在两栖动物视网膜切片标本中对光感受器与二级神经元进行全细胞同步记录

摘要

我们描述了从水生虎纹蝾螈（Ambystoma tigrinum）制备视网膜薄片的方法，并解释了如何通过从感光细胞以及二级水平细胞和双极细胞获得双全细胞电压钳记录，来研究视网膜中的突触信息处理过程。

摘要

视网膜神经科学的核心任务之一是理解视网膜神经元的神经环路，以及这些连接如何调控传递至大脑的信号。视网膜中的视杆细胞和视锥细胞可捕获光子，并将光能转化为电信号，传递给其他视网膜神经元，在此经过加工处理后，通过视神经将信息传送到大脑的中枢靶区。关于视网膜环路和视觉信息处理的重要早期认识，源于 Cajal^1,2 的组织学研究，随后则来自对视网膜神经节细胞——即视网膜的输出神经元——放电活动的电生理记录^3,4。

要深入理解视网膜中的视觉信息处理过程，必须了解从光感受器到视网膜神经节细胞通路中每一步的信号传递机制。然而，许多视网膜细胞类型深埋于组织内部，因此相对难以进行电生理记录。这一局限性可通过使用垂直切片技术加以克服，在垂直切片中，位于视网膜各层内的细胞清晰可见，且便于进行电生理记录。

本文介绍一种制作幼年虎斑蝾螈（Ambystoma tigrinum）视网膜垂直切片的方法。尽管该制备最初是为尖锐微电极记录而开发的^5,6，我们在此描述一种用于光感受器与二级水平细胞及双极细胞的双全细胞电压钳记录方法，其中在操控光感受器膜电位的同时，同步记录水平细胞或双极细胞中的突触后反应。虎斑蝾螈的光感受器明显大于哺乳动物物种，使其成为实施这一技术上具有挑战性的实验方法的理想制备模型。这些实验旨在探究突触带（synaptic ribbon）的信号传递特性——这是一种仅存在于少数神经元（包括视杆细胞和视锥细胞光感受器）中的特化突触结构，非常适合维持高频率的紧张性神经递质释放^7,8——并阐明其如何贡献于视网膜第一突触的独特信号传递特性。

