使用INTERCEPT血液系统制备并灭活双剂量血沉棕黄层血小板制品中的病原体

摘要

本文介绍了厄勒布鲁大学医院制备双剂量富白膜层血小板浓缩物的流程，该制品由全血捐献制备，并使用INTERCEPT血液系统进行病原体灭活处理。在7天储存期间对最终血小板单位的体外质量进行了评估。

摘要

血库面临着诸多挑战，包括最大限度地提高从所接收血液制品捐赠中获得的生产产量，以及确保为输血患者提供尽可能高的安全性，其中包括防止经输血传播的疾病。这些工作必须以符合财政责任的方式完成，即在最小化耗材、设备、废弃物和人员成本等运营支出的同时实现上述目标。

目前有多种方法可用于制备供输注用的血小板浓缩物。其中最常用的方法之一是富白细胞层法，即通过汇集最多六份全血捐献的富白细胞层，制备一个治疗剂量的血小板单位（每单位≥ 2.0 × 10¹¹ 个血小板，或符合当地规定）。而制备“双剂量”全血来源血小板的工艺则直到最近才被开发出来。

本文介绍一种新颖的方法，用于从7个 Buffy Coat 混合池制备双剂量全血来源的血小板浓缩物，并随后使用 INTERCEPT 血液系统对双剂量单位进行病原体灭活处理。INTERCEPT 系统的开发旨在灭活可能存在于捐献血液中的病毒、细菌、寄生虫以及污染性供体白细胞。通过将 INTERCEPT 系统与双剂量 Buffy Coat 方法结合，使用配备双存储容器的 INTERCEPT 处理套装（“DS 套装”），血站可在单一病原体灭活处理流程中完成每个双剂量单位的处理，从而在最大限度保障患者安全的同时降低操作成本。相比单剂量 Buffy Coat 血小板单位的制备与处理，双剂量 Buffy Coat 方法所需 Buffy Coat 数量更少，并可使耗材使用量减少高达50%（例如 混合套装、滤器套装、血小板添加液和无菌连接片）。其他成本节约还包括较少量的废弃物、更少的设备维护、更低的电力需求、减少的人力投入，以及相比单采术技术更低的采集成本。

方案

1. 全血采集

1. 根据当地血液采集指南，使用450 ml分层采集套装从志愿献血者采集全血。
2. 全血在离心和分离前，需在冷却板上至少保存2小时。

2. 白细胞层制备

1. 采用高速离心法离心全血，使血液分为三层：红细胞、白膜层和血浆。离心参数为4,880 RCF，22±2 °C下离心11分钟。
2. 使用自动血液分离器将血浆转移至上方的卫星袋，红细胞（RBC）转移至下方的卫星袋，白膜层则保留在采集容器中。白膜层的目标平均体积和血细胞比容范围分别为约48 ml和37%。
3. 白膜层在22±2 °C下置于血小板振荡器上保存过夜。

3. 白细胞层汇集

1. 将7个血沉棕黄层和300 ml SSP+血小板添加液（PAS）以并联管路的方式无菌连接成管路系统，以缩短管路长度；PAS应位于管路系统的顶部。夹闭PAS与第一个血沉棕黄层之间的管路。
2. 打开血沉棕黄层单位之间的无菌连接，使血沉棕黄层依次流入最后一个容器中。
3. 打开PAS与第一个血沉棕黄层之间的焊点及夹子，使三分之一的添加液依次冲洗每个血沉棕黄层容器。重复此操作2次，每次使用剩余PAS的一半。
4. 血沉棕黄层混合液的平均体积应约为600 ml。若各血沉棕黄层的体积和红细胞压积达到目标值，则血浆比例将为32–47%，符合后续进行INTERCEPT病原体灭活处理的要求。
5. 丢弃空的SSP+袋和血沉棕黄层容器。
6. 为获得最佳血小板回收率，在离心前将混合液置于振荡器上保存1小时。
7. 将带有集成白细胞过滤器的血小板储存袋与血沉棕黄层混合液无菌连接。
8. 对血沉棕黄层混合液进行“低速离心”，以分离悬浮中的红细胞与血小板（462 RCF，9分钟20秒）。使用自动化血液分离设备将血小板悬液通过白细胞过滤器转移至血小板储存袋中。
9. 前述处理步骤可确保血小板悬液符合INTERCEPT处理要求：体积为300 ml–420 ml，血小板剂量为2.5–7.0 × 10¹¹，红细胞含量≤ 4 × 10⁶/ml。

