可见光与庆大霉素对Pseudomonas aeruginosa微生物的协同作用

摘要

我们证明，一种采用连续或脉冲可见激光治疗并结合抗生素（庆大霉素）治疗的新型生物医学装置，可产生具有统计学显著性的协同效应，从而降低细胞活性 P. aeruginosa PAO1，比单独使用抗生素处理多降低了8个对数级。

摘要

最近有几篇关于可见光杀菌作用的出版物，其中大多数声称光谱中的蓝光部分（400 nm–500 nm）负责杀灭各种病原体^1-5。蓝光的光毒性效应被认为是由内源性细菌光敏剂在蓝光区域吸收光后诱导产生活性氧（ROS）所致^4,6,7。此外，也有报道指出红光和近红外光⁸以及绿光⁹具有生物杀灭效应。

在本研究中，我们建立了一种方法，可用于表征高功率绿色（波长为532 nm）连续（CW）和脉冲调Q（Q-S）光对Pseudomonas aeruginosa的作用效果。利用该方法，我们还研究了绿光联合抗生素（庆大霉素）处理对细菌活性的影响。P. aeruginosa是一种常见的医院获得性机会致病菌，可引起多种疾病。该菌株对多种抗生素具有较强耐药性，并含有大量预测的AcrB/Mex型RND多重药物外排系统¹⁰。

本方法采用在LB肉汤培养基中培养的自由生活静止期革兰氏阴性细菌（P. aeruginosa 菌株PAO1），分别在有或无抗生素庆大霉素存在的情况下，暴露于调Q脉冲激光和/或连续波激光。在不同时间点测定细胞活力。结果表明，与未处理对照组相比，单独激光处理并未降低细胞活力，而单独使用庆大霉素处理仅使P. aeruginosa的活菌数减少0.5个对数级。然而，激光与庆大霉素联合处理则产生了协同效应，使P. aeruginosa的存活率降低了8个对数级。

该方法还可通过开发一种类似导管的装置来进一步实施，该装置能够在用光照射感染器官区域的同时，将抗生素溶液注入该区域。

方案

1. 细菌培养

1. 将革兰氏阴性菌 P. aeruginosa 菌株 PAO1 在 LB（Luria Broth）培养基中，37 °C 下培养 18 小时。
2. 随后以 7,500 rpm（每分钟转数）离心菌液 5 分钟，并弃去上清液。
3. 将细菌重悬于 10% LB 培养基中，再次培养 2 小时，使菌液重新进入稳定期。
4. 将细菌悬液分为两组：第一组（2 支试管）不添加抗生素，第二组加入庆大霉素（gentamycin，50 μg/ml）。

2. 菌落形成单位（CFU）的测定

1. 为测定细胞活力，在24小时的时间范围内，大约每2小时从实验中取20 μl样品。对样品进行系列稀释后，涂布于LB琼脂平板上，并在37 °C下过夜培养。
2. 针对每种处理，测定每个平板上的菌落形成单位（CFU），并比较不同时间点及不同处理之间的差异。CFU的对数减少值按公式(1)计算：
   对数减少值 = LogU - LogC [CFU/ml]
   其中U为各时间点的菌落形成单位数值；CFU为菌落形成单位，CFU/ml的单位计算如下：
   CFU/ml = （菌落数 × 稀释倍数）/ 接种体积
   C为初始时间对照样品中的CFU值。注意，U表示测量时刻的菌落形成单位数值。
3. 稀释倍数是指稀释次数，每次稀释使细菌浓度降低10倍。接种体积始终为200微升，与我们所用试管的尺寸相关。

因此，从浓度角度来看，庆大霉素抗生素的浓度为 50 μg/ml。关于细菌样本，在整个实验过程中共进行了 8 次稀释。每次稀释倍数为 10 倍，操作在 200 μl 的离心管中进行。起始步骤是将 20 μl 样本加入 200 μl 的离心管中（因此初始浓度为 20/200C）₀=0.1C₀，其中 C₀ 为₀ 初始浓度为20 μl样品中的浓度，由于经过8次稀释，最终浓度降低了8个数量级。

3. 照明

1. 使用光学50%/50%分束器将连续波Nd:YAG激光器（波长532 nm，平均光功率200 mW）分为两束光路。光束直径约为10 mm。照射持续时间为24小时。
2. 调Q脉冲Nd:YAG激光器（波长532 nm，平均功率300 mW，光峰值功率2.5 MW）也通过光学50%/50%分束器分为两束光路。光斑直径为6 mm。调Q激光器的脉冲宽度为6 nsec，重复频率为15 Hz。平均功率密度为106 mW/cm²，峰值功率密度为8.83 kW/mm²。照射持续时间为24小时。

注意，在照射过程中需搅拌细菌悬液，并将其置于适宜的培养条件下以利于细菌生长（所有试管中均含有LB培养基，以支持细菌生长）。

结果

基于激光的实验装置示意图见图1。第一种实验条件使用了一台波长为532 nm（Nd:YAG的第二谐波）且平均光功率为200 mW的连续波Nd:YAG激光器。该光束通过一个50%/50%的光学分束器被分为两束，使每束分出的光束功率为100 mW。光束直径约为10 mm，因此功率密度约为100 mW/cm²。照射持续时间为24小时。尽管光照功率相对较高，但不足以引起样品的加热。

第二个实验条件采用了一台波长为532 nm（第二谐波）、光斑直径为6 mm的Q开关脉冲Nd:YAG激光器。平均功率为300 mW，光学峰值功率为2.5 MW。Q开关激光器的脉冲宽度为6 nsec，重复频率为15 Hz。该光束也通过一个50%/50%的光学分束器分为两束。平均功率密度约为100 mW/cm²，峰值功率密度为8.83 kW/mm²。该峰值功率密度相当于每脉冲88.3 μJ/mm²的能量通量，因为在时域中每个脉冲持续时间为10 nsec。照射持续时间为24小时。两个实验均在相似的生长...

讨论

近年来，光疗已成为一个先进的多学科研究领域，作为一种有前景的多种疾病治疗方法不断涌现。在此背景下，可见光范围内的光的使用已得到广泛研究。例如，研究发现，通过将感染性伤口暴露于强可见光下以实现消毒，可更有效地促进伤口愈合。该方法的作用机制已被证实是通过诱导光生氧自由基（ROS）来杀灭细菌¹¹。

先前的研究⁶表明，与红光和近红外光照射相比，蓝光照射的细菌会产生更高水平的活性氧（ROS）。这解释了为何文献中的大多数证据都集中在蓝光的杀菌作用上。

另一个近期利用激光光对抗耐药细菌的实例由Krespi展示 等¹²在该研究中，利用激光产生的冲击波技术来清除生物膜。通过使用微型调Q开关Nd:YAG激光器和细小光纤，特殊探头产生等离子体形成，进而引发冲击波效应。作者表明，该方法能够有效破坏生物膜 P. aeruginosa 生物膜 体外.

本研究中我们采用的方法略有不同...

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
劳里亚肉汤	Difco	241420
庆大霉素	Sigma	G1914
细菌琼脂	Difco	231710