方案

1. 视网膜切片制备

1. 组装记录室（设计如图1所示）。在记录室上间隔约8–10 mm放置两条真空脂，形成用于灌流液流动并嵌入视网膜切片的通道。在上述每条真空脂外侧数毫米处再添加一条真空脂，作为堤坝以防止液体溢出。在记录室末端放置一小块三角形KimWipe，以确保灌流液与参比电极接触。
2. 将一片硝酸纤维素膜（约5 × 10 mm，孔径0.8 μm）压平贴附于载玻片上的两小段真空脂上。避免在硝酸纤维素膜中心正下方涂抹真空脂，以免影响视网膜的贴附。
3. 准备组织切片机时，将双刃剃须刀片折成四段，并将其中一段固定在切片臂上。用其裁切一小段硝酸纤维素膜，以确保刀片刃口能平整贴合记录室表面，从而干净地切过硝酸纤维素膜。
4. 在解剖操作台处准备一小烧杯两栖类生理盐水溶液（表1），并置于冰上冷却。
5. 通过断头法处死蝾螈。沿矢状面将头部切为两半，并用探针破坏脊髓。将半边头部置于浸有两栖类生理盐水的棉垫上，放置于油毡板上。另一半头部可用湿润纸巾包裹，于4 °C保存，供当日后续使用。
6. 摘除眼球。使用小型Vannas剪刀剪开眼球与周围眼眶之间的皮肤组织。在松解眼球前部周围组织后，向前牵拉眼球，并将剪刀滑至眼球下方，剪断眼外肌和视神经，使眼球完全脱离眼眶。
7. 将摘除的眼球置于油毡板上的棉垫上。丢弃已使用过的半边头部。修剪眼球后部多余的眶内脂肪组织。
8. 用锋利的手术刀片在角膜中央做一小切口。将精细Vannas剪刀插入切口，沿径向向外剪至锯齿缘。通过旋转油毡板或棉垫，在每次剪切之间完成围绕锯齿缘的环形切割。
9. 绕眼球完整切割一周后，将角膜和晶状体从眼杯侧方取出。将所得眼杯移至油毡板上湿润的硬质表面，用锋利剃须刀片将其切成三等份，采用轻柔的锯切动作，确保完全切透巩膜。
10. 将一至两块眼杯组织置于硝酸纤维素膜上，视网膜面朝下。将剩余眼杯组织浸入额外生理盐水中，并置于约4 °C冰箱中保存。
11. 用精细镊子轻轻将眼杯组织压向硝酸纤维素膜。滴加数滴冷的两栖类生理盐水浸没硝酸纤维素膜及眼杯组织，再用KimWipe轻吸边缘，以促进视网膜贴附。再次滴加数滴冷的两栖类生理盐水，然后剥离巩膜/脉络膜/视网膜色素上皮层，以分离出视网膜（由于未漂白的视紫红质存在，视网膜可能呈粉红色）。如有必要，剪断视神经以完全游离视网膜。
12. 若视网膜未牢固贴附，可用KimWipe吸除生理盐水，使视网膜更紧密地压向硝酸纤维素膜。随后补充生理盐水。必要时可重复此步骤。
13. 向记录室中注入冷的两栖类生理盐水，并将其转移至组织切片机载物台上。从一端至另一端将视网膜与硝酸纤维素膜切成薄条，通过每次旋转游标千分尺125 μm进行进刀。将剃须刀片轻柔但稳固地压过视网膜和硝酸纤维素膜。
14. 通过移动硝酸纤维素膜条带，将视网膜切片转移至记录室的主通道中。提起一条膜带，固定其位置，同时移动记录室至其下方，注意始终保持切片浸没于液体中。将硝酸纤维素膜边缘嵌入真空脂条中，并将其旋转90度，以便观察视网膜各层结构。
15. 将硝酸纤维素膜平整压紧于玻璃表面。即使某些区域无视网膜组织，也应沿灌流通道全长以约1 mm间隔规律放置硝酸纤维素膜条，以破坏表面张力，改善液体流动。

