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方法文章

利用两种不同方法分离、鉴定及比较源自恒牙的人牙髓干细胞的分化特性

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DOI：

10.3791/4372

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2012年11月24日

 ,  , 
1Department of Stem Cells and Developmental Biology, Cell Science Research Center, Royan Institute for Stem Cell Biology and Technology, ACECR, Tehran, Iran, 2Department of Endocrinology & Female Infertility, Reproductive Biomedicine Center, Royan Institute for Reproductive Biomedicine, ACECR, Tehran, Iran

本文内容

摘要

所述方法通过使用以下任一方式分离和表征人牙髓干细胞（hDPSCs） 牙髓组织的酶解离（DPSC-ED） 或 牙髓组织外植体中干细胞的直接迁出（DPSC-OG）。随后 体外 两种hDPSCs向成牙本质细胞的比较性分化。

摘要

发育中的智齿是成年后易于获取的干细胞来源，可通过常规正畸治疗获得。与普通的成体干细胞来源相比，人牙髓来源干细胞（hDPSCs）具有较高的增殖潜能和多向分化能力1-8；因此，hDPSCs 可作为组织工程和再生医学中自体移植的理想候选细胞。此外，hDPSCs 还具备间充质干细胞（MSC）的特性，例如免疫调节作用，这使其在同种异体移植中也具有更高的应用价值6,9,10。因此，利用此类干细胞来源的首要步骤是选择从牙髓组织中分离 hDPSCs 的最佳方案。为实现这一目标，至关重要的是研究不同分离条件对细胞多种行为的影响，例如其常见的表面标志物以及分化能力。

因此，本文从阻生第三磨牙中分离人类牙髓组织，然后依据文献中的现有方案分离hDPSCs。11-13 即 牙髓组织的酶解离法（DPSC-ED）或组织外植块迁移法（DPSC-OG）。在此方面，我们尝试利用牙科金刚砂片来优化细胞分离方法。随后，对这些细胞进行了间充质相关标志物（CD73、CD90、CD105）的表征 & CD44）、造血/内皮细胞标志物（CD34、CD45） & CD11b）、血管周标记物（如CD146）以及STRO-1。随后，通过定量聚合酶链式反应（QPCR）比较这两种方案在向成牙本质细胞分化潜能方面的差异 & 茜素红染色。采用qPCR检测矿化相关基因（碱性磷酸酶；ALP，细胞外基质磷糖蛋白；MEPE）的表达水平。 & 牙本质唾液酸磷蛋白；DSPP)14

引言

干细胞是具有克隆形成能力的细胞，具备两种显著特性，即多能性和自我更新能力15在所有具有不同增殖能力的干细胞中，牙源性干细胞作为出生后的干细胞，近年来因其易于获取、较强的可塑性以及相较于其他成体干细胞更高的增殖能力而受到广泛关注16典型地，牙髓干细胞与间充质干细胞相似，均为具有克隆形成能力的贴壁细胞，可向间充质及/或非间充质谱系多向分化 体外 和 体内.1-8,17,18 DPSCs 通过其对造血抗原的阴性表达来鉴定（例如CD45、CD34、CD14阴性，且表达CD90、CD29、CD73、CD105、CD44和STRO-1。19,20

易于获得且疼痛最小的潜力 & 发病率使得人牙髓干细胞（DPSCs）相较于常规来源（如骨髓间充质干细胞）成为一种更有价值的间充质干细胞来源21通常，牙髓干细胞（DPSCs）可通过组织块贴壁法分离， 即牙髓组织外植体中干细胞的迁移（DPSC-OG）22-24和/或酶消化法（DPSC-ED）4,6,25先前的研究表明，分离方法和培养条件可诱导产生不同的细胞群体或谱系 体外 传代26,27。对于恒牙（pDPSCs），Huang 等 结果显示，酶消化法获得的pDPSCs比组织块爬出法获得的DPSCs具有更高的增殖潜能。26 此外，对于乳牙（dDPSCs），已证明STRO-1 & 与dDPSC-OG相比，dDPSC-ED中CD34标志物表达更高。此外，在特定的成骨/成牙本质培养基中，dDPSC-ED表现出更高的矿化率。27 因此，由于牙髓干细胞（DPSCs）在再生医学中具有巨大潜力，需要开展更多研究以深入理解通过不同分离方法获得的各种细胞群体。

