斑马鱼幼鱼的微量灌胃

摘要

我们介绍一种利用标准胚胎显微注射和体视显微镜设备对斑马鱼幼鱼进行微量灌胃的新方法。我们证明，微量灌胃是一种安全且高效的技术，可用于将精确控制的多种物质特异性地递送至斑马鱼幼鱼的肠腔内。

摘要

斑马鱼已成为研究肠道发育^1-5、生理学^6-11、疾病^12-16以及宿主-微生物相互作用^17-25的强大模式生物。研究肠道生物学的实验方法通常需要将特定物质以体内方式导入肠道腔内。在斑马鱼幼鱼模型中，这一过程通常通过将鱼浸泡于含有目标物质的溶液中，或通过腹壁注射来实现。采用浸泡法时，难以准确监控或控制物质进入肠道的途径和时间，因此可能导致非预期的毒性及其他对肠外组织的影响，限制了可递送至肠道的物质剂量范围。此外，在浸泡暴露过程中，不同个体幼鱼摄入的物质量可能存在显著差异²⁶。尽管通过腹壁直接注射可避免上述问题，但正确实施注射操作难度较大，且会造成组织损伤，可能影响实验结果。 我们介绍一种斑马鱼幼鱼的微量灌胃方法。该方法旨在提供一种安全、高效且可重复的方式，以精确控制时间，将物质直接递送至斑马鱼幼鱼前肠腔内。微量灌胃技术利用大多数斑马鱼研究实验室常见的标准胚胎显微注射设备和体视显微镜。一旦将鱼体在甲基纤维素中正确固定，灌胃操作可快速完成，速度约为每分钟7–10尾，且灌胃后的存活率接近100%，具体取决于所灌注物质的性质。我们还证明，微量灌胃可将高浓度的物质导入肠道腔内，而这些物质若通过浸泡方式暴露则会对鱼体致死。为展示该方法的应用价值，我们提供了一种荧光标记葡聚糖微量灌胃检测法，可用于量化物质从肠道腔向肠外空间的转运情况。该检测可用于验证微量灌胃操作的准确性，同时也提供了一种新颖的斑马鱼检测手段，用于在不同实验条件下（例如基因操作、药物处理或环境因素暴露）评估肠道上皮屏障的完整性。此外，我们展示了如何通过灌胃荧光微球并监测其后续转运过程，来评估肠道蠕动功能。微量灌胃可用于递送多种物质，包括活体微生物、微生物分泌因子/毒素、药理学试剂以及生理探针。凭借这些能力，斑马鱼幼鱼微量灌胃方法有望推动利用斑马鱼模型系统的广泛研究领域的发展。

方案

我们采用已发表的标准斑马鱼饲养和维护方案来获取用于微量灌胃的幼鱼²⁷。我们主要通过自然繁殖方式繁育斑马鱼，并将其维持在14小时光照/10小时黑暗的循环条件下。本方案已针对受精后6至7天（dpf）的斑马鱼幼鱼微量灌胃进行了优化。我们预计，经过少量修改后，这些方法也可普遍适用于更早或更晚的发育阶段。除非另有说明，实验中主要使用6 dpf的野生型TL斑马鱼品系，且实验前未进行喂食。所有实验均在来自常规斑马鱼养殖设施的系统水中进行；但也可使用其他合适的斑马鱼培养基（例如胚胎培养基或无菌斑马鱼培养基（GZM）²⁸）。在本方案中，“斑马鱼培养基”指用户自行选择的培养基。

1. 甲基纤维素的制备、灌胃模具及微灌胃针的制作

在实验前一天或实验当天尽早准备好甲基纤维素、用于幼虫固定的琼脂糖模具以及微量灌胃针头。

1. 将3 g甲基纤维素溶解于100 ml无菌去离子水或斑马鱼培养基（根据具体应用选择）中，配制成3%溶液。向瓶中加入磁力搅拌子，将水加热至接近沸腾，置于磁力搅拌器上高温搅拌。在搅拌过程中，缓慢撒入甲基纤维素，确保其不结块。在当天内逐渐降低搅拌速度和搅拌器温度，直至达到室温。
2. 继续缓慢搅拌过夜，直至甲基纤维素完全溶解。溶液可在密封容器中室温保存数月。
3. 使用塑料模具（Adaptive Science Tools, TU-1）在10 cm培养皿中制备3%琼脂糖凝胶模具，具体操作按照制造商说明进行。用封口膜密封后，于4 °C保存以防干燥。实验前升温至室温或28 °C。琼脂糖模具通常可重复使用多次。
4. 使用硼硅酸盐玻璃毛细管和配备宽槽加热丝（FT330B）的Flaming Brown微电极拉制仪拉制若干灌胃针。我们用于制针的程序如下：

