像自由游动的线虫 C. elegans 这样的微观生物，生活在复杂且具有三维特性的环境中，并在此环境中表现出特定行为。我们报道了一种利用衍射图样分析 C. elegans 的新方法。该方法通过将激光照射穿过比色皿，记录其所产生衍射图样的时间周期性变化，从而实现对线虫运动的追踪分析。
本文内容
摘要
摘要
土壤和水生微生物生活在复杂的三维环境中。然而，目前大多数关于微生物行为的研究均采用基于显微镜的方法，这些方法将微生物的运动和行为限制在狭窄且近乎二维的焦平面内。1 我们提出一种新颖的分析方法，可在比色皿中对自由游动的 C. elegans 进行实时分析，且无需依赖基于显微镜的设备。该方法通过将激光照射穿过比色皿，追踪由此产生的衍射图样的时间周期性变化来实现。我们测量了自由游动线虫的振荡频率。
远场衍射图样的分析揭示了线虫波形的线索。衍射是光在物体周围发生弯曲的过程。在此情况下，光被生物体衍射。光波相互干涉，可形成衍射图样。当屏幕与物体之间的距离远大于衍射物体的尺寸时，便形成远场（即夫琅禾费）衍射图样。此时，衍射图样可通过傅里叶变换进行计算（建模）。2
C. elegans 是一种自由生活的土壤线虫，能够在三维空间中移动。它们既可以在土壤或琼脂等固体基质上以正弦波状的运动模式爬行，也可以在液体中以另一种不同的模式游泳。3 目前，调控运动模式可塑性变化及模式转换的机械感受、化学感受和温度感受细胞所提供的感觉信息所起的作用才刚刚开始被阐明。4 我们描述了一种无需显微镜即可测量线虫三维运动的光学方法，该方法将使我们能够开始探索在不同条件下线虫运动的复杂性。
方案
1. 用于视频分析的 C. elegans 准备
- 使用一根细而扁平的铂丝挑针，将10-20条 gravid 成年线虫转移至盛有新鲜NGM琼脂的培养皿中。这些含有NGM琼脂的培养皿中央接种有少量圆形的E. coli菌斑（使用生长受限菌株OP50效果最佳），供线虫取食。让线虫产卵3-5小时，随后移除成虫，从而建立一个包含50-150条线虫的小规模、发育同步的培养体系。将培养皿置于20 °C条件下孵育4-5天，使线虫生长至早期成虫阶段。这些培养方法基于已建立的标准操作流程（Stiernagle 2006）5。
- 在进行视频分析当天，用1 ml去离子蒸馏水冲洗一皿年轻成虫线虫，从而从同步培养物中收集50-150条线虫。也可使用M9或PBS等缓冲液。使用微量离心机将线虫离心至管底，或静置约15分钟使其依靠重力沉降。吸除大部分上清液，并加入1 ml去离子蒸馏水以洗去线虫表面附着的细菌。
- 使用微量移液器将线虫连同水或缓冲液转移至石英比色皿中。每次操作应使用少量线虫，总数约5-10条，甚至更少，以确保每次通常只有一条线虫被激光照射。若培养皿中线虫数量过多，可用去离子水或缓冲液稀释至所需密度。也可用挑针将单个线虫转移至新鲜琼脂平板上的水滴或缓冲液滴中进行清洗，再逐个转移至比色皿中。在本研究中，我们使用了1 mm、2 mm和5 mm的比色皿尺寸，以考察物理约束对游泳行为的影响。
2. 视频分析的光学装置
- 按照图示进行设置 图1 使用543 nm（绿色）氦-氖（HeNe）激光器、两个前表面铝镜、比色皿架、投影屏和一台高速相机（Casio High Speed Exilim），该相机能够以约240 fps的速度进行拍摄。两个铝镜用于引导激光束穿过比色皿。可根据研究性质选用不同尺寸的比色皿。例如，我们使用厚度为5 mm的比色皿来展示空间限制对游动频率的影响。激光束必须满足过采样的要求； 即，生物体不应遮挡超过三分之一的激光束。对于 秀丽隐杆线虫激光束与线虫相互作用时，其直径应约为2 mm。激光束直径不应超过5 mm，否则衍射图样将难以定位。衍射生物体与屏幕之间的距离应远大于生物体本身的尺寸。
- 将石蜡膜覆盖在比色皿顶部，倒置以使线虫充分混入水柱中。将比色皿放入比色皿架，使线虫初始位置位于比色皿上部。利用反射镜引导激光束穿过比色皿中心。由于线虫密度大于水，它们会缓慢沉降至比色皿底部，同时在水柱中持续游动。
- 在投影屏幕上，将对应于透射激光束的光斑涂成黑色，以减少透射光束到达投影屏幕时产生的散射图2）. 或者在投影屏上开一个开口，使透射光束能够穿过屏幕。消除或减少透射光束的散射，可防止透射光束导致相机的CCD阵列饱和。
- 为测量衍射图样的尺寸，在投影屏上紧邻透射激光光斑处画一条约5 cm长的线，注意不要干扰衍射光的图像。