2. 配对全细胞记录

1. 转移完所有切片后，将记录室移至直立式固定台显微镜的载物台上，并连接参考电极导线。使用长工作距离、水浸式、40–60倍物镜对切片进行聚焦。显微镜应放置在气浮台上以减少振动，并置于法拉第笼内以降低电干扰。
2. 以1 ml/min的流速持续灌流切片，灌流液为用100% O₂饱和的两栖类生理盐水溶液。连接吸出装置，确保流入与流出平衡。可通过旋转吸管斜面末端，或调节腔室出口处KimWipe与出液针之间的距离来控制流出量。实验装置可保持在室温，也可通过帕尔贴装置降温，或直接在显微镜载物台上放置冰袋进行冷却。
3. 在弱光或红外光下观察切片，选择一对细胞——一个感光细胞（视杆或视锥细胞）及其附近的水平细胞或双极细胞——作为全细胞记录的目标。视杆细胞可通过其较大的胞体和明显的杆状外段来识别（图2A）。视锥细胞比视杆细胞小，外段较短且呈锥形。双极细胞和水平细胞的胞体位于内核层（INL）最外侧的一排（图2B 和 图2C）。
4. 在制备切片前，使用拉管仪从硼硅酸盐玻璃（外径1.2 mm，内径0.95 mm，带玻璃丝）中拉制微电极。每个微电极尖端直径应约为1–2微米。
5. 使用非金属填充针（例如由1 ml注射器或MicroFil制成的针），将细胞内液（表1）注入电极，并将其连接至电极夹持器。
6. 轻微抬升显微镜物镜。将感光细胞电极置于物镜下方，然后降低电极，使尖端刚好位于切片上方。对第二个电极重复此操作。
7. 在放大器上调节基线电流水平的任何偏移。使用5–10 mV去极化脉冲检测电极电阻。我们通常使用的电极电阻范围为10–15 MΩ，这是由于电极杆部具有较长的锥度以及两栖类电极溶液的低渗透压所致。使用较高渗透压的哺乳类溶液时，相同电极的电阻值约为8–12 MΩ。尽管我们在两栖类溶液中曾使用过电阻为3–4 MΩ、尖端直径更大的电极，但较低的接入电阻所带来的优势会被其在细胞膜上形成封接的难度增加，以及钙电流和其他第二信使敏感反应的快速衰减所抵消。
8. 在施加轻微正压的同时，将突触后电极定位至接触水平细胞或双极细胞的胞体。然后将突触前电极定位至接触视杆或视锥感光细胞的胞体。记录稳定性更高时，电极尖端接触的是内段而非胞体，尤其是在视锥细胞中。
9. 在监测电阻的同时，释放突触后电极上的正压。有时仅释放正压就足以形成吉欧姆级封接。若未形成，则使用1 ml注射器或口吸施加轻柔负压。当尖端电阻升至>100 MΩ时，施加-60 mV的保持电位。获得吉欧姆级封接后，消除电极电容瞬变，并对感光细胞电极重复封接程序，施加-70 mV的保持电位。
10. 通过口吸或注射器对每个细胞依次施加负压以破裂膜片。视杆细胞、视锥细胞和双极细胞通常在轻柔负压下即可破裂。水平细胞达到全细胞构型可能需要更强的负压（即使用3 ml注射器），并结合膜片钳放大器“zap”功能提供的强而快速的电压脉冲。膜破裂并建立全细胞构型的标志是出现全细胞电容瞬变。
11. 通过施加光刺激并施加一系列从-120 mV到+40 mV、以20 mV为增量的电压阶跃，从生理学角度确认突触后细胞的身份（图3 和 图4）。
12. 为评估这对细胞是否存在突触连接，向感光细胞施加短暂（25–100毫秒）、60 mV的去极化阶跃（至-10 mV，接近L型电压门控钙电流峰值），并在第二级神经元中观察是否存在突触后电流（图5）。较强的去极化阶跃应会引发突触后水平细胞或OFF型双极细胞中快速、瞬时的内向突触后电流，这是由视锥细胞大量囊泡释放所引起的（图5）。

结果

在蝾螈视网膜垂直切片中，神经元对光刺激反应的代表性记录轨迹如图3所示。视锥细胞、水平细胞和OFF型双极细胞在光照开始时均表现出外向电流。在光照终止时，光感受器去极化导致谷氨酸释放增加，从而在水平细胞和双极细胞的记录中引发显著的内向电流。ON型双极细胞在光照开始时产生内向电流，这是由于其通过代谢型谷氨酸受体介导的信号级联反应发生信号极性反转，并激活TRPM1通道所致⁹。水平细胞与双极细胞可通过其I-V关系加以区分（图4）。水平细胞通常具有线性或内向整流的I-V特性以及较低的输入电阻（<500 MΩ；图4A），而双极细胞则具有较高的输入电阻（0.5–2 GΩ）和外向整流的I-V特性（图4B）。图5展示了对视锥细胞–水平细胞配对（图5A）和视锥细胞–OFF双极细胞配对（图5B）进行记录的代表性结果。在每种情况下，将视锥细胞从保持电位-70 mV去极化至-10 mV，可引发视锥细胞中的电压门控钙电流以及水平细胞或双极细胞中的快速内向兴奋性突触后电流（EPSC）。这种强刺激足以耗尽每个突触带状体附近约20个囊泡的易释放池，从而产生约47 pA/带状体的EPSC¹⁰。如图5A所示，水平细胞的EPSC为232 pA，提示其从前导视锥细胞接收了5个带状体接触。根据OFF双极细胞中178 pA的EPSC（图5B）进行类似估算，表明其从前导视锥细胞接收了4个带状体接触。