针头类型	压力	加热	拉力	速度	时间
胚胎	500	315	100	50	200
灌胃	500	315	125	75	200

由于不同仪器的拉制丝可能存在差异，需记录升压时间（主动加热时间）。本程序的升压时间范围为 8.57–8.79 ms。该程序制备的针尖比传统的显微注射针更短且更粗壮（图 1）。这些参数可能需要根据不同型号的微电极拉制仪进行优化。

2. 微量灌胃针的剪切、装样与校准

注意*：针头修剪是本方案中的关键步骤。此外，针头装载和校准的方法将根据所使用的显微注射仪类型而有所不同。我们已使用 Drummond II 型显微注射仪对该方案进行了优化，但预计本方案经轻微调整后也可适用于其他类型的显微注射仪器。由于不同实验室的注射装置和拉针仪可能存在差异，因此测量和校准注射体积至关重要（参见第 2.8 节）。

1. 在体视显微镜下剪切针头。我们使用放大倍数设为2.5倍的Leica S6E体视显微镜。在此设置下，目镜测微尺上100个刻度的总长度为2 mm。
2. 将针尖与测微尺末端对齐（即第100刻度处），然后使用尖头钟表镊在距离针尖约1 mm处（第48–50刻度）剪断针头（图1A）。
3. 针头直径应约为27–30 μm，且端部应钝化。在100倍放大倍数下检查针尖。尖锐或不规则的针头在灌胃过程中更容易造成组织损伤，应尽可能避免使用。
4. 如有条件，可使用微电极拉制仪更精确地控制剪切位置，并对针尖进行火焰抛光以去除锋利边缘（图1B）。
5. 配制灌胃溶液。在大多数应用中，我们在杜氏磷酸盐缓冲液（DPBS）（Sigma-Aldrich）中加入0.5%酚红溶液，稀释10倍（1:10），以确保在体视显微镜下可观察到溶液，从而监测显微注射仪的工作状态以及灌胃液是否准确注入前部胃球。其他染料尚未经过评估，但也可考虑使用。
6. 使用带有25G 5/8针头的1 ml注射器将矿物油注入灌胃针中，完成针头的准备，并将其安装到Nanoject II显微注射仪上。
7. 用Parafilm膜包裹一个10 cm的塑料培养皿，以提供一个平整、防水的表面，将约2 μl灌胃溶液点样于膜上。手动回填灌胃针，注意避免在矿物油中产生气泡。
8. 为测试显微注射仪功能并校准喷出体积，将矿物油注入3 cm培养皿中，并向油中连续注射，直至液滴大小一致。使用测微尺或体视显微镜自带的测量功能测定液滴直径（如配备）。根据公式计算液滴体积（公式：V=4/3πr³）。不同针头之间的体积一致性可绘图表示（图1C）。
9. 开始灌胃前，将针尖反复浸入洁净的斑马鱼培养液中进行冲洗，以去除残留的矿物油。矿物油密度较高，若未从针尖清除，可能对上皮组织造成损伤。

