F1FO ATP酶囊泡制备及线粒体亚微囊泡膜膜片钳记录技术

摘要

本文介绍了一种从大鼠脑组织中分离富含F1FO ATP合酶复合体的亚线粒体囊泡的方法。这些囊泡可用于通过膜片钳记录技术研究F1FO ATP酶复合体的活性及其调控机制。

摘要

线粒体参与多种重要的细胞功能，包括代谢、存活¹、发育以及钙信号传导²。其中两个最重要的线粒体功能是通过氧化磷酸化高效产生三磷酸腺苷（ATP）——即细胞的能量货币，以及介导程序性细胞死亡的信号通路³。

主要负责ATP生成的酶是F1FO-ATP合酶，也称为ATP合酶^4-5近年来，线粒体在细胞凋亡和坏死性死亡中的作用受到了广泛关注。在细胞凋亡过程中，BCL-2家族蛋白（如Bax）进入线粒体外膜，发生寡聚化并使外膜通透化，从而将促凋亡因子释放到细胞质中⁶在经典的坏死性细胞死亡中，例如神经元因缺血或兴奋性毒性所导致的死亡，线粒体基质内钙离子大量且缺乏调控地升高，会促进内膜上一种称为线粒体通透性转换孔（mPTP）的孔道开放。这会导致内膜去极化，并引发渗透压改变，进而促使外膜破裂、促凋亡因子释放以及代谢功能障碍。多种蛋白质，包括 Bcl-xL⁷ 与F1FO ATP合酶相互作用，调节其功能。Bcl-xL直接与F1FO ATP合酶的β亚基相互作用，该相互作用可降低F1FO ATP合酶复合体内的质子漏导通，从而在F1FO ATP酶活性期间增加H+的净转运。⁸ 从而提高线粒体效率。为了研究ATP合酶的活性及其调控机制，我们从啮齿类动物脑组织中分离出含有F1FO ATP酶的亚线粒体囊泡（SMVs）。这些SMVs保留了F1FO ATP酶的结构和功能完整性，如Alavian所示。 等. 本文介绍了一种我们已成功用于从大鼠脑组织中分离突触小泡膜囊泡（SMVs）的方法，并详细阐述了采用膜片钳技术分析SMVs通道活性（离子漏导电性）的实验步骤。

方案

1. 脑线粒体分离（改编自 Brown M.R. 等人⁹）

1. 采用机构动物护理和使用委员会（IACUC）批准的方法处死大鼠。
2. 通过断头法切除动物头部，切开皮肤并暴露颅骨。
3. 使用剪刀或咬骨钳小心切开颅骨，取出脑组织。
4. 将不含小脑的脑组织在分离缓冲液（见表1）中充分剪碎，并转移至5 ml玻璃/聚四氟乙烯匀浆器中（见设备清单）。
5. 轻轻匀浆组织10次（避免产生气泡），时间约为5分钟。
6. 在台式离心机中，4 °C条件下以1,500 × g离心10分钟。
7. 保留上清液（含线粒体和突触体），弃去沉淀（核成分和细胞碎片）。将上清液在台式离心机中，4 °C条件下以16,000 × g离心10分钟。
8. 弃去上清液，将沉淀用500 μl分离缓冲液重悬。使用细胞破碎装置（见设备清单）破坏突触体，施加1,200 psi压力持续10分钟，随后迅速减压。
9. 将混合物铺在Ficoll梯度液上（见表2），放入SW-50.1转子，在超速离心机中4 °C条件下以126,500 × g离心20分钟。沉淀为纯化的线粒体，Ficoll不同密度之间的条带为未破坏的突触体。
10. 将沉淀用分离缓冲液在台式离心机中4 °C条件下以16,000 × g离心10分钟进行洗涤。

2. 线粒体亚微囊泡（SMV）的分离（改编自 Chan et al.¹⁰）

1. 将线粒体重新悬浮于 200 μl 分离缓冲液中，加入等体积的 1% 皂苷（digitonin），冰上静置 15 分钟。
2. 加入更多分离缓冲液，在台式离心机中于 4 °C 以 16,000 × g 离心 10 分钟。重复此步骤两次。
3. 将沉淀重新悬浮于 200 μl 分离缓冲液中，加入 2 μl 10% Lubrol PX (C12E9)。混匀后冰上静置 15 分钟。
4. 将混合物铺在分离缓冲液上，放入 SW-50.1 转子，在 4 °C 以 182,000 × g 离心 1 小时。
5. 将最终沉淀在分离缓冲液中于 4 °C 以 16,000 × g 在台式离心机中离心 10 分钟，进行洗涤。