	两栖类生理盐水	突触前电极内液	突触后电极内液
NaCl	116 mM	3.5 mM	3.5 mM
KCl	2.5 mM
CaCl2	1.8 mM	1 mM	1 mM
MgCl2	0.5 mM	1 mM	1 mM
HEPES	10 mM	10 mM	10 mM
葡萄糖	5 mM
Cs-glutamate*		40 mM
Cs-gluconate**		50 mM	90 mM
四乙基氯化铵		10 mM	10 mM
ATP-Mg		9 mM	9 mM
GTP		0.5 mM	0.5 mM
EGTA		5 mM	5 mM
pH***	7.8	7.2	7.2
渗透压****	245 mOsm	240 mOsm	240 mOSM

*Cs-谷氨酸盐通过在移液管溶液中用40 mM CsOH中和40 mM L-谷氨酸制备。** Cs-葡糖酸盐1 M储备液通过用45–50% D-葡糖酸中和CsOH溶液制得。***细胞外溶液的pH应使用NaOH调节，移液管溶液的pH则应使用CsOH调节。****保持移液管溶液的渗透压略低于细胞外溶液，可防止细胞肿胀并延长记录的持续时间。

表1. 本实验方案中使用的标准细胞内和细胞外溶液的组分与参数。

图1. 记录室设计。 (A-C) 记录室的俯视图、侧视图和剖面图，显示其尺寸。该记录室由一块2 mm厚的丙烯酸材料加工而成。(D) 组装好的记录室。灌流液通过一段10 cm长的聚四氟乙烯管（进液管；型号24LW）进入记录室。在记录室另一侧，通过对接一个斜面的20号金属管施加轻度负压，以吸除灌流液。在此出液管旁边是一个Ag/AgCl颗粒状参比电极。该参比电极的导线连接至前置放大器的参考输入端。在参比电极上方放置一小块KimWipe纸，以保持其与溶液接触，并调节溶液流入出液管的流速。记录室的底部由置于其凹槽边缘内的玻璃载玻片构成。载玻片用一圈真空脂固定。带有视网膜切片的硝酸纤维素膜条嵌入真空脂中，形成供溶液流动的通道。在制备切片前，先用两小滴真空脂将一块5 × 10 mm的硝酸纤维素膜固定在记录室内。将眼杯的一部分神经上皮面朝下放置在该硝酸纤维素膜上，待视网膜黏附后将其移除。点击此处查看大图。

图2. 垂直视网膜切片制备中染料标记的细胞对。 A) 通过全细胞记录时经膜片钳电极引入不同荧光染料标记的视杆细胞及其突触偶联的水平细胞图像。视杆细胞的电极内液中加入 Lucifer yellow（2 mg/ml，黄色），水平细胞的电极内液中加入 sulfarhodamine B（1 mg/ml，紫色）。荧光图像使用配备冷却 CCD 相机（Orca ER）的旋转盘共聚焦显微镜（Perkin Elmer Ultraview LCI）采集，并安装于固定式载物台显微镜（Nikon E600 FN，配备 60X、1.0 NA 水浸物镜）上。这些荧光图像与相应视网膜切片的明场图像在 Adobe Photoshop 中进行叠加。 B) 视锥细胞及其突触偶联的 OFF 型双极细胞图像。该双极细胞的轴突终末分支位于内丛状层最外层（S1）亚层，靠近内核层边界。 C) 视锥细胞及其突触偶联的水平细胞图像。注意，视锥细胞终末明显大于视杆细胞的轴突终末。尽管水平细胞可通过其椭圆形的胞体形态进行识别，但在记录前，内核层（INL）中的 ON 型和 OFF 型双极细胞的胞体难以明确区分。然而，可靶向那些由视锥细胞驱动且胞体位于外核层（ONL）的移位型 OFF 双极细胞，这类细胞可通过缺乏内节和外节结构而与视锥细胞相区分。比例尺为 20 μm。

