行详细的体内表征。

根据本方案，大多数使用BOLD fMRI进行的动物功能性脑激活研究，均在数据采集期间对动物实施麻醉。虽然也可以通过训练使动物适应磁体环境和扫描过程中的噪声，但这种方法耗时较长且具有挑战性，因此很少被采用。

尽管麻醉能够减轻应激对目标生理反应的影响并便于动物操作，但其对神经反应以及对神经活动与fMRI测量的BOLD反应之间传递函数的影响，仍是当前一项持续且重要的研究课题。因此，本实验室研究了麻醉对斑马雀在听觉刺激期间BOLD反应的影响 ²因此，研究了三种在斑马雀中广泛使用的麻醉剂——美托咪定、异氟烷和尿烷，它们作用于不同的神经递质系统。结果表明，在三种麻醉剂作用下，听觉刺激均能引发明显的BOLD反应，但在与以下方面相关的反应中，三种试剂之间存在细微差异 例如 激活区域的扩展。根据本研究的结果以及异氟烷在临床应用中最常使用这一事实——因其具有恢复相对较快和副作用较小的显著...

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
异氟烷麻醉剂	Isoflo	05260-05
PC-Sam 硬件/软件	SA-Instruments		http://www.i4sa.com
监测与门控系统		1025
磁共振兼容小型啮齿动物加热系统			型号 1025 兼容
直肠温度探针		RTP-102B	7英寸，0.044英寸
7T 磁共振成像仪	Bruker Biospin	PHS 70/16
Paravision 软件		5.1
梯度插入装置		BGA9S	400 mT/m，300A，500V
梯度放大器	Copley Co., USA	C256
发射共振器			内径：72 mm，仅发射，主动去耦
接收天线 - 20 mm 正交小鼠头部线圈			仅接收，主动去耦
WaveLab 软件	Steinberg
Praat 软件	Paul Boersma, 阿姆斯特丹大学		http://www.praat.org
非磁性动态扬声器	Visation, Germany	HK 150
光纤麦克风	Optoacoustics,	Optimic 1160
音频放大器	Phonic corporation	MM 1002a
呈现软件	Neurobehavioral Systems Inc.
MRIcro	Chris Rorden		http://www.cabiatl.com/mricro/mricro/
统计参数映射（SPM）	伦敦大学学院神经影像中心	8	http://www.fil.ion.ucl.ac.uk/spm/