本文描述了一种涉及FRET（福斯特共振能量转移）信号定量分析的新方法，用于研究酶动力学。通过该方法获得了SENP1（SUMO/Sentrin特异性蛋白酶1）催化结构域对pre-SUMO1（小泛素样修饰蛋白1）水解反应的KM和kcat值。这种基于定量FRET的蛋白酶动力学研究的一般原理可应用于其他蛋白酶的研究。
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摘要
摘要
蛋白质与泛素或泛素样蛋白（Ubls）之间可逆的翻译后修饰被广泛用于动态调控蛋白质活性，并在多种生物学过程中发挥重要作用。例如，SUMO可通过共价修饰大量蛋白质，在细胞周期调控、细胞存活与死亡、DNA损伤应答以及应激反应等多种细胞过程发挥关键作用1-5。SENP作为SUMO特异性蛋白酶，既可作为内肽酶参与SUMO前体的成熟过程，也可作为异肽酶从靶蛋白上切除SUMO，从而维持SUMO化循环的更新 1,3,6,7.
酶的催化效率或特异性最好通过动力学常数的比值 kcat/KM 来表征。在多项研究中，SUMO-SENP 配对的动力学参数已通过多种方法测定，包括基于聚丙烯酰胺凝胶的蛋白质印迹法、放射性标记底物、荧光化合物或荧光蛋白标记底物8-13。然而，基于聚丙烯酰胺凝胶的技术虽然使用了“天然”蛋白质，但操作繁琐且技术要求高，难以进行详细的定量分析。使用四肽或带有 ACC（7-氨基-4-羰甲基香豆素）或 AMC（7-氨基-4-甲基香豆素）荧光基团的蛋白质作为底物所得的 kcat/KM 值，要么比天然底物低达两个数量级，要么无法明确区分 SENP 的异肽酶和内肽酶活性。
最近，基于FRET的蛋白酶检测方法被用于研究去泛素化酶（DUBs）或SENP蛋白酶，所用的FRET荧光对为青色荧光蛋白（CFP）和黄色荧光蛋白（YFP）9,10,14,15。受体发射光与供体发射光的比值被用作定量参数，以监测FRET信号并确定蛋白酶活性。然而，该方法忽略了受体和供体自身荧光在受体和供体发射波长处的信号串扰，因此不够准确。
我们开发了一种基于FRET的新型高灵敏度、定量蛋白酶检测方法，用于测定SENP1对pre-SUMO1成熟过程的动力学参数。通过使用经基因工程改造的FRET荧光对CyPet和YPet，其FRET效率和荧光量子产率显著提高，构建了CyPet-(pre-SUMO1)-YPet底物16。我们分别在受体和发射波长处对供体和受体贡献的绝对荧光信号以及FRET信号进行了区分和定量。测得SENP1对pre-SUMO1的kcat/KM值为(3.2 ± 0.55) × 107 M-1s-1，该数值符合典型的酶促反应动力学参数。因此，该方法是可靠的，也可作为通用策略用于表征其他蛋白酶。
方案
1. 质粒构建
- 通过 PCR 扩增基因的开放阅读框，并将 PCR 产物克隆至 PCRII-TOPO 载体中。
- 通过测序确认产物，并将编码 CyPet-(pre-SUMO1)-YPet、CyPet-SUMO1、YPet 以及 SENP1 催化结构域的 cDNA 克隆至 pET28 (b) 载体中，形成带有N端六聚组氨酸标签的重组质粒。
2. 蛋白质表达与纯化
- 转化 大肠杆菌 菌株的细胞 BL21 (DE3）与编码 CyPet-(pre-SUMO1)-YPet、CyPet-SUMO1、YPet 以及 SENP1 催化结构域的 pET28(b) 载体。
- 在2xYT培养基中于37°C培养转化后的细菌3小时 37 °C （以250 rpm振荡）至600 nm处的光密度达到0.5。
- 添加 100 μM 异丙基-β-D-硫代半乳糖苷（IPTG）（终浓度）以诱导蛋白表达，并于37 °C下振荡培养16小时 25 °C 200 rpm 条件下。
- 通过在 10,000 rpm 条件下离心收集细菌 4 °C 5分钟，然后将它们重悬于含有20 mM Tris-HCl（pH 7.4）、50 mM NaCl和5 mM 咪唑的缓冲液中。
- 使用 MiSonics 4,000 超声破碎仪，以 25 ....
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讨论
FRET 技术已被用于研究 SENP1 对 pre-SUMO1 成熟过程的作用9。实验中采用 CFP-YFP 作为 FRET 荧光对，并通过比率分析法（即受体与供体发射光强度的比值）来表征其动力学特性。然而，传统的比率 FRET 分析未考虑供体和受体的自体荧光问题，因此该比值并不能直接反映底物消化量。
本文报道了一种新开发的高灵敏度基于FRET的蛋白酶检测方法，用于研究SENP1对前体SUMO1成熟过程的动力学。与以往的比率法相比，我们从理论上对FRET信号在动力学分析中的应用进行了根本性改进，并建立了实验流程，通过定量分析供体和受体的自荧光以及真实的FRET诱导的受体发射，来准确获取动力学参数。传统的比率分析法无法实现这一点。忽略供体和受体的自荧光发射会导致对FRET信号及供体发射的高估。这种高估对最终的kcat/KM比值影响可能不大（比率法分析结果为3.81 × 107 M−1s−1，而本定量FRET分析为3.2 × 10
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披露
未声明任何利益冲突。
致谢
我们非常感谢 Victor G.J. Rodgers 提供的宝贵建议。感谢廖组所有成员的密切合作以及对本研究的帮助。本研究由美国国立卫生研究院资助（J.L. 获资助号 AI076504）。
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| PCR II TOPO 试剂盒 | Invitrogen | K466040 | |
| 2xYT | Research Products International Corp. | X15600 | |
| Ni-NTA Agarose | Thermo Scientific | 88222 | |
| Coomassie Plus（Bradford）测定试剂 | Thermo Scientific | 23238 | |
| 384 孔板（玻璃底） | Greiner | 781892 | |
| FlexStation II 384 孔板读板仪 | Molecular Devices |
参考文献
- Johnson, E. S. Protein modification By SUMO. Annual Review of Biochemistry. 73, 355-382 (2004).
- Gill, G. SUMO and ubiquitin in the nucleus: different functions, similar mechanisms. Genes & Development. 18, 2046-2059 (2004).
- Hay, R. T.
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