图3. 在电压钳制条件下记录的四种不同类型视网膜神经元对强白光（持续500毫秒）刺激所诱发的电流反应。 视锥细胞(A)、水平细胞(B)和离型双极细胞(C)对光刺激均表现为外向电流。(D) 而向型双极细胞对相同光刺激则表现为内向电流。离型双极细胞(C)在基线处表现出的噪声反映了在暗处突触囊泡持续释放的现象，当光感受器在光照下发生超极化时，这种释放减少。这四种细胞的记录数据来自在白光下制备的视网膜切片中的独立实验。本示例中所用白光刺激的强度，在水平细胞和双极细胞中引发的反应相当于580 nm光子通量为1 × 10⁵ 光子/秒/μm² 的水平。

图 4. 水平细胞和离型双极细胞的电流-电压（I-V）关系。 (A) 上图，对水平细胞施加一系列从 -120 到 +40 mV、以 20 mV 为增量、持续 150 毫秒的电压阶跃所诱发的膜电流（下图）。水平细胞通常具有较低的输入电阻，其 I-V 关系呈线性或向内整流。 (B) 离型双极细胞在一系列电压阶跃刺激下的 I-V 关系。双极细胞具有较高的输入电阻，并表现出向外整流的 I-V 特性，这是由于电压门控钾电流被激活所致。

图5. 配对记录数据示例。 (A) 记录视锥细胞在膜电位从-70 mV阶跃至-10 mV、持续100毫秒时产生的电压门控钙电流（Cone I_Ca）（Cone V_m）。采用P/8漏电减法程序扣除漏电流和电容瞬变。同时记录到水平细胞中的快速兴奋性突触后电流（EPSC；HC PSC），表明这两个细胞之间存在突触连接。(B) 在另一视锥细胞接受相同刺激的情况下，记录到来自离型双极细胞的EPSC。

讨论

视网膜切片制备已被证明在分析视网膜处理视觉信息所采用的神经环路和机制方面非常有用。能够同时从突触前和突触后神经元获得全细胞记录，在这一研究中尤为关键。与平铺视网膜制备相比，通过切片更容易实现成对全细胞记录，因为切片使视网膜的不同层次得以暴露。此外，由于蝾螈的视网膜神经元较大，长期以来一直被用作视网膜研究的模型，因此提供了一个特征明确且高度表征的模型系统。

通过练习，可以常规制备出健康的蝾螈视网膜切片。以下几个关键步骤决定了实验的成败：1）确保剃刀刀片安装在组织切片器上时，能平整地贴合玻璃表面，并干净地切开组织及下方的硝酸纤维素膜。若刀片已将硝酸纤维素膜完全切开，当刀片接触载玻片表面时，应能听到轻微的“咔哒”声。2）确保视网膜已牢固黏附于硝酸纤维素膜上，否则在操作的任何步骤中，视网膜都可能从膜上漂离。3）切勿将切好的切片暴露于空气中，因为这会损伤大量表层细胞。4）确保切片和硝酸纤维素膜平整地贴附在载玻片上，以便在解剖显微镜下清晰观察到视网膜各层结构。5）调节灌流液的流入与流出速度，保持平衡，避免记录室溢出。这可防止溶液液面突然变化，从而避免引起组织的突然移动。6）选择一对彼此靠近且状态良好的细胞。胞质光滑的细胞比胞质呈颗粒状的细胞更健康。位于切片较深层的细胞更有可能保持完整的突触连接。7）确保移液管尖端在下降至细胞过程中未发生断裂或触碰到其他组织或碎屑。8）检查移液管的电阻，确保其未被碎屑或气泡堵塞，因为这些因素均会影响获得高质量全细胞记录的能力。

一些研究者并不将视网膜附着在硝酸纤维素滤纸上，而是将其包埋在琼脂块中，使用振动切片机（vibratome）制备视网膜切片。尽管我们尚未尝试这种方法，Kim et al.¹¹ 已对两种方法的优劣进行了讨论。根据他们的经验，基于琼脂的方法能够更稳定地获得视网膜层次清晰的平整切片，而基于滤纸的方法则能获得活性更高的感光细胞。

视杆细胞和视锥细胞负责将光转化为膜电位的变化。通过成对记录，可以直接操控视杆细胞或视锥细胞的