清醒小鼠中枢神经系统治疗药物的鼻内给药

摘要

本文介绍了一种在非麻醉状态下通过鼻内给药以靶向小鼠大脑的方法。该方法可在无需麻醉的情况下，通过鼻腔途径进行长期、重复给药，实现药物从鼻腔到大脑的递送，并使全身暴露最小化。

摘要

鼻腔给药是一种将治疗剂递送至中枢神经系统（CNS）的方法。该方法具有非侵入性，可使无法通过血脑屏障的大分子物质进入中枢神经系统。通过鼻腔给药，药物可直接靶向中枢神经系统，减少全身暴露，从而降低不必要的全身性副作用¹。药物从鼻腔到中枢神经系统的递送可在数分钟内通过嗅觉和三叉神经通路经细胞外途径完成，无需药物与任何受体结合或依赖轴突转运²。鼻腔给药是一种广受关注的方法，目前已被用于人类临床试验³。

在动物模型中进行鼻内给药可实现对药物药代动力学分布和疗效的初步评估。使用小鼠时，可通过一种特殊的鼻内固定手法，定期对清醒（非麻醉）状态的动物进行给药。清醒状态下给药具有多种优势：可实现长期慢性给药而无需麻醉，操作时间较麻醉条件下更短，且该技术易于学习和掌握，使得多个技术人员组成的团队可在短时间内完成大量小鼠的给药操作。已有多个研究证实了此类鼻内给药方式在小鼠中的治疗效果，例如在糖尿病小鼠模型中应用胰岛素^4-6，以及在阿尔茨海默病小鼠模型中应用去铁胺^7,8。

小鼠的鼻内给药抓握方法可以学会，但并不容易，需要练习、技巧和精确的抓握，以有效将药物递送至大脑，并避免药物流入肺部和胃部。操作时，用非惯用手以改良的背部抓握法固定小鼠，使其颈部与地面平行，同时用惯用手使用移液器进行给药。通常需要经过3至4周的适应性操作训练，小鼠才能在此抓握方式下不再产生应激反应。我们制作了本JoVE视频，以使这一鼻内给药技术更易于掌握。

方案

1. 对清醒小鼠进行鼻内给药前的抓取适应

引言

在开始经鼻给药前，小鼠需经过两到四周的抓握适应期。抓握适应非常重要，因为它有助于确保小鼠保持正确的体位，从而最大限度地提高清醒状态下经鼻给药的效果。此外，未充分适应此过程的小鼠在给药后可能出现严重的焦虑反应。根据小鼠对抓握的适应程度，每一步骤应持续约2至3天后再进入下一步。应以小鼠的应激水平作为评估进展的指标，即通过监测小鼠的活动情况、排尿量/频率、排便、颤抖及咬人行为来判断。若小鼠表现出较高的应激反应，则应在当前步骤停留更长时间，直至反应减轻后再进入下一步。示例性适应程序见表1。小鼠的适应过程应按以下每日一次的步骤依次进行。不建议每日执行超过一次这些步骤以试图加快适应进程。

1. 将小鼠置于手掌中2至3分钟，高度不超过笼顶一英尺，因为动物在此初始步骤中常会跳跃。如果小鼠试图爬出手掌并沿手臂向上移动，只需抓住其尾根部将其轻轻提起，放回手掌中。
2. 将小鼠置于手掌中3分钟，并轻柔抚摸动物。抚摸时应沿头部向尾部方向进行，同时允许小鼠在手中自由活动。
3. 将小鼠置于手掌中3分钟，同时按摩其耳后区域（用拇指和食指轻轻捏住颈部后方皮肤）。
4. 用手抓住小鼠颈部皮肤（scruff）提起并保持30秒，然后将其放回笼顶休息30秒，之后重复一次抓握操作。
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结果

评估药物递送效果的方法有多种。第一种方法是通过鼻内给予染料（如印度墨水或亚甲蓝），在动物安乐死后观察染料在嗅上皮内的分布情况，并在取出脑组织后观察其是否经筛板进入中枢神经系统（CNS）。第二种方法是通过放射性标记示踪或酶联免疫吸附测定（ELISA）检测未标记分子，以定量测定递送至目标部位的药物含量。关于清醒小鼠给药后药物在中枢神经系统内分布的一个良好示例，可参见Hanson et al. 2012⁷。我们预期给药后药物在嗅球和三叉神经中浓度较高。在鼻内给予3.65 μmol去铁胺30分钟后，三叉神经和嗅神经中的药物浓度分别为29 μM和13 μM。药物浓度在整个脑区均可检测到（本例中测得浓度范围为0.6 μM至4.1 μM），其中接受嗅神经和三叉神经传入的区域浓度更高。例如，大脑皮层的吻侧区域药物浓度高于尾侧皮层，脑桥的药物浓度高于中脑或延髓。在脊髓中，通常可观察到从颈段到腰段呈递减的药物浓度梯度（本例中梯度范围为1.5 μM至2.0 μM）。鼻内给药还可使药物在脑膜和颈部淋巴结中达到较高浓度。证明递送有效的第三种方法是检测药物引起的生物学行为或生化反应。例如，对转基因阿尔茨海默病小鼠进行鼻内去铁.......

讨论

本方法展示了如何在不使用麻醉剂的情况下，通过鼻内给药的方式向小鼠定期递送药物以靶向大脑。鼻内给药可轻松地对大量小鼠进行长期给药。单人可在一小时之内完成对多达20只小鼠组成的单一群体的鼻内给药处理。已有大量分子被证实可通过该途径快速靶向中枢神经系统，并在啮齿类动物模型中显示出疗效，这些分子包括从小分子铁螯合剂到生长因子乃至间充质干细胞等多种类型。从鼻腔直接递送药物至大脑的潜在机制包括沿嗅神经和三叉神经的细胞外运输，以及血管周围间隙内的大分子流动^1,10。鼻内递送至中枢神经系统是一种尤为有用的技术，因其不仅起效迅速，而且可特异性靶向中枢神经系统，从而减少全身暴露。例如，将去铁胺经鼻内给予大鼠后，脑区药物浓度升高了3–19倍，而血液中药物浓度则降低了28倍¹¹。另一个例子中，经鼻给予胰岛素可在15分钟内改善阿尔茨海默病患者的记忆功能，且不改变血浆中胰岛素或葡萄糖的水平¹²。该技术另一优势在于其非侵入性。

该方法存在若干局限性。首先，单次给药的递送量仅限于约 20–30 μl，因此治疗药物的溶解度将影响剂量上限的确定。此外.......

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
设置为 6 μl 的 P20 移液器
凝胶上样用移液器吸头
计时器
废弃吸头用废液容器
用于记录的给药记录表
笔
药物及溶剂
用于盛放药物小瓶的容器
待给药动物
备用手套
用于擦拭尿液的纸巾
表 3. 所需材料