本研究尝试采用单步法牙科金刚砂片来简化牙髓提取过程，以促进牙髓组织的获取。此外，在应用ED法或OG法分离获得人牙髓来源干细胞后，还对两组细胞的一般特性及分化能力进行了比较研究。

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方案

1. 准备酶溶液和增殖培养基（PM）

  1. 配制 I 型胶原酶溶液：称取 I 型胶原酶（12 mg/ml），溶于 1 ml PBS 中，并使用 0.2 μm 注射器滤器过滤。然后将其转移至 15 ml 离心管中，于 -20 °C 保存备用。
  2. 配制分散酶溶液：称取分散酶（16 mg/ml），溶于 1 ml PBS 中，并使用 0.2 μm 注射器滤器过滤。然后将其转移至 15 ml 离心管中，于 4 °C 保存备用。
  3. 配制酶解溶液：将 1 ml I 型胶原酶溶液（12 mg/ml）和 1 ml 分散酶溶液（16 mg/ml）加入含 100 mg/ml 青霉素和 100 mg/ml 链霉素的 2 ml 无菌 PBS 中。最终体积中分散酶和 I 型胶原酶的浓度应分别为 4 mg/ml 和 3 mg/ml。随后，将该溶液分装至四个 15 ml 离心管中，每管含 1 ml 酶解溶液。每管可用于一次牙髓组织消化。
  4. 配制洗涤液：将 100 mg/ml 青霉素和 100 mg/ml 链霉素加入 PBS 中。
  5. 配制基础培养基：在添加 10% 胎牛血清（FBS）以及 100 单位/ml 青霉素和 100 mg/ml 链霉素的 Eagle's 培养基 α 改良型（α-MEM）中配制基础培养基。
  6. 配制增殖培养基（PM）：在添加 10% 胎牛血清（FBS）、100 μM L-抗坏血酸-2-磷酸、2 mM L-谷氨酰胺、100 单位/ml 青霉素、100 mg/ml 链霉素和 0.25 mg/ml 两性霉素 B 的 Eagle's 培养基 α 改良型（α-MEM）中配制增殖培养基。
  7. 配制成牙本质细胞诱导培养基：在添加 10% 胎牛血清（FBS）、100 μM L-抗坏血酸-2-磷酸、2 mM L-谷氨酰胺、100 单位/ml 青霉素、100 mg/ml 链霉素、0.01 μM 地塞米松、5 mM β-甘油磷酸钠和 1.8 mM 磷酸二氢钾的 Eagle's 培养基 α 改良型（α-MEM）中配制成牙本质细胞诱导培养基。

2. 准备人牙髓组织以分离牙髓干细胞

  1. 在获得机构审查委员会（IRB）批准的情况下，从 Imam Ali 牙科诊所的成年患者（21–29 岁）处收集正常人类第三磨牙。
  2. 将牙齿置于基础培养基（添加 10% FBS 的 α-MEM）中，并在 4 °C 条件下转运至实验室。
  3. 在无菌条件下，于生物安全型层流罩内操作，为每颗待处理的牙齿准备一个 100 mm 的培养皿。使用 70% 乙醇清洁牙齿表面。
  4. 在其中一个培养皿中操作时，用牙科镊子固定牙齿，并用手术刀片清除根部的碎屑和牙周韧带。
  5. 使用灭菌牙科切割片缓慢切割釉质-牙骨质交界处，以暴露牙髓腔。应注意切割过程应缓慢进行，以减少牙体组织过热。
  6. 轻柔地将牙髓组织从牙冠和牙根上分离。
  7. 借助手术刀片将牙髓组织切成小块。

