本文描述了对CyTOF质谱流式细胞仪进行日常校准和性能优化所必需的步骤，并讨论了样品制备和流速优化的相关建议。
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本文内容
摘要
摘要
近年来，单细胞的快速分析通常采用流式细胞术和荧光标记抗体来实现。然而，荧光团发射光谱的重叠问题限制了可同时使用的探针数量。相比之下，DVS Sciences 公司推出的新型 CyTOF 质谱流式细胞仪将液体单细胞进样系统与电感耦合等离子体质谱（ICP-MS）相结合。1 该技术不使用荧光团，而是将含有高纯度金属同位素的螯合聚合物连接到抗体或其他特异性探针上。2-5 由于质谱流式细胞仪所用金属的纯度高且具有优异的质量分辨率，相邻同位素之间不存在“光谱重叠”，因此无需进行补偿矩阵校正。此外，由于使用了镧系金属，样品无生物背景信号，也就不存在类似自发荧光的干扰。在原子质量数 103–203 的检测范围内，理论上可同时区分多达 100 种标签。目前，利用 DVS Sciences 提供的螯合试剂，已有超过 35 个检测通道可用，使得对样本免疫学特征的解析达到前所未有的深度。6-7
质谱流式细胞术的缺点包括每个探针必须使用独立的金属同位素（无前向或侧向散射的等效信号），以及该技术具有破坏性（无法进行分选回收）。目前质谱流式细胞仪的配置细胞传输率仅为约25%，因此需要输入更多的细胞数量。
质谱流式细胞仪每日最佳性能的实现需要多个步骤。优化的基本目标是在最大化目标金属同位素（M）信号强度的同时，尽量减少氧化物（M+16）的形成，因为氧化物会降低M处的信号强度，并干扰在M+16处任何期望的信号。第一步是预热仪器，以建立一个高温且稳定的电感耦合等离子体（ICP）源。第二步是每日优化电流和载气流速的设置。在样本采集过程中，细胞事件的最大速率受限于检测器效率和处理速度，为1000个细胞/秒。然而，根据样本质量，通常更理想的是采用较慢的细胞事件速率（300–500个细胞/秒），以便更好地分辨细胞事件，从而最大限度地获得完整单细胞，减少双联体和碎片。最后，每天实验结束后对仪器进行充分清洗，有助于最大限度地减少游离金属引起的背景信号。
方案
用于CyTOF的全部细胞样本必须进行固定和透化处理。这有助于含铱的DNA嵌入剂更好地进入细胞，同时可防止在注入质谱流式细胞仪前的MilliQ水洗涤及重悬步骤中发生细胞裂解。
1. 质谱流式细胞仪的启动
- 打开 CyTOF 软件程序，选择仪器设置。在卡笼选项卡的右下角，点击加热器“开启”按钮。至少在预定使用时间前 15 分钟开启加热器，以确保喷雾室外套充分升温至 200 °C。
- 将注射泵中的白色 Norm-Ject 3 ml 注射器更换为装有 MilliQ 水的新注射器。
- 清洗雾化器。使用注射器和管路，通过较小的液体进样口和较大的气体进样口，反向冲洗 5% Citranox 溶液 2–3 次。随后用 MilliQ 水重复反向冲洗，以去除残留的 Citranox。
- 检查 CyTOF 前面板上的指示灯是否如图 1所示点亮。
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结果
遵循上述方案应实现以下四个目标。第一，为质谱流式细胞仪提供充足的预热时间，可产生高温且稳定的等离子体，这对于获得最佳信号以及最大限度减少氧化物形成至关重要。第二，使用 MilliQ 水和 DVS Wash 溶液对质谱流式细胞仪进行充分清洗（图9），有助于降低金属在管路及其他部件上的吸附水平，从而减少样本采集过程中的背景信号（图8）。此外，还可清除可能卡在仪器中的细胞，进而最大限度减少样本之间的交叉残留。第三，尽管无法完全避免氧化物的形成，但对质谱流式细胞仪进行适当的调谐（图5-7），可在目标质量数 M 处优化总信号强度，同时最小化质量数 M+16 处的氧化物背景信号。如图10所示，调谐不当（品红色）与正确调谐的样本（深蓝色）相比，显著增加了 M+16 处的氧化物形成。这会导致目标质量数 M 处的信号略有下降，而在 M+16 处产生显著增强的非特异性背景干扰。
最后，使用缓冲液充分洗涤样本，并最终用 MilliQ 水洗涤，可将金属/抗体背景信号降低.......