3. 斑马鱼幼鱼的麻醉、固定与灌胃

1. 实验前将琼脂糖模具在室温或28 °C下预热。
2. 用3%甲基纤维素覆盖模具上的3条凹槽，以准备灌胃操作。甲基纤维素的用量应足以覆盖凹槽并固定斑马鱼，但不宜过少，以免迅速干燥。
3. 在洁净的6孔板中，将各实验组的斑马鱼幼鱼分别加入不同的孔中，每孔含3.5–4.0 ml斑马鱼培养液。
4. 在适当的斑马鱼培养液中配制3倍浓度的三卡因溶液（0.05% w/v）。每次对一孔幼鱼进行麻醉处理，向含幼鱼的孔中加入等体积的3倍三卡因溶液，使终浓度为1.5倍（0.025%），并轻轻摇晃混匀。
5. 一旦斑马鱼停止活动，立即使用宽口玻璃巴斯德吸管和吸管泵将其从孔中取出，并逐个放置于甲基纤维素上，使鱼头位于凹槽45°角处，鱼尾朝向90°角方向。用钝头解剖探针轻轻按压斑马鱼，使其固定在甲基纤维素中。
6. 调整Nanoject II微量注射装置，使注射针倾斜角度较小，大致与琼脂糖模具的45°角平行。确保注射针的伸展范围足以超过模具孔底部，以便在斑马鱼定位后减少进一步调整。
7. 将微量注射仪设置为“慢速注射”模式（23 nl/sec），单次释放体积设为4.6 nl（最大值）。在此参数下，注射体积应刚好充满肠道前膨大部分，而不从食管或泄殖腔泄漏。根据实验目的，也可使用更小的注射体积。
8. 一手轻微调整固定幼鱼的培养板，同时另一手操控微量注射仪的操纵杆。
9. 轻柔地将灌胃针插入麻醉后的斑马鱼口中，经食管推进，并轻微下压食管括约肌，使灌胃针尖端刚好进入肠道前膨大部分内（图2，步骤1–2，a&b）。
10. 针头进入肠道前膨大部分后，轻踩脚踏开关或按下注射按钮，缓慢注入样品。随后迅速而平稳地撤出针头，尽量避免将大量样品释放回食管中（图2，步骤3–4）。
11. 完成灌胃后，使用宽口玻璃巴斯德吸管和吸管泵将斑马鱼幼鱼轻柔转移至新鲜培养液中。在吸管中吸入水至颈部弯曲处上方约1英寸处，在幼鱼头部附近的甲基纤维素中制造一个小水袋以释放幼鱼，轻柔地将鱼头提起并进入吸管口，将幼鱼从甲基纤维素中吸出。随后将幼鱼连同所有水体轻柔排出至盛有新鲜培养液的培养皿中。
12. 通过轻柔吹打或多次冲洗培养液的方式清洗幼鱼，以去除残留的甲基纤维素并帮助其从麻醉状态恢复。将幼鱼转移至培养皿或6孔板中，待后续成像与分析时使用。

4. 右旋糖酐检测法评估灌胃安全性和肠道屏障完整性

微量灌胃可用于将多种物质递送至肠道。例如，我们提供以下方案：通过灌胃给予与德克萨斯红标记的10 kD葡聚糖，以分析肠上皮屏障的完整性。旁细胞通透性至少存在两条潜在途径，根据溶质的电荷和大小选择性不同，分别称为“孔道”或“渗漏”途径²⁹。由于该葡聚糖分子过大，无法通过旁细胞孔道途径（尺寸限制约4Å，10 kD葡聚糖直径约23Å）被肠上皮吸收^9,30-32，因此若肠道屏障完整性未受损，其应保留在肠腔内。尽管10 kD葡聚糖可能通过旁细胞渗漏途径转运，但该途径容量较低且动力学较慢^29,33，因此在本检测的时间范围内不太可能发生。使用EDTA作为破坏屏障完整性的“阳性对照”处理，因其可破坏上皮紧密连接^34,35。该葡聚糖灌胃检测可作为质量控制试验，证明灌胃操作安全进行，未造成意外的组织损伤。此外，该检测还可用于评估基因型或处理因素对肠道屏障完整性的影响。

1. 配制以下灌胃溶液：1% 右旋糖酐/1× PBS/0.05% 酚红，以及 1% 右旋糖酐/20 mM EDTA/1× PBS/0.05% 酚红（阳性对照）。5% 右旋糖酐母液溶于 ddH₂O 中，分装为 50 μl 每份，于 -20 °C 保存，以减少冻融次数。同时，配制不含右旋糖酐的对照灌胃溶液：1× PBS/0.05% 酚红。

				+ 对照（EDTA）	无 EDTA
	储备液	终浓度	稀释倍数	10 μl	10 μl
EDTA，pH 8	200 mM	20 mM	10	1	0
葡聚糖	5%	1%	5	2	2
PBS	10x	1x	10	1	1
酚红	0.50%	0.05%	10	1	1
			小计：	5	4
			ddH2O：	5	6
			总量：	10	10