3. 电生理记录

1. 典型的电生理实验装置包括一个放大器、一台配备 Digidata 1440A 模数转换器接口和 pClamp10.0 软件的 PC 计算机、操纵器、显微镜、隔振台以及法拉第笼。
2. 将硼硅酸盐玻璃毛细管插入 Flaming/Brown 微量移液器拉制仪（型号 P-87）中。优化移液器拉制程序，以制备电阻在 80 至 100 MΩ 之间的移液器。
3. 将 SMV 置于生理细胞内溶液中（ATP 在记录过程中适当时间点添加）（表 3）。膜片钳移液器内填充相同溶液（不含 ATP）。在室温下对 SMV 形成吉欧姆封接进行记录。使用尼康或蔡司倒置显微镜通过相差显微镜观察囊泡。
4. 膜电位维持在 -100 mV 至 +100 mV 范围内的不同电压，持续时间为 10 秒。使用放大器电路将记录信号在 5 kHz 下进行滤波。成功的记录应实现杂散电噪声或非特异性噪声水平低于 1 pA。
5. 使用 Clampfit 10.0 软件分析数据，例如确定单通道事件的频率和幅度。通过绘制电流-电压关系曲线来确定电压依赖性。

结果

本方案的第一步可分离得到纯化的线粒体，如图1中的蛋白质印迹结果所示。图2展示了一个来源于脑组织的线粒体亚微结构囊泡（SMV）膜片钳记录示例。采用内面向外膜片钳构型，我们展示了ATP调控的通道活性。对照组（CTL）记录（左侧）显示多电导通道活性，平均峰值电导为600 pS，在向浴液中加入1 mM ATP后，电导立即下降。ATP的整体效应是以浓度依赖的方式降低SMV膜片的电导。为测定分离后F1FO ATP酶的活性效率，我们检测了ATP水解所引发的H+离子向SMV内的转运，如图3所示，通过测量被排除在SMV外的H+指示剂ACMA荧光强度的降低来反映该过程。加入ATP后，SMV对H+离子的可逆性封存能力增强。该检测方法可用于评估H+离子封存的效率。功能较低效的SMV将更缓慢地或达到较低峰值地积累H+离子。例如，Bcl-xL抑制剂和FCCP的加入会减弱H+离子的封存（Alavian et al., 2011）。

讨论

本文所述方法能够在不区分细胞表型的情况下，从全脑组织中分离出纯净的线粒体（步骤1结束时）以及亚线粒体囊泡（SMVs，步骤2之后）。如图1及我们先前的研究（Alavian KN et al.⁸）所示，通过本方法纯化的SMVs基本不含其他亚细胞器的污染，并且在冷冻前保持其结构和功能的完整性。冻融后的分离线粒体或SMVs可用于电生理记录和生物化学检测，但不适用于呼吸功能研究。

此外，该方法也可用于通过相同步骤从肝脏中分离线粒体。由于线粒体和小膜泡（SMVs）在接种至电生理记录室时容易形成聚集体，因此在加样时需特别注意，过度聚集或过度稀释均可能降低封接形成的概率。此外，在开始分离前应注意若干技术细节。必须使用洁净的工具并将其保持在冰上。所有操作均应在冰上进行，所有离心机应预冷至 4 °C。正确制备 Ficoll 梯度对实验成功至关重要。实现两种浓度 Ficoll 之间完美的分层可提高亚细胞组分的纯度。

该技术的一个局限性在于最终获得的蛋白质量可能较少，例如，若需...

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
带PTFE研杵的Potter-Elvehjem组织研磨器	Krackeler Scientific, Inc.	1-7725T-5
Eppendorf 离心机 5424	Eppendorf	5424 000.410
4639 细胞破碎容器	Parr Instrument Company	4639
Ficoll	Sigma-Aldrich	F5415
聚碳酸酯离心管	Beckman Coulter	P20314
SW-50.1 转子	Beckman Coulter
L8-70M 超速离心机	Beckman Coulter
皂苷（Digitonin）	Sigma-Aldrich	D5628
Lubrol PX (C12E9)	Calbiochem	205534
Axopatch 200B	Axon Instruments
Digidata 1440A	Molecular Device
pClamp10.0	Molecular Device
显微操作器	Sutter Instrument
硼硅酸盐玻璃毛细管	World Precision Instruments	1308325
Flaming/Brown 微量移液器拉制仪 型号 P-87	Sutter Instrument