人牙髓干细胞的分离，鉴定和比较性恒牙使用两种不同的方法，得出

Summary

通过使用所描述的方法分离和鉴定人牙髓干的细胞（hDPSCs）或比较分化成成牙本质细胞。

Introduction

干细胞是细胞克隆细胞具有两个显着的特点，被称为多潜能和自我更新^15。在所有的干细胞不同的复制效力，牙齿干细胞的产后干细胞引起的关注，近年来，因为其可访问性，可塑性强，高增殖能力比较与其他成体干细胞^16。典型地，类似的间充质干细胞，牙髓干细胞粘附的克隆形成有多个成间充质细胞的分化能力和/或非间充质细胞谱系，无论是在体外和体内的细胞，这些细胞^。1-8,17,18稳干细胞鉴定阴性表达造血抗原（ 如 CD45，CD34，CD14），阳性表达的CD90，CD29，CD73，CD105，CD44和^{STRO-1。19,20}

容易获得潜在的疼痛和发病率最低，作为一个有价值的人DPSCS能源间充质干细胞相比普通的来源，如骨髓间充质干细胞^21。在一般情况下，稳干细胞已被分离由任何生长的方法， 即 ，从的牙髓组织外植体^{（DPSC-OG）22-24，}和/或酶消化^{4,6,25（DPSC-ED）}的干细胞的迁移。以往的研究表明，隔离方法和培养条件下，可以吸引不同的人群或谱系体外通道^26,27。在的箱子恒牙（pDPSCs），Huang 等人透露，酶消化pDPSCs超越全部牙髓之中相比，有较高的增殖潜力^，26此外，在箱子乳牙（dDPSCs），它表明一个STRO-1及CD34的标记表示在比较更多的dDPSC-ED与dDPSC-OG。此外，dDPSC-ED显示定义的骨/ odonto介质的高矿化率在²⁷因此，由于出色的潜力DPSCS在regenerative药，将有更多的研究，以更好地了解可能来自不同的隔离方法不同人群的需要。

在这里，它是尝试引入纸浆提取的简单的方法，通过使用一步牙科金刚石盘以方便处理纸浆提取。此外，在申请ED或OG方法的人牙髓源性干细胞的分离，两组间的一般特性及分化能力进行了调查。

Protocol

1。准备的酶液和增殖培养基（PM）

1. 车型胶原酶类型I解:称出I型胶原酶（12毫克/毫升），并溶解在1ml PBS及过滤器，用0.2μm注射器过滤器。然后将其放在15毫升的试管，并保持在-20℃，直到需要。
2. 使分散酶解:称取分散酶（16毫克/毫升），并溶解在1毫升的PBS及过滤器，用0.2μm注射器过滤器。然后将其放在15毫升的试管，并保持在4℃直至需要。
3. 酶溶液:加入到2毫升无菌PBS中含有100毫克/ ml青霉素，100毫克/ ml链霉素1毫升胶原酶I型溶液（12毫克/毫升）和1毫升分散酶解决方案（16毫克/毫升）。最终成交量为纯净和胶原酶我总含量应为4毫克/毫升和3毫克/毫升，容易接受。然后，分装到4个15毫升的试管，每片含1毫升酶溶液。此卷每个管可以用于一个纸浆的蒸解。
4. 使清洗溶液:加入100毫克/ ml青霉素，100毫克/毫升链霉素的PBS中。
5. 车型基本培养基:阿尔法修改的Eagle培养基（α-MEM），补充有10％FBS及100单位/ ml青霉素，100毫克/毫升链霉素。
6. 设为的扩散介质（PM）:阿尔法修改的Eagle氏培养基（α-MEM）辅以10％胎牛血清，100μML-抗坏血酸-2 -磷酸，2 mM的L-谷氨酰胺，100单位/ ml青霉素，100毫克/毫升0.25毫克/毫升链霉素，两性霉素B。
7. 车型牙源性媒体:阿尔法修改的Eagle氏培养基（α-MEM）补充有10％胎牛血清，100μML-抗坏血酸-2 -磷酸，2 mM的L-谷氨酰胺，100单位/ ml青霉素，100毫克/ ml链霉素，0.01μM地塞米松，5mM的β-甘油磷酸，1.8 mM的磷酸二氢钾。

2。准备人牙髓组织中牙髓干细胞Isolatio的Ň

1. 正常的人类第三磨牙的成年人（21-29岁）下认可的机构审查委员会（IRB）的伊玛目阿里在牙科诊所。
2. 牙齿被置于基本培养基（α-MEM培养基补充有10％FBS），在4℃下，并转移到实验室
3. 在无菌条件下，一个生物危害的层流罩内工作，设置被完成一个100毫米的培养皿中，以被处理的每个齿。齿面，用70％乙醇清洗。
4. 虽然工作在一个培养皿，牙齿保持的牙科镊子和一个手术刀，清洁碎片和牙周膜的根上。
5. 釉牙骨质交界处慢慢减少使用消毒的牙科盘揭示牙髓腔。它应该被认为必须缓慢进行，切割过程中的牙齿组织，以减少过热。
6. 轻轻分开的牙冠和牙根的牙髓组织。
7. 牙髓组织切成小块与援助的手术刀刀片。