2. 针对每种实验条件，使用第3节中的方案对10-20条斑马鱼幼鱼进行灌胃处理。如有可能，应设置重复或三重复实验组。
3. 灌胃后，使幼鱼从麻醉状态恢复，并将其置于新鲜培养液中自由游动。
4. 灌胃后18-20分钟，按照步骤3.3的方法重新麻醉幼鱼。将幼鱼置于3%琼脂糖块上，并用3%甲基纤维素固定（以减少成像时的背景反光）。
5. 使用荧光体视显微镜（例如，Leica M205C）配合Texas Red滤光片，在能够完整显示幼鱼从吻部至肛门后缘的放大倍数下进行成像。
6. 所有图像应在相同的曝光参数下采集，以便后续进行定量和比较。所有注射葡聚糖的幼鱼肠道腔内均会呈现强烈荧光，而屏障功能则通过观察葡聚糖在肠外组织（即，躯干组织和血管）中的渗漏程度来评估（图5）。调整曝光参数，确保能够清晰观察到躯干部位的荧光信号，即使这会导致肠腔荧光过曝。
7. 合理安排各组的灌胃时间，使每组幼鱼在灌胃后的恢复时间大致相同，并在相近的时间点进行成像。本实验中，每组操作由一人完成约需1小时。幼鱼在灌胃后18-20分钟进行麻醉，每条鱼的成像时间约为1-2分钟。
8. 使用ImageJ等图像分析软件，定量分析肠道上方躯干部位区域的平均荧光强度。通过减去图像中鱼体外区域的背景荧光值，对所得数据进行背景校正。
9. 使用GraphPad Prism或类似的统计分析软件对图像分析所得数据进行绘图与统计分析。

5. 荧光微球检测法检测肠道蠕动功能

灌胃法可更精确地控制物质递送至肠道的时间和剂量，因此是肠道动力学研究的理想替代方法。既往发表的斑马鱼幼鱼肠道动力学检测技术包括通过显微镜直接观察肠段收缩和蠕动波^1,21,36，或喂食掺有黄绿色荧光聚苯乙烯微球的食物²⁶。在某些研究中，通过将幼鱼浸入含食用染料的培养液³⁷，或采用一种称为时空图谱分析（spatiotemporal mapping）的特殊视频分析技术^38,39，进一步提高了肠道动力学模式的定量能力。本文提供一项概念验证研究，证明可将荧光微球灌胃至肠道前部盲囊，通过追踪微球的移动可用于评估肠道动力学（图6）。本方法与Field及其同事²⁶所用方法的主要区别在于，微球单独引入，无法因灌胃针直径限制而掺入食物中。

1. 将斑马鱼幼鱼饲养于直径10 cm的培养皿中，每皿加入35 ml培养基，直至7 dpf进行实验。从5 dpf开始，每天早晨喂食一次幼鱼饲料（幼鱼饲料配方如前所述⁴⁰），每次约0.6 mg（使用无菌的1 mm接种环给药）。
2. 轻轻摇动Fluoresbrite YG 2.0 μm聚苯乙烯微球（~2.5%水悬浮液）瓶，使悬浮液充分混匀。取一滴悬浮液滴加至Parafilm膜上，以便用移液器准确量取特定体积。
3. 将微球转移至离心管中，在台式微量离心机中低速离心，弃去上清液，加入与原始体积相等的1×PBS重悬。重复该步骤，共洗涤微球2次。
4. 配制灌胃悬浮液，含0.25%微球（即原液1:10稀释）、1×PBS和0.05%酚红。每条幼鱼灌胃体积为4.6 nl，其中约含2.6×10³个微球。
5. 按照第3节中的方案对所需数量的幼鱼进行灌胃。由于微球具有一定浮力，因此灌胃操作应尽可能迅速，以最大程度保持悬浮液的均匀性。
6. 本实验中，共对15条幼鱼进行灌胃，麻醉恢复后将其分别置于12孔板的单个孔中，以便单独追踪个体内的微球转运情况。然而，也可对较大群体进行灌胃，并以群体为单位评估转运情况，而非个体追踪。标准操作可参考Field et al. 的研究²⁶。
7. 使用荧光体视显微镜，在不同时间点观察活体幼鱼肠道内荧光微球的最前端（或最前部）位置，以评估肠道蠕动功能。简要步骤为：用1×（0.017%）三卡因对幼鱼进行短暂麻醉，记录微球所在区域或拍摄图像以供后续分析评分。
8. 绘制并比较随时间变化，微球位于特定肠段的幼鱼占总数的百分比。

