利用两种不同方法分离、鉴定及比较源自恒牙的人牙髓干细胞的分化特性

摘要

所述方法通过使用以下任一方式分离和表征人牙髓干细胞（hDPSCs） 牙髓组织的酶解离（DPSC-ED） 或 牙髓组织外植体中干细胞的直接迁出（DPSC-OG）。随后 体外 两种hDPSCs向成牙本质细胞的比较性分化。

摘要

发育中的智齿是成年后易于获取的干细胞来源，可通过常规正畸治疗获得。与普通的成体干细胞来源相比，人牙髓来源干细胞（hDPSCs）具有较高的增殖潜能和多向分化能力^1-8；因此，hDPSCs 可作为组织工程和再生医学中自体移植的理想候选细胞。此外，hDPSCs 还具备间充质干细胞（MSC）的特性，例如免疫调节作用，这使其在同种异体移植中也具有更高的应用价值^6,9,10。因此，利用此类干细胞来源的首要步骤是选择从牙髓组织中分离 hDPSCs 的最佳方案。为实现这一目标，至关重要的是研究不同分离条件对细胞多种行为的影响，例如其常见的表面标志物以及分化能力。

因此，本文从阻生第三磨牙中分离人类牙髓组织，然后依据文献中的现有方案分离hDPSCs。^11-13 即 牙髓组织的酶解离法（DPSC-ED）或组织外植块迁移法（DPSC-OG）。在此方面，我们尝试利用牙科金刚砂片来优化细胞分离方法。随后，对这些细胞进行了间充质相关标志物（CD73、CD90、CD105）的表征 & CD44）、造血/内皮细胞标志物（CD34、CD45） & CD11b）、血管周标记物（如CD146）以及STRO-1。随后，通过定量聚合酶链式反应（QPCR）比较这两种方案在向成牙本质细胞分化潜能方面的差异 & 茜素红染色。采用qPCR检测矿化相关基因（碱性磷酸酶；ALP，细胞外基质磷糖蛋白；MEPE）的表达水平。 & 牙本质唾液酸磷蛋白；DSPP)¹⁴

引言

干细胞是具有克隆形成能力的细胞，具备两种显著特性，即多能性和自我更新能力¹⁵在所有具有不同增殖能力的干细胞中，牙源性干细胞作为出生后的干细胞，近年来因其易于获取、较强的可塑性以及相较于其他成体干细胞更高的增殖能力而受到广泛关注¹⁶典型地，牙髓干细胞与间充质干细胞相似，均为具有克隆形成能力的贴壁细胞，可向间充质及/或非间充质谱系多向分化 体外 和 体内.^1-8,17,18 DPSCs 通过其对造血抗原的阴性表达来鉴定（例如CD45、CD34、CD14阴性，且表达CD90、CD29、CD73、CD105、CD44和STRO-1。^19,20

易于获得且疼痛最小的潜力 & 发病率使得人牙髓干细胞（DPSCs）相较于常规来源（如骨髓间充质干细胞）成为一种更有价值的间充质干细胞来源²¹通常，牙髓干细胞（DPSCs）可通过组织块贴壁法分离， 即牙髓组织外植体中干细胞的迁移（DPSC-OG）^22-24和/或酶消化法（DPSC-ED）^4,6,25先前的研究表明，分离方法和培养条件可诱导产生不同的细胞群体或谱系 体外 传代^26,27。对于恒牙（pDPSCs），Huang 等 结果显示，酶消化法获得的pDPSCs比组织....

方案

1. 准备酶溶液和增殖培养基（PM）

1. 配制 I 型胶原酶溶液：称取 I 型胶原酶（12 mg/ml），溶于 1 ml PBS 中，并使用 0.2 μm 注射器滤器过滤。然后将其转移至 15 ml 离心管中，于 -20 °C 保存备用。
2. 配制分散酶溶液：称取分散酶（16 mg/ml），溶于 1 ml PBS 中，并使用 0.2 μm 注射器滤器过滤。然后将其转移至 15 ml 离心管中，于 4 °C 保存备用。
3. 配制酶解溶液：将 1 ml I 型胶原酶溶液（12 mg/ml）和 1 ml 分散酶溶液（16 mg/ml）加入含 100 mg/ml 青霉素和 100 mg/ml 链霉素的 2 ml 无菌 PBS 中。最终体积中分散酶和 I 型胶原酶的浓度应分别为 4 mg/ml 和 3 mg/ml。随后，将该溶液分装至四个 15 ml 离心管中，每管含 1 ml 酶解溶液。每管可用于一次牙髓组织消化。
4. 配制洗涤液：将 100 mg/ml 青霉素和 100 mg/ml 链霉素加入 PBS 中。
5. 配制基础培养基：在添加 10% 胎牛血清（FBS）以及 100 单位/ml 青霉素和 100 mg/ml 链霉素的 Eagle's 培养基 α 改良型（α-MEM）中配....