3. 人牙髓的分离

  1. 牙髓组织采用酶消化法解离或通过牙髓组织外植块直接细胞爬出法分离人牙髓干细胞（hDPSCs）。
  2. 牙髓组织的酶消化法：
    1. 将少量牙髓组织转移至酶溶液中，在37 °C下孵育1小时，每30分钟涡旋振荡一次以促进组织解离。
    2. 随后去除较大的细胞团块，通过70-μm细胞筛网过滤获得单细胞悬液。
    3. 将单细胞悬液在室温下以1,200 rpm离心5分钟。
    4. 小心吸除上清液，沉淀物用1 ml增殖培养基（PM）重悬。（注意： 增殖培养基中的FBS可终止酶消化反应。）
    5. 将牙髓单细胞悬液接种至含PM的25 cm2培养瓶中，于37 °C、5% CO2条件下培养。
    6. 每隔三天更换一次培养基，直至细胞达到汇合状态。
  3. 牙髓组织外植块直接细胞爬出法：
    1. 将牙髓组织剪切成1–2 mm大小的碎片，每块组织置于含PM的25 cm2培养瓶中，于37 °C、5% CO2条件下培养。应注意，用于细胞爬出的PM总体积需足以支持牙髓组织碎片的贴壁及后续细胞爬出（每瓶2–3 ml）。
    2. 观察到细胞爬出后更换培养基。
    3. 细胞汇合后按1:4比例进行传代培养（第1代）。

4. 免疫表型分析

  1. 将第3代的两种细胞各250,000个/管，分别与PE或FITC标记的抗人抗体及其同型对照抗体在4 °C避光条件下孵育30分钟。（注意： 抗体浓度按照制造商说明书推荐使用。）
  2. 孵育结束后，每管加入100 μl PBS或FACS稀释液，避光条件下以1,200 rpm离心5分钟。
  3. 弃去上清液，将沉淀物重新悬浮于100 μl PBS或FACS稀释液中，操作过程保持避光。
  4. 通过BD FACSCalibur仪器检测目标表面标志物（CD标志物）。

5. 牙髓干细胞向矿化细胞分化的诱导及茜素红S染色定量分析

  1. 通过酶解离牙髓组织（称为DPSC-ED）或从牙髓组织外植体直接细胞迁移获得的牙髓干细胞（DPSCs）均进行了连续3代的传代培养。
  2. 第3代时，将细胞以每孔5,000个细胞的密度接种至6孔板中。
  3. 当细胞融合度达到60%时，将成牙本质诱导培养基更换为常规的PM培养基。另设三个孔加入生长培养基作为阴性对照。
  4. 每3天更换一次培养基，直至第21天。
  5. 第21天，用PBS洗涤细胞，在室温下用1 ml/孔10%多聚甲醛固定15分钟。
  6. 然后用移液管小心吸去多聚甲醛，并用蒸馏水将细胞洗涤3次（每次5–10分钟）。2O. (注意： 避免扰动单层细胞。
  7. 洗涤后，每孔加入 1 ml 阿利新蓝 S（Alizarin red S），室温孵育 20 分钟。
  8. 细胞用去离子水洗涤2用去离子水轻轻振荡洗涤四次（每次5分钟），以去除残留的茜素红。
  9. 1 ml/孔2加入 O 以防止细胞干燥。
  10. 对平板进行目视检查和/或图像采集。
  11. 对于茜素红S定量实验，H2将6孔板中每孔的液体更换为1 ml 10%乙酸 & 室温下振荡孵育30分钟。
  12. 然后，刮取细胞单层/孔 & 乙酸 & 细胞被转移至不同的1.5 ml微量离心管中。注意： 每个孔应转移至单独的离心管中 即 三个测试孔 & 每个ED设三个对照孔 & OG组。
  13. 将试管剧烈涡旋振荡30秒。
  14. 85 °C 加热 10 分钟。注意： 为防止蒸发，用封口膜密封管子。
  15. 加热后，将离心管转移至冰上放置 5 min。注意：试管在冷却前不得打开。
  16. 将悬液在20,000 × g下离心15分钟。离心的同时配制茜素红标准品。

首先稀释稀释缓冲液，制备茜素红S标准品，并根据表格进行2倍系列稀释。

染料的高浓度范围 染料的低浓度范围
2 mM1 mM500 μM250 μM125 μM62.5 μM31.3 μM15.6 μM7.8 μM3.9 μM1.9 μM0.9 μM0.4 μM空白
  1. 离心后，将每管1 ml上清液转移至新的1.5 ml离心管中。
  2. 每管加入约375 μl 10%氢氧化铵中和pH值。（注意： pH范围应在4.1–4.5之间。）
  3. 将150 μl标准品与样品（包括独立检测组和对照组）加入不透明侧壁、透明底板的96孔板中。
  4. 在405 nm处测定吸光度，并将样品的OD值与标准曲线比较以进行后续分析。