结果

正确进行灌胃操作时，所给予的物质应完全停留在前肠内，食管中残留的物质应极少或没有（图3）。所选择的给药体积应能够容纳于前肠膨大部分，且不会从泄殖腔或食管漏出。如果给予的物质体积过大或推注压力过高，灌胃的物理作用力可能导致上皮组织损伤或物质渗漏。还可能将管腔内其他成分（例如，胆汁或黏液）推出或改变其分布，从而改变局部生化环境，并可能干扰实验结果。通常情况下，在给予物质后迅速撤出针头，可使食管括约肌闭合，防止物质大量反流至食管。

与浸泡法相比，该灌胃方法可更精确地控制物质暴露于幼年斑马鱼组织的时间和途径（图3）。在使用荧光内吞示踪剂FM4-64FX进行灌胃的幼鱼中，递送至肠道组织的物质含量比浸泡在探针溶液中的幼鱼更为一致（图3A-B）。在浸泡约1小时的幼鱼中，FM4-64FX可在全身的外部上皮组织中检测到，但在肠腔内的信号相对较弱（图3A.ii），而灌胃幼鱼的肠腔内则显示出明显更强的信号（图3B.

讨论

在本研究中，我们描述了一种通过微量灌胃直接将物质递送至幼年斑马鱼肠道的新方法。整个操作过程中有几个关键步骤需要特别注意。首先，在进行灌胃实验前，斑马鱼幼鱼应保持良好健康状态，以避免与处理无关的死亡。另一个重要因素是灌胃针的质量。该方案中最困难的步骤之一是在适当位置剪切针头时，避免产生锋利或参差不齐的边缘。可使用微电极拉制仪（micropipette microforge）实现更一致的断裂，并对针尖进行火焰抛光，以消除锐边。尽管此类设备并非必需，但经微电极拉制仪加工的针头确实能降低操作过程中损伤幼鱼的频率。此外，微量灌胃也可在不使用琼脂糖模具的情况下，将样本固定于3%甲基纤维素中完成。然而，使用模具有助于正确固定鱼体位置，从而提高同时对多条鱼进行灌胃的速度，并减少导致物理损伤的操作失误。

与目前用于斑马鱼模型肠道载样的其他常规方法相比，该技术具有多项优势。其中最重要的优势在于，该技术能够更精确地调控引入物质的剂量以及递送的时间。这些因素对于分析物质在肠道内的吸收或转运动力学至关重要。为了让物质进入肠腔并被肠上皮吸收，斑马鱼幼体必须随水吞咽或摄取底物。然而，不同个体之间的吞咽频率和吞咽...

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
芬奎尔（三卡因甲磺酸盐）	Argent Chemical Laboratories	MS-222	幼虫麻醉
酚红溶液	Sigma-Aldrich	P0290-100 ml	DPBS 中 0.5%，经细胞培养测试
轻质白色矿物油（高纯度）	Amresco	J217-500 ml	用于针头回填和体积检测
TxRed-葡聚糖，10,000 分子量，赖氨酸可固定	Invitrogen/ Molecular Probes	D-1863	1× PBS/酚红中 1% 悬浮液
FM4-64FX	Invitrogen/ Molecular Probes	F34653	水中 5 mM 储存液
甲基纤维素	MP Biochemicals	0215549590
硼硅酸盐玻璃毛细管	Drummond Scientific	3-000-203-G/X	外径 1.14 mm，内径 0.53 mm，长度 3.5 英寸
用于模具制作的塑料模具	Adaptive Science Tools	TU-1
Nanoject II 微注射仪	Drummond Scientific	3-000-204
Flaming Brown 微量移液器拉制仪，3.0 mm 宽槽灯丝	Sutter Instrument Co.	P-97, FT330B	针头制备
学生型 Dumont #5 镊子	Fine Science Tools	91150-20	0.1 × 0.06 mm，用于剪切针头
目镜测微尺，5 mm - 100 分度	Leica	10394771	针头剪切
显微操作仪	Narishige	MF-900	针头剪切和火焰抛光
结核菌素 SlipTip 注射器针头	Becton Dickinson	309626	1 ml，25G 5/8 针头
Fluoresbrite YG 微球（2.0 μm）	Polysciences, Inc.	18338	肠道蠕动分析
解剖显微镜	Leica	S6E	灌胃操作
荧光体视显微镜	Leica	M205C	葡聚糖屏障检测
共聚焦显微镜	Zeiss	LSM510	循环中葡聚糖的成像