结果

1. 通过酶解离法获得的牙髓干细胞（DPSC-ED）在第10、15、18天的形态如图1所示。 菌落几乎在分离后3至5天开始形成。
2. 外植块法获得的牙髓干细胞（DPSC-OG）在第5、10、13和18天的形态如图2所示。 接种后约5天，成纤维细胞样细胞开始从牙髓组织迁移至培养瓶中，并呈平行排列。
3. 两种方法获得的第3代牙髓干细胞如图3所示。 两种类型的牙髓干细胞在大小和形态上几乎相同。
4. DPSC-ED与DPSC-OG的免疫表型分析结果如图4所示。 结果显示，细胞表达间充质干细胞标志物，如CD44、CD73、CD105和CD90，而不表达造血及内皮细胞标志物，如CD34、CD45和CD11b。与DPSC-ED相比，DPSC-OG中CD105和CD146（血管周标志物）的表达水平更高。两组中STRO-1均为阴性。（蓝色曲线代表OG组，红色曲线代表ED组，黄色曲线为同型对照。）
5. 第21天DPSC-ED与DPSC-OG矿化组织形成的茜素红S染色形.......

讨论

本方案描述了使用两种方法从牙髓中分离和表征人牙髓干细胞（hDPSCs）的过程：酶消化法和牙髓组织外植块直接爬出法。此外， 体外 通过定量茜素红S染色法评估这些细胞向成牙本质细胞的分化情况 & qPCR

既往用于从人类牙齿中分离牙髓组织的方案曾使用多种器械，如钳子（骨用镊）⁹、拔髓针²⁹、Gracey 刮治器³⁰、牙科裂钻⁴等。这些方法在持续加水以减少牙髓过热的前提下，仍耗时较长。然而，在当前的技术中，采用牙科金刚砂片进行牙髓组织的分离，这是一种快速、一步式切割牙齿的方法，可最大程度减少污染，并在切割过程中将牙髓过热降至最低。此外，人牙髓干细胞（hDPSCs）最终可分化为成牙本质细胞，而针对恒牙来源的hDPSCs，此前尚未就本文所述目的进行过此类比较。通过定量茜素红S染色法对分化后的hDPSCs（ED组与OG组）进行比较评估，结果显示hDPSC-ED组的矿化潜能高于OG组。这些结果也通过定量PCR（QPCR）得到了验证。在两组细胞向成牙本质细胞分化后，矿化相关标志物DSP.......

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
α-MEM	GIBCO	11900-073
I型胶原酶	Sigma-Aldrich	C0130-100MG
中性蛋白酶	GIBCO	17105-041
青霉素/链霉素	GIBCO	15140-122
两性霉素B	GIBCO	15290-018
定义型胎牛血清（FBS）	HyClone	SH30070.03
L-抗坏血酸-2-磷酸	Sigma	A8960-5G
L-谷氨酰胺	GIBCO	25030-024
地塞米松	Sigma	D4902
β-甘油磷酸二钠盐水合物，BioUltra	Sigma	G9422-100G
磷酸二氢钾	Sigma-Aldrich	P5655
成骨检测试剂盒	Millipore	PS01802031
小鼠IgG2b-PE同型对照	BD pharmingen	50808088029
FITC标记的小鼠IgG2b同型对照	BD pharmingen	559532
FITC标记的小鼠IgG1 κ 同型对照	BD pharmingen	11471471
FITC/PE标记的小鼠抗人CD34/CD45抗体	BD pharmingen	341071
PE标记的抗人CD146抗体	BD pharmingen	550315
单克隆小鼠抗人CD90/FITC抗体	Daka	00034418
PE标记的小鼠抗人CD73抗体	BD pharmingen	550257
抗人CD105/Endoglin PE抗体	BD pharmingen	FAB10971P
PE标记的小鼠抗人CD11b/Mac1抗体	BD pharmingen	5553888
CD44 PE标记的小鼠抗人抗体	BD pharmingen	555479
磷酸盐缓冲液（PBS）	GIBCO	003000
70-μm细胞筛	Falcon	352360
0.2 μm注射器滤器	Millex-GV	SLGV033RB
25 cm2培养瓶	Sigma-Aldrich	Z707481
仪器设备
BD FACSCalibur	BD	342975
Multiskan微孔板分光光度计	Thermo scientific	51119200
荧光显微镜	Olympus
Flowing Software版本2.3.1