- 打开室内灯光，用相机开始录制，确保5 cm标线与衍射图像同时记录在同一段视频中。关闭室内灯光，当线虫穿过激光束时，用相机记录屏幕上的衍射图像。
3. 视频数据准备
- 在计算机上安装视频分析软件（Logger Pro：http://www.vernier.com/products/software/lp/），并将视频导入该视频分析程序。
- 将坐标原点设置为与透射激光光斑重合。使用投影屏上的5 cm标尺线设定比例尺。
- 利用视频分析软件追踪每条线虫产生的衍射图像的角位移（图3）。
- 通过计算 arctan (y/x) 求得角位移，将数据复制粘贴至电子表格（Excel）中，并对所有负角度值增加180度或π，以生成连续的角位移曲线（图4）。
4. 游动频率的实时数据采集以实现即时观察
- 使用与视频分析相同的装置，将一个面积较小（约1 mm2）的光电二极管（ThorLabs公司的DET10A）放置在投影屏正前方的衍射图样偏离中心的位置。
- 将光电二极管连接至通过USB接口与计算机相连的数字示波器（Pico Technology公司生产的PicoScope），在计算机屏幕上观察抖动的波形图样。
- 以ASCII或文本格式保存采集到的数据集。
5. 数据分析
- 将使用视频或光电二极管采集的数据导入能够通过卡方最小化拟合波形的数据分析程序中。本研究使用的程序为 Origin（http://www.originlab.com/）。拟合正弦曲线以确定摆动频率（图 4 和图 5）。
- 计算不同样本的平均游泳频率并确定方差。本研究采用单因素方差分析（ANOVA）进行统计分析，随后进行 Bonferroni 多重比较检验。以 p 值 < 0.05 为具有统计学显著性。
6. 以 Mathematica 为例模拟衍射图样
注意：衍射图样可以使用多种不同的计算工具进行建模。该过程会因不同的计算工具（如 MatLab、Excel、Origin 等）而有所不同。
- 创建图像：使用传统显微镜在显微镜载玻片上拍摄线虫的图像。
- 图像二值化：通过将图像拖入 Mathematica 中导入线虫图像“Worm”。将图像转换为黑白图像（二值化）。这可以通过 Mathematica 中的“Binarize”命令实现：BlackandWhiteImage=Binarize[Worm]。随后可将图像显示为黑白图像。
或者，使用“EdgeDetect”命令生成 BlackandWhiteImage：EdgeDetect[Worm,6.0,0.035]，其中后两个数值控制生成边缘的粗细程度。 - 将图像转换为由零和一组成的矩阵：可通过 Mathematica 中的“ImageData”命令实现：Matrix=ImageData[BlackandWhiteImage]。
- 对矩阵进行傅里叶变换：在 Mathematica 中使用“Fourier”命令，并采用指定的 FourierParameters 对矩阵进行傅里叶变换：FTransform = Fourier[Matrix, FourierParameters -> {0, -2}]。
- 对矩阵取模的平方以获得衍射矩阵并增强图像对比度：对矩阵的绝对值进行平方，并查看所得图像，该图像即为对应原始图像的衍射图样。此外，使用“Log”函数对图像对比度进行缩放：ImageContrast = Image[Log[1 + (Abs[FTransform])^2]/0.5]。
- 调整图像大小以便于观察：裁剪中心的衍射图样，并按需调整大小：ImageResize[ImageContrast [y, 100], 500]。
- 将模拟的衍射图样与自由游动线虫获得的衍射图样进行比较。（图6）
结果
例如，我们研究了在石英比色皿中运动的C. elegans，该比色皿宽1 cm、厚5 mm、高4 cm。通过视频分析选取单条线虫，在5 mm厚的比色皿中测得其平均游泳频率约为2.5 Hz（图4）。同样地，采用实时数据采集方法对单条线虫进行采样，使用数字示波器（PicoScope）测得其游泳频率约为2.7 Hz（图5）。该实验过程可重复应用于多条线虫。对自由游泳线虫的详细研究表明，在5 mm比色皿中的平均游泳频率为2.37 Hz6。与预期一致，该游泳频率高于爬行线虫的频率（约0.8 Hz）3。利用这种衍射方法，已发现被限制在显微镜载玻片上的C. elegans的平均游泳频率与先前发表的2 Hz数值相符1,7。