4. INTERCEPT 处理

1. 在采集后第1天结束前进行INTERCEPT处理（采集当天为第0天）。
2. 从透明塑料袋中取出带有双存储容器的INTERCEPT处理套装。
3. 将血小板悬浮液容器无菌连接至INTERCEPT处理套装上氨甲苯酸容器的管路上。
4. 根据当地要求，使用适当的血液制品标识对INTERCEPT处理套装的存储容器进行标记。
5. 悬挂血小板袋，并先折断氨甲苯酸容器底部的穿刺针，使氨甲苯酸溶液流入光照容器；再折断氨甲苯酸容器顶部的穿刺针，使血小板流经氨甲苯酸容器进入光照容器。
6. 轻轻混合血小板与氨甲苯酸的混合物，并将光照容器中的空气挤压至氨甲苯酸容器中。
7. 将少量血小板混合物挤入管路，填充约4 cm的管路长度。此举可确保管路和光照容器中的血小板均接受病原体灭活处理。
8. 在光照容器与氨甲苯酸容器之间的管路上进行封管，保留不超过约4 cm的管路从光照容器延伸出来。移除并丢弃空的血小板袋和氨甲苯酸容器，并关闭采样袋上的夹子。
9. 将处理套装放入光照仪中，将光照容器置于左侧较大的隔间内，整理器置于右侧较小的隔间内。
10. 使用手持式条形码设备将献血编号、产品代码及处理套装批号输入光照仪。关闭金属盖，当光照仪图形界面提示时，关闭抽屉。按下“开始”以启动光照程序。
11. 光照完成后，从光照仪中取出处理套装。光照仪将自动打印经处理的血小板单位的处理报告。
12. 从整理器上取下容器，悬挂血小板及处理套装，折断光照容器出口处的穿刺针，使血小板流入复合吸附装置（CAD）容器中。
13. 注意不要弯折CAD晶片，使用血浆提取器将CAD容器中的空气挤压回光照容器中。
14. 在靠近CAD容器入口端口处封管，移除并丢弃空的光照容器。
15. 将附有存储容器的CAD容器置于血小板振荡器上，振荡至少6小时，但不超过16小时。此步骤可使残留氨甲苯酸浓度降低至≤ 2 μM。
16. CAD处理完成后，将血小板单位从振荡器上取下，悬挂血小板袋，折断穿刺针，使血小板流入存储容器中。
17. 将存储容器中的空气挤压至CAD容器中，依靠重力使残留的血小板浓缩物流回存储容器。在Y型接头上方封管，并移除空的CAD容器。
18. 根据需要重新分配存储容器之间的体积。体积调整通过称量存储容器完成。在每个存储容器入口上方几厘米处封管；此操作有助于按5.2所述方法从最终产品中无菌取样。

5. 产品取样

1. 进行常规质量控制检测时，可使用储血袋上的取样袋对最终储存容器进行一次取样。操作时，确保血小板单位充分混匀，然后打开通向取样袋的夹子并挤压数次。待取样袋充满血小板后，封闭导管。立即将血小板样本转移至合适的实验室试管中，并立即进行检测。
2. 若需在储存期间多个时间点获取样本（例如用于验证研究），应将一个新的无菌取样容器通过无菌接合方式连接至血小板储存容器的导管上。在将血小板转移至取样容器前，确保血小板已充分混匀。

6. 体外 功能评估

1. 在本验证研究中， 体外 在CAD处理后（第1天或第2天，取决于CAD持续时间）进行评估，并于第4天（或第5天）和第7天再次进行评估。 体外 测量指标包括体积、血小板计数、pH值、血气（pO₂₂, pCO₂）、葡萄糖、乳酸和涡旋。
2. 体积通过称重法测定，血小板在添加液中的比重为1.01 g/ml。
3. 通过与比色卡进行目视比较，评估血红蛋白污染情况。
4. 通过目视确定涡旋情况。
5. 参见“设备表”以了解其他检测方法的实验方案。

