基因组DNA中5-羟甲基胞嘧啶的选择性捕获

摘要

本文描述了一种两步标记法，首先利用β-葡萄糖基转移酶（β-GT）将叠氮葡萄糖转移至5-羟甲基胞嘧啶（5-hmC），随后通过点击化学反应连接生物素接头，从而实现简便且不受密度影响的富集。该高效且特异的标记方法可实现5-hmC的低背景富集，并通过高通量测序进行表观基因组高通量作图。

摘要

5-甲基胞嘧啶（5-mC）约占人类基因组DNA中总胞嘧啶的2%–8%，影响多种生物学功能，包括基因表达、基因组完整性维持、亲本印记、X染色体失活、发育调控、衰老以及癌症发生¹。最近，人们在哺乳动物细胞中，特别是在胚胎干细胞（ES细胞）和神经元细胞中，发现了一种5-mC的氧化产物——5-羟甲基胞嘧啶（5-hmC）^2-4。5-hmC是由TET家族铁（II）/α-酮戊二酸依赖性双加氧酶催化5-mC氧化而生成的^{2, 3}。研究表明，5-hmC可能参与胚胎干细胞（mES细胞）的维持、正常造血过程、恶性肿瘤的发生以及受精卵的发育^{2, 5-10}。为了更深入地理解5-hmC的功能，建立一种可靠且简便的测序系统至关重要。传统的亚硫酸氢盐测序法无法区分5-hmC与5-mC¹¹。为揭示5-hmC的生物学作用，我们开发了一种高效且特异的化学方法，用于标记和富集5-hmC，该方法利用了一种噬菌体酶，可特异性地将葡萄糖基团添加至5-hmC上¹²。

本文介绍一种用于选择性化学标记5-羟甲基胞嘧啶（5-hmC）的简便两步法。第一步标记步骤中，基因组DNA中的5-hmC在T4噬菌体来源的葡萄糖基转移酶（β-GT）催化下，通过将修饰型辅因子UDP-6-N3-Glc（6-N3UDPG）上的6-叠氮基葡萄糖转移至5-hmC，从而实现对5-hmC的标记。第二步为生物素化步骤，通过点击化学反应将二硫键连接的生物素分子连接到叠氮基团上。这两个步骤均具有高度特异性和高效性，无论基因组区域中5-hmC的丰度如何，均可实现完全标记，并产生极低的背景信号。在完成5-hmC的生物素化后，含有5-hmC的DNA片段可通过链霉亲和素磁珠以密度无关的方式被选择性捕获。所获得的5-hmC富集DNA片段可用于后续分析，包括新一代测序。

我们的选择性标记与捕获方案具有高灵敏度，适用于任何来源的基因组DNA，且可应对不同或多样化的5-hmC丰度。尽管本方案的主要目的是用于下游应用（即，通过下一代测序绘制基因组中5-hmC的分布图谱），但它同样兼容单分子实时SMRT（DNA）测序，后者能够实现对5-hmC的单碱基分辨率测序。

方案

1. 基因组DNA片段化

使用超声处理将基因组DNA打断至适合全基因组测序平台的目标片段大小范围。（我们通常将DNA打断至约300 bp。）通过1%琼脂糖凝胶电泳检测打断后基因组DNA的片段大小分布（图1）。

2. DNA 制备

根据基因组DNA中5-羟甲基胞嘧啶（5-hmC）的丰度确定起始DNA用量。由于不同组织类型中5-hmC水平存在显著差异，起始DNA用量需根据样本的5-hmC水平进行调整。示例请参见表1。

3. β-GT 催化的反应（葡萄糖转移反应）

1. 按照 表2 中的详细说明，用移液器吹打混合反应体系，并在 37 °C 水浴中孵育 1 小时。
2. 孵育结束后，使用 QIAquick Nucleotide Removal Kit 纯化反应产物，每根柱子上样不超过 10 μg DNA。每根柱子用 30 μl 水洗脱，合并洗脱液。

4. 生物素标记反应（点击化学）

1. 将 DBCO-S-S-PEG3-Biotin 偶联物工作液（1 mM）加入洗脱的 DNA 溶液（步骤 3 所得）中，使终浓....

讨论

5-羟甲基胞嘧啶（5-hmC）是一种最近发现的表观遗传修饰，在某些哺乳动物细胞类型中含量较高。本文介绍的方法用于确定5-hmC在全基因组范围内的分布情况。我们利用T4噬菌体β-葡萄糖基转移酶将含有叠氮基团的改造葡萄糖基团转移至5-hmC的羟基上。该叠氮基团可通过化学反应与生物素连接，从而实现对含有5-hmC的DNA片段进行检测、亲和富集及测序分析。与基于5-hmC抗体的羟甲基化DNA免疫沉淀测序技术（hMeDIP-Seq）^13-15相比，本方法具有优势；尽管hMeDIP操作简便，但其对高密度5-hmC区域存在显著偏好性，且在不同次独立富集实验中通常产生不一致的结果。而我们的方法不会引入此类偏差。

然而，就我们的标记与捕获方法而言，可能存在两个问题。第一个问题是标记与捕获的特异性。由于最近有报道称5-羟甲基尿嘧啶（5-hmU）也可作为β-GT的底物，可能会引入假阳性信号，导致富集到的片段并非特异性地与5-hmC相关¹⁶。不过，这一担忧可能并无实际依据，因为高度活跃的5-羟甲基尿嘧啶-DNA糖基化酶会持续清除这种DNA损伤，使得哺乳动物基因组.......

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
试剂
5M 氯化钠 (NaCl)	Promega	V4221
0.5M pH8.0 乙二胺四乙酸 (EDTA)	Promega	V4231
1M Trizma 碱 (Tris) pH7.5	Invitrogen	15567-027)
HEPES 1M, pH7.4	Invitrogen	15630
氯化镁 (MgCl2) 1M	Ambion	AM9530G
二甲基亚砜 (DMSO)	Sigma	D8418
吐温 20	Fisher BioReagents	BP337-100
DBCO-S-S-PEG3-生物素偶联物	Click Chemistry Tools	A112P3
1,4-二硫苏糖醇，超纯 (DTT) Superpure	Invitrogen	15508-013
QIAquick 核苷酸去除试剂盒	Qiagen	28304
Micro Bio-Spin 6 柱	Bio-Rad	732-6222
Dynabeads MyOne	Invitrogen	650-01
链霉亲和素 C1
Qiagen MinElute PCR 纯化试剂盒	Qiagen	28004
UltraPure 琼脂糖	Invitrogen	16500500
UDP-6-N3-葡萄糖	Active Motif	55013
酶
β-葡萄糖基转移酶 (β-GT)	New England Biolab	M0357
设备
超声破碎仪	Covaris
台式离心机
水浴锅	Fisher Scientific
凝胶电泳装置	Bio-Rad
NanoDrop1000	Thermo Scientific
Labquake 试管摇床	Barnstead
Labquake 试管摇床	Thermolyne
磁力分离架	Promega	Z5342
Qubit 2.0 荧光计	Invitrogen
试剂配制 10 X β-GT 反应缓冲液 (500 mM HEPES pH 7.9, 250 mM MgCl2)，2 X 结合与洗涤 (B&W) 缓冲液 (10 mM Tris pH 7.5, 1 mM EDTA, 2 M NaCl, 0.02% Tween 20)。