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结果

  1. 通过酶解离法获得的牙髓干细胞（DPSC-ED）在第10、15、18天的形态如图1所示。 细胞集落几乎在分离后3至5天开始形成。
  2. 外生长牙髓干细胞（DPSC-OG）在接种后第5、10、13和18天的形态如图2所示。 接种后约5天，成纤维样细胞开始从牙髓组织中平行有序地迁移至培养瓶中。
  3. 两种方法获得的第3代牙髓干细胞如图3所示。 两种类型的牙髓干细胞在大小和形态上几乎相同。
  4. DPSC-ED与DPSC-OG的免疫表型分析结果如图4所示。 结果显示，两种细胞均表达间充质干细胞标志物，如CD44、CD73、CD105和CD90，而不表达造血及内皮细胞标志物，如CD34、CD45和CD11b。与DPSC-ED相比，DPSC-OG中CD105和CD146（血管周标志物）的表达水平更高。两组中STRO-1均为阴性。（蓝色曲线代表OG组，红色曲线代表ED组，黄色曲线为同型对照。）
  5. 第21天时，DPSC-ED与DPSC-OG矿化组织形成的茜素红S...

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讨论

本方案描述了使用两种方法从牙髓中分离和表征人牙髓干细胞（hDPSCs）的过程：酶消化法和牙髓组织外植块直接爬出法。此外， 体外 通过定量茜素红S染色法评估这些细胞向成牙本质细胞的分化情况 & qPCR

既往用于从人类牙齿中分离牙髓组织的方案曾使用多种器械，如钳子（骨用镊）9、拔髓针29、Gracey 刮治器30、牙科裂钻4等。这些方法在持续加水以减少牙髓过热的前提下，仍耗时较长。然而，在当前的技术中，采用牙科金刚砂片进行牙髓组织的分离，这是一种快速、一步式切割牙齿的方法，可最大程度减少污染，并在切割过程中将牙髓过热降至最低。此外，人牙髓干细胞（hDPSCs）最终可分化为成牙本质细胞，而针对恒牙来源的hDPSCs，此前尚未就本文所述目的进行过此类比较。通过定量茜素红S染色法对分化后的hDPSCs（ED组与OG组）进行比较评估，结果显示hDPSC-ED组的矿化潜能高于OG组。这些结果也通过定量PCR（QPCR）得到了验证。在两组细胞向成牙本质细胞分化后，矿化相关标志物DSP...

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披露

未声明任何利益冲突。

致谢

我们衷心感谢 Leila Shakeri 博士和 Aref Dournaei 博士提出的宝贵意见，以及 Mohammad Reza Khadem Sharif 先生提供的技术支持。

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材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
α-MEMGIBCO11900-073
I型胶原酶Sigma-AldrichC0130-100MG
中性蛋白酶GIBCO17105-041
青霉素/链霉素GIBCO15140-122
两性霉素BGIBCO15290-018
定义型胎牛血清（FBS）HyCloneSH30070.03
L-抗坏血酸-2-磷酸SigmaA8960-5G
L-谷氨酰胺GIBCO25030-024
地塞米松SigmaD4902
β-甘油磷酸二钠盐水合物，BioUltraSigmaG9422-100G
磷酸二氢钾Sigma-AldrichP5655
成骨检测试剂盒MilliporePS01802031
小鼠IgG2b-PE同型对照BD pharmingen50808088029
FITC标记的小鼠IgG2b同型对照BD pharmingen559532
FITC标记的小鼠IgG1 κ 同型对照BD pharmingen11471471
FITC/PE标记的小鼠抗人CD34/CD45抗体BD pharmingen341071
PE标记的抗人CD146抗体BD pharmingen550315
单克隆小鼠抗人CD90/FITC抗体Daka00034418
PE标记的小鼠抗人CD73抗体BD pharmingen550257
抗人CD105/Endoglin PE抗体BD pharmingenFAB10971P
PE标记的小鼠抗人CD11b/Mac1抗体BD pharmingen5553888
CD44 PE标记的小鼠抗人抗体BD pharmingen555479
磷酸盐缓冲液（PBS）GIBCO003000
70-μm细胞筛Falcon352360
0.2 μm注射器滤器Millex-GVSLGV033RB
25 cm2培养瓶Sigma-AldrichZ707481
仪器设备
BD FACSCaliburBD342975
Multiskan微孔板分光光度计Thermo scientific51119200
荧光显微镜Olympus
Flowing Software版本2.3.1

参考文献

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