7. 代表性结果

双剂量富白细胞层血小板的制备过程始于制备符合目标体积和红细胞压积要求的单个富白细胞层。由于在最终工艺验证过程中测量单个富白细胞层的红细胞压积并不实际，我们首先开展了独立工作以优化富白细胞层，确保能够持续达到目标体积和红细胞压积。如表1所示，优化后的富白细胞层在体积和红细胞压积方面分别为46 ± 2 ml和37 ± 3%，与目标值相比具有良好一致性。

混合后，在进行低速离心前，白膜层混合液的体积和红细胞压积应分别约为600 ml和20%。如表2所示，我们的白膜层混合液平均体积为615 ± 5 ml，红细胞压积平均为19 ± 1%。

软旋离心可获得双剂量血小板浓缩物，满足使用INTERCEPT血液系统DS处理套件进行病原体灭活的输入要求。INTERCEPT处理的关键输入参数包括体积、血小板计数、血浆比例和红细胞（RBC）含量。此外，我们目标是使血小板浓缩物中的血小板回收率相较于血沉棕黄层池达到或超过75%。根据当地要求，白细胞（WBC）污染必须低于<1×10⁶/单位。在验证过程中，我们的血小板浓缩物符合INTERCEPT处理的关键参数，同时达到了白细胞污染和血小板回收率的目标，如表3所示。

使用单个INTERCEPT处理套件对双剂量血小板浓缩物进行病原体灭活处理。该处理套件包含两个集成的储存容器，可在病原体灭活过程结束时将处理后的血小板单位分割为两个独立的治疗剂量。欧洲指南要求，所检测的血小板单位中至少有75%的单位含量≥200×10⁹个血小板/单位⁹ 每治疗剂量的血小板数1；瑞典当地的法规要求，检测样本中至少75%的单位应含有 >240x10⁹ 每剂量血小板数。经INTERCEPT处理后，平均血小板含量为265 ± 22 × 10⁹ （n=24）。此外，88%的单位达到或超过了240×10⁹ 每治疗剂量的血小板数量；此数值完全符合欧洲指南和瑞典法规要求。参见 图1 & 2 分别展示了双剂量血沉棕黄层制备和INTERCEPT处理过程的示意图。

为了此次验证，我们测量了 体外 经INTERCEPT处理后血小板浓缩物的特性（即 在分装至各个储存容器后，对储存7天期间的参数进行测量。采集血小板剂量、pH值、pO₂₂, pCO₂乳酸生成和葡萄糖消耗。

图3显示了经INTERCEPT处理前双剂量血小板浓缩液的平均起始血小板剂量，以及在保存7天期间每次分割产品经INTERCEPT处理后的平均血小板剂量。保存期间血小板损失约为9%。该减少程度与传统血小板保存期间预期的血小板损失无差异。²

表4 总结了 体外 经处理并分装为单个单位后的INTERCEPT血小板的特性

根据欧洲要求，血小板在保存有效期结束前其pH值必须保持在6.4以上。在处理过程中，血小板浓缩物的pH值会因血小板浓度、体积以及血小板储存容器的气体通透性而略有下降。图4展示了分装后的血小板制品在7天储存期间的pH值变化。在储存期间，pH值保持稳定，并始终维持在处理要求范围内。

如图5A和5B所示，在储存7天期间，PL2410容器中经INTERCEPT处理的血小板的O₂消耗和CO₂生成表明其持续进行呼吸作用。图6A和6B显示了储存7天期间乳酸和葡萄糖水平的变化。在7天储存期间，血小板的葡萄糖消耗与乳酸生成趋势一致。有5个单位的葡萄糖水平低于1.11 mmol/L（葡萄糖检测的下限值）。

经制备的白膜层及混合验证所得的血小板浓缩物符合INTERCEPT处理的输入标准；具体包括体积、血小板计数、血浆比例和红细胞污染程度。最终制品在储存7天期间内均满足验证标准，包括血小板剂量和pH值。