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讨论
几十年来，荧光流式细胞术一直是分析单个细胞（包括表面表达和功能检测）的常用方法。然而，荧光染料的光谱重叠问题限制了可同时检测的标记物数量。尽管已有使用超过12种同时标记的实验报道，但所需的补偿量使得该技术操作上极为困难。
与荧光染料不同，DVS Sciences 公司开创的质量流式细胞术使用带有金属螯合位点的聚合物作为抗体的标记物。1-3 由于所用金属纯度高，且电感耦合等离子体质谱（ICP-MS）具有优异的质量分辨率，因此几乎不存在“光谱重叠”现象。由于大多数所用元素在生物学上无相关性，因此也几乎不会产生导致“自发荧光”的背景信号。这些优势使得在单次实验中可同时检测超过 30 种标记物。6,7 此外，ICP-MS 的信号动态范围也比典型的荧光实验更宽。
然而，质谱流式细胞术存在一些局限性。它是一种破坏性技术：细胞无法回收用于分选或进一步实验。质谱流式细胞仪对金属元素的存在有严格要求：如果某种金属不存在，则细胞将无法被检测到。这是使用金属螯合DNA嵌入染料的主要原因，以确保准确的“亲代.......
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披露
两位作者均就职于斯坦福大学的人类免疫监测中心，该中心是一个服务性机构，仅收取用户费用以弥补检测成本，包括质谱流式细胞术的费用。
致谢
我们感谢 Evan Newell 博士和 Sean Bendall 博士提供的反馈意见。我们还要感谢 DVS Sciences 公司以及 Sean Bendall 博士提供了含多种镧系元素的聚苯乙烯微球样品。本研究得到了美国国立卫生研究院（NIH）基金项目 2 U19 AI057229 的资助。
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| CyTOF 质谱流式细胞仪 | DVS Sciences | ||
| 清洗液 | DVS Sciences | 201071 | 含 0.05% 氢氟酸的水溶液 |
| 调谐液 | DVS Sciences | 201072 | 含 0.5 ppm 镧、铯、铽、铥、铱及痕量硝酸 |
| 含铕的聚苯乙烯微球 | DVS Sciences | 201073 | 含有天然丰度的铕同位素；微球供应浓度约为 100 万个/毫升 |
| 多镧系元素（镧/镨/铽/铥/镥）聚苯乙烯微球 | DVS Sciences | 尚未商业化供应 | 含有所列镧系元素的天然丰度同位素 |
| 硝酸（浓） | Fisher Scientific | A467-500 | Optima 痕量金属纯级，适用于 ICP-MS |
| 带细胞滤网盖的聚苯乙烯圆底管（5 ml） | BD | 352235 | 用于样品进样前过滤细胞 |
| Norm-Ject 结核菌素注射器（1 ml） | Henke Sass Wolf | 4010-200V0 | 无硅油、无乳胶 |
| Norm-Ject 注射器（3 ml） | Henke Sass Wolf | 4010.000V0 | 无硅油、无乳胶 |
| MilliQ 水 | 18 MΩ 纯水；不得储存在用市售洗涤剂清洗过的玻璃或塑料瓶中（因其中含有高浓度的钡）。 | ||
| Citranox | Sigma-Aldrich | Z273236 | 酸性洗涤剂 |
| 氩气 | Praxair | AR 5.0UH-T | 99.999% 超高纯度 |
参考文献
- Bandura, D. R. Mass cytometry: Technique for real time single cell multitarget immunoassay based on inductively coupled plasma Time-of-Flight mass spectrometry. Anal. Chem. 81, 6813-6822 (2009).
- Lou, X. Polymer....
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