3。人牙髓隔离的

1. 牙髓组织进行的hDPSCs隔离的牙髓组织的外植体牙髓组织或细胞直接产物无论是酶解。
2. 牙髓组织的酶分解:
   1. 牙髓组织的小片的酶溶液在37℃下1小时，转移到涡，每30分钟到分手组织。
   2. 后来被拆除，大细胞聚集和单细胞悬浮液，通过细胞通过一个70μM细胞的过滤器。
   3. 单细胞悬浮液，在1,200 rpm下离心5分钟，在室温下。
   4. 上清液仔细移液和沉淀物重新悬浮在1ml的增殖培养基（PM）的。 （ 注:FBS增殖培养基终止酶的显示解离）。
   5. 单细胞悬浮液接种到25cm ^2的培养瓶中用PM牙髓，然后在5％CO ₂在37℃下孵育。
   6. 培养基中被改变，直到细胞汇合实现每三天。
3. 直接从牙髓组织的外植体细胞的产物:
   1. 牙髓组织切碎成1-2毫米的碎片，每片被放置在个25-cm ²培养瓶中用PM，然后温育在37℃下在5％CO _2。它应被视为细胞产物，总体积的PM必须支持进一步的细胞生长（2-3毫升按每烧瓶）的纸浆片的安装。
   2. 换液后的产物观察。
   3. 超越在汇合的细胞子的比率为1:4（通道1）培养。

4。免疫表

1. 250,000细胞/管的这两种类型的细胞在通道3由PE或FITC标记的抗人用自己的同种型的抗体温育30分钟，于4℃下在黑暗的地方。 （ 注:施加的抗体浓度根据制造协议。）
2. 的孵育时间后，加入100μlPBS或FACS稀释液加入到每个试管中，并在1,200 rpm下离心5分钟，在黑暗的地方。
3. 除去上清液与沉淀物重新悬浮于100μl的PBS或FACS稀释在黑暗的地方。
4. 有针对性的表面标志物（CD标记）BD FACSCalibur进行了评价。

5。矿化细胞诱导分化的DPSCS量化的茜素红S含量

1. 牙髓组织任酶解（称为作为DPSC-ED）或直接的细胞生长自牙髓组织的外植体（DPSC-OG），通过以下方式获得的全部牙髓之中子培养第3代。
2. 一吨第3代，将细胞种子到6孔板中，以5,000细胞/孔。
3. 在60％的汇合，牙源性介质取代以往的PM。三个孔作为阴性对照，加入生长培养基中保持。
4. 换液，每3天至21天。
5. 在第21天，将细胞用PBS洗涤，1ml /孔，在室温下的15分钟的10％多聚甲醛固定。
6. 然后，多聚甲醛，用移液管关闭，仔细和细胞洗涤3次（每次5-10分钟）用蒸馏水，H _{2 O。} （ 注:避免干扰单层。）
7. 在洗涤后，1ml /孔茜素红S中加入在室温下20分钟。
8. 由去离子H _{2 O} 4次（每次5分钟，用温和的摇摆）洗涤细胞以除去任何额外的茜素红。
9. 1ml /孔中加入H _{2 O，}以防止细胞干燥。
10. 板被假定为视觉插件pection和/或图像采集。
11. 茜素红S的定量测定对于由1毫升10％乙酸到6孔板与在室温下振摇孵育30分钟的各孔中，H _{2 O}取代。
12. 然后，单层细胞/孔分别为刮＆醋酸及细胞被转移到单独的1.5毫升微量离心管。 （ 注:每口井应该转移到一个单独的管即三个测试井和三个控制井为每个ED＆OG组。）
13. 管被涡旋大力，持续30秒。
14. 加热至85℃，持续10分钟。 （ 注:为避免蒸发，管密封，封口膜）。
15. 加热结束后，将试管转入冰浴5 min。 （ 注 :管不应该被打开，直至成为冷却）。
16. 浆料在20,000 xg离心15分钟，离心分离。在离心过程中，茜素红的标准了。

茜素红S的标准制备首先通过的稀释缓冲液稀释，及用于基于该表的2 - 倍系列稀释。

高浓度范围内的染料

低浓度范围内的染料

2毫米

1毫米

500μM

250μM

125μM

62.5μM

31.3μM

15.6μM

7.8μM

3.9μM

1.9μM

0.9μM

0.4μM

空白

16. 离心后，被转移到新的，独立的1.5毫升微量离心管1毫升上清液/管。
17. 将pH中和〜375微升10％氢氧化铵，按每管的。 （ 注:pH值的愤怒应该是4.1-4.5）。
18. 一个不透明的壁透明底96孔板中加入150μl的标准样品（包括单独的测试及控件）。
19. 读出在405nm处的吸光度，并从样品的OD值相比，标准样地，作进一步的分析。