参数	目标范围	结果均值 ± 标准差
体积 (ml)	~ 48	46 ± 2
血细胞比容 (%)	~ 37	37 ± 3
混合前保存时间	在摇床上过夜	在摇床上过夜

表1. 各份血沉棕黄层的特征（n=19）。

参数	目标范围	结果均值 ± 标准差
体积 (ml)	~ 600	615 ± 5
红细胞压积 (%)	~ 20	19 ± 1
离心前放置时间	1 小时振荡	1 小时振荡

表2. 白细胞层混合样本的特征（n=12）。

参数	目标值	结果 均值 ± 标准差
体积 (ml)	370 - 420	404 ± 8
血小板计数 (x109/单位)	250 - 700	577 ± 62
平均血小板回收率 (%)	≥ 75	75 ± 4
血浆比例 (%)	32 - 47	38 ± 1
红细胞 (x106/ml)	≤ 4	1.2 ± 0.4
白细胞 (x106/单位)	≤ 1	0.11 ± 0.1
INTERCEPT 处理前保存时间 (小时)	≤ 第1天结束前	≤ 第1天结束前

表3. 双剂量血小板浓缩物的特征（n=12）。

	均值 ± 标准差	最小值	最大值
体积 (ml)	199 ± 16	182	236
血小板计数 (x109/单位)	265 ± 22	225	292
pH (22 °C)	6.9 ± 0.1	6.8	7.0
pO2 (kPa)	21.4 ± 4.8	12.8	27.3
pCO2 (kPa)	4.3 ± 0.4	3.3	4.9
乳酸 (mmol/l)	9.1 ± 1.7	6.8	12.4
葡萄糖 (mmol/l)	5.3 ± 0.9	3.7	6.5

表4. 经INTERCEPT处理的血小板第1/2天特征（单份单位，n=24）。

图1. 从7个富白细胞层（buffy coats）混合物中制备双剂量血小板浓缩液。

图2. 使用INTERCEPT血液系统对双剂量血小板浓缩物进行病原体灭活。

图3. INTERCEPT处理前及处理后7天内的平均血小板剂量（INTERCEPT处理前，n=12；处理后，n=24）。

图4. 经INTERCEPT处理后血小板平均pH值±标准差（n=24）。

图5A. 经INTERCEPT处理后平均pO₂ ±标准差（n=24）。

图5B. 经INTERCEPT处理后平均pO₂ ±标准差（n=24）。

图6A. 经INTERCEPT处理后的平均乳酸水平±标准差（n=24）。

图6B. 经INTERCEPT处理后的平均葡萄糖水平±标准差（n=24）。

讨论

从血沉棕黄层制备血小板需要经过多个处理步骤，这些步骤会产生采集后的成本，包括人力时间、耗材、设备和废弃物处理，这些都必须计入血小板制剂生产的总成本中。通过优化血沉棕黄层的体积和红细胞压积，提高每份血沉棕黄层的血小板得率，可使七份血沉棕黄层混合后制备出双剂量的血小板制剂。实施该优化后，生产固定数量血小板剂量所需的血沉棕黄层数量可减少，从而提高血沉棕黄层的整体利用率，并能够生产更多的血小板浓缩物（PC）。人力时间以及耗材和设备成本（如混合装置、血小板添加液、无菌连接片、滤器组件和离心程序）可降低达50%。除了优化血小板生产和降低相关成本外，该混合方法还可制备出符合INTERCEPT双联储存容器处理套装输入要求的血小板浓缩物（PC），从而进一步提升对输血受者保护能力。

用于病原体灭活的 INTERCEPT 血液系统采用阿莫特萨伦（amotosalen）和紫外线 A（UVA）照射，共价交联 DNA 和 RNA，从而阻止核酸复制，使病原体无法引发疾病。³ 该系统可有效灭活多种病原体，包括病毒、细菌、寄生虫以及污染性供体白细胞。^4-6 INTERCEPT 为应对新发传染病病原体提供了一种替代现有检测模式的方案；传统检测方法通常需要较长时间开发新检测技术，并且在检测方法可用后，实施过程还需投入大量资金。^7,8 此外，INTERCEPT 还可替代其他重复的安全措施，例如细菌检测⁹ 和γ射线辐照。^10-12 另外，INTERCEPT 可用于处理双剂量血小板单位，有助于提高我们的生产效率，并帮助我们控制预算支出。