按照步骤 3.) 然后 6.) 可借助普通显微镜获得的蠕虫图像对游泳过程中的衍射图样进行建模。所建立的衍射图样模型用于模拟 C. elegans 的游泳周期（图 6）。一个成功的模型应包含物理上合理的连续游泳形态，并与游泳频率相匹配。在游泳周期结束时，蠕虫的形态应与其在游泳周期开始时相同。
图1. 采用绿色HeNe激光器对活体C. elegans产生动态衍射图样。该衍射图样以240帧/秒的速度进行拍摄。
图 2. 绘制一个黑点可增强对透射光束的吸收。由于散射光导致的相机饱和现象得以减弱，衍射图样因而变得可见。
图3. 视频分析软件（Logger Pro）的截图，显示正在追踪的蠕虫衍射图样。 点击此处查看大图。
图 4. 对应于线虫在 5 mm 比色皿中游泳周期的视频数据。曲线拟合显示游泳频率约为 2.5 Hz。
图 5. 对应于线虫在 5 mm 比色皿中游泳周期的实时数据。曲线拟合显示游泳频率约为 2.7 Hz。
图 6. 顶行显示实际的衍射图样，与底行的模拟衍射图样相对应。模拟衍射图样是通过显微镜载玻片上的线虫生成的（中行）。
讨论
我们开发了一种无需使用显微镜即可实时测量线虫等微型生物运动及简单运动行为的新方法。8 该方法学也可用于研究多种其他微型生物，如原生生物。此方法的局限性仅在于所用光的波长：生物体尺寸不应小于光的波长。除设备成本低且便于携带外，该方法的一个关键优势在于能够实时、三维地测量行为，而不受显微镜下图像平面狭窄视野的限制。此外，利用该技术还可研究重力或其他多种条件对行为的影响，而这些因素在基于显微镜的方法中难以实现。9 因此，我们能够更深入地理解微生物在自然状态下的运动行为，摆脱显微镜载玻片液滴或专用微流控腔室的限制（Park et al, 2008）。10
衍射图样中相位信息的缺失使得无法直接重构出对应衍射物体的图像，因为远场衍射图样正比于傅里叶变换绝对值的平方。因此，我们通过蠕虫图像计算衍射图样，以便与自由游动线虫的衍射图样进行比对（图6）。
该方法已成功获得真正自由游动的 C. elegans 的实验结果，且可应用于任何在光学透明环境（如水或多类不同的离子溶液）中运动的微观物种。传统的显微镜仅能实现微米量级焦深的研究。11 这是由于聚焦光线时景深有限所致：
其中，f值 N 与弥散圆（c）呈倒数关系，因此短焦距对应较大的c12,13。尽管这种衍射方法显然不能取代传统显微镜，但它能够快速提供定量结果，从而实现在低成本条件下对物种进行实时操控。衍射图样可使用任意激光笔获得，并可通过普通数码相机以较低时间分辨率进行拍摄记录。即使使用者无法 readily 获得显微镜或光电二极管，本实验的关键步骤（如测量蠕动频率和评估衍射图样）仍能以极低的成本完成。
致谢
感谢 Tzlil Rozenblat、Alexandra Bello 和 Karl Spuhler 提供的技术支持。本研究由瓦萨学院本科生研究暑期研究所（URSI）、Lucy Maynard Salmon 研究基金以及 NASA 资助项目 #NX09AU90A、美国国家科学基金会科学与技术研究中心（NSF-CREST）资助项目 #0630388 和 NSF 资助项目 #1058385 资助。
材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 543 nm 氦氖激光器 | Melles Griot | LGX1 | 任何可见光范围、输出功率低于 5 mW 的激光器均可使用。 |
| 2 个前表面铝镜 | Thorlabs | PF10-03-F01 | |
| 高速 Exilim 相机 | Casio | ||
| 石英比色皿 | Starna Cells | 21/G/5 | |
| LoggerPro（软件） | Vernier | http://www.vernier.com/products/software/lp/ | |
| Mathematica 8 | Wolfram | http://www.wolfram.com/ |
参考文献
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