Results

1. 酶解（DPSC-ED）是通过以下方式获得的全部牙髓之中这里示出在第10天，15,18（图1）。发起的菌落上形成几乎为3至5天之后，隔离。
2. 超越DPSCS（DPSC-OG），如图2所示。成纤维细胞样细胞开始从牙髓组织迁移到烧瓶平行订购了近5天播种后5天，10日，13日及18。
3. 全部牙髓之中使用这两种方法在通道3的图3中所示，这两种类型的稳干细胞几乎相同的大小及形态。
4. 免疫DPSC-ED和DPSC-OG（图4）中的结果，这些结果表明的存在的间充质干细胞的标志物，例如CD44，CD73，CD105和CD90，和没有造血及内皮标志物，例如CD34，CD45及CD11b表达的情况下。 DPSC-OG比较DPSC-ED的表达CD105和CD146（血管周围的标记）。STRO-1呈阴性两组。 （蓝线OG组，而红色线，黄线表示简称ED 1亚型）。
5. 茜素红S的表面形态，DPSC-ED和DPSC-OG矿化组织的形成，在第21...

Discussion

该协议描述了hDPSCs牙髓使用两种方法，酶解和牙髓组织的外植体干细胞的直接产物的分离和鉴定。此外， 在这些细胞的体外分化成成牙本质细胞，通过茜素红S的定量测定＆QPCR评估。

现有的协议，用于隔离从人类牙齿的牙髓组织已被用于各种仪器，如钳子（骨镊子）9，摘除手术中，针^29，格雷西刮匙^30，牙科裂缝毛刺^4，等，这些方法是耗时的，而考虑水平低纸浆通过连续加入水过热。然而，在目前的技术中，牙科用金刚石圆盘用于牙髓组织的隔离，这是一种快速的方式来减少一个步骤的过程中以最小的污染的齿，并最大限度地减少的切削过程中纸浆的过热。此外，hDPSCs一个重新最后已从来没有人恒牙讨论的目的的情况下相比的成牙本质细胞分化成。比较差异化hDPSCs评估（ED＆OG组）定量茜素红S的分析表明，较高的矿化潜力的hDPSC-ED与OG组相比。这些结果也证实了QPCR。 DSPP，ALP和MEPE的矿化标记上调后的成牙本质细胞分化在这两个群体。另一方面，MEPE和碱性磷酸酶（ALP）的表达均高于，在分化hDPS...

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
的试剂的名称	公司	目录或地段。数	评论（可选）
的α-MEM	GIBCO	11900-073
I型胶原酶	Sigma-Aldrich公司	C0130-100MG
中性蛋白酶	GIBCO	17105-041
青霉素/链霉素	GIBCO	15140-122
两性霉素B	GIBCO	15290-018
定义胎牛血清（FBS）	胎牛血清	SH30070.03
L-抗坏血酸-2 - 磷酸	西格玛	A8960-5G
L-谷氨酰胺	GIBCO	25030-024
地塞米松	西格玛	D4902
β-甘油磷酸二钠盐水合物，BioUltra	西格玛	G9422-100G
磷酸二氢钾	Sigma-Aldrich公司	P5655
成骨检测试剂盒	密理博	PS01802031
同型对照小鼠IgG2b-PE	BD Pharmingen公司	50808088029
FITC小鼠IgG2b同种型控制	BD Pharmingen公司	559532
FITC小鼠IgG1κ型	BD Pharmingen公司	11471471
FITC / PE的小鼠抗人CD34/CD45	BD Pharmingen公司	341071
PE抗人CD146	BD Pharmingen公司	550315
单克隆小鼠抗人CD90/FITC	特嘉	00034418
PE的小鼠抗人CD73	BD Pharmingen公司	550257
抗H CD105/Endoglin PE的	BD Pharmingen公司	FAB10971P
PE的小鼠抗人CD11b/Mac1	BD Pharmingen公司	5553888
小鼠抗人CD44 PE	BD Pharmingen公司	555479
磷酸盐缓冲溶液（PBS）中	GIBCO	003000
70微米的细胞过滤器	鹰	352360
0.2微米针头式过滤器	新型Millex-GV	SLGV033RB
25厘米2的培养瓶中	Sigma-Aldrich公司	Z707481
			设备
BD FACSCalibur	BD	342975
multiskan微孔板分光光度计	Thermo Scientific的	51119200
Fleurcense显微镜	奥林巴斯
流动软件版本2.3.1