INTERCEPT 和双份剂量的白膜层方法可适用于多种血站工作流程。例如，全血采集量可增加至 500 ml；采集后的血液也可在分离前于 22 °C 保存过夜。此外，还可采用另一种白膜层混合方法（例如 一种章鱼法而非列车法）和/或一种自动化设备（例如 TACSI可用于第二次离心，以分离血小板悬液与残留的红细胞。

如果需要增加血小板含量，可采用多种技术，包括根据血小板计数预先筛选供者、全血过夜孵育、调整离心参数，或使用8份血沉棕黄层代替7份。

由于目前可用的汇集组存在限制以及离心机桶的容量限制，白膜层汇集物的总体积应约为 600 ml。本方案中所述的离心过程和设置已针对由 7 份白膜层组成的汇集物进行优化，以获得符合 INTERCEPT 参数要求的产品。如果汇集物中白膜层的数量发生变化，则必须调整离心设置。

在某些国家，最低血小板剂量高于瑞典，且质量控制（QC）要求更为严格。因此，我们的研究结果可能不具有普遍适用性。在这些国家，经INTERCEPT处理前的双剂量血小板制品需要含有更多的血小板，以确保在INTERCEPT处理及分装后仍能满足当地的使用要求。由于INTERCEPT处理的最大血小板含量和最大处理体积分别为7×10¹¹个血小板和420 ml，因此超出INTERCEPT处理能力或血小板含量不足以分装为两个治疗剂量的制品比例，将取决于当地对血小板剂量的要求、质量控制标准、血沉棕黄层优化结果以及生产稳定性等多种因素。

如果双剂量血小板浓缩物（PC）超出 INTERCEPT 处理要求，则可手动调整以满足要求，随后进行处理。在少数情况下，若经 INTERCEPT 处理后，由7个血沉棕黄层（buffy coat）池化所得的血小板数量不足以制备双剂量产品时，我们选择不进行 INTERCEPT 处理。或者，其他血库可选择使用单剂量 INTERCEPT 处理套装对血小板浓缩物进行处理。即 大容量套装）并将血小板制品（PC）储存为单个较大治疗剂量，从而对所有单位进行病原体灭活。为确保满足质量控制要求，并尽可能对更多的血小板单位实施病原体灭活，我们根据献血者的血小板计数选择血沉棕黄层，使其混合后血小板含量至少达到5.6×10¹¹/单位¹¹ 确保池中血小板含量充足，以便在经INTERCEPT处理后可产生两个治疗剂量。

我们的验证结果表明，7个由全血分离的白膜层单位可成功混合，并通过INTERCEPT血小板处理工艺进行处理，最终获得2个病原体灭活的血小板制品，其符合生产验收标准（瑞典要求和欧洲指南），并可用于临床实践指南及瑞典标准血小板输注方法所规定的、需要血小板输注的患者支持治疗。

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
全血捐献、初级分离与血小板制备
采血包	Fenwal	R6485	顶部/底部设置
自动化组分提取器	Fenwal	Optipress-II
血液混合器与称重系统	Baxter	Easymix V3
血小板白细胞过滤装置	Fenwal	K4R7042
离心	Hettich	Roto Silenta 63 RS	版本 5.5
血小板添加液 - SSP+	MacoPharma	SSP2030U	300 ml
无菌管路焊接仪	Terumo	T-SCD
INTERCEPT 处理 &和储存
INTERCEPT 处理套装	Cerus	INT2503	双存储（DS）装置
INTERCEPT 光源装置	Cerus	INT100
PC样品套装	Fenwal	FTX 1122
培养箱	赫尔默	PC2200/PC3200
振荡器	赫尔默	PF48H/PF96H
评估 体外 血小板功能
血气分析仪	血气分析仪	ABL 735	用于pH、血气和乳酸测定
化学系统	Ortho Clinical Diagnostic	Vitros 5.1	用于葡萄糖测定
血细胞分析仪	Boule Medical AB	Medonic CA620-Cellguard	用于血小板计数检测
流式细胞仪	BD	FACSCanto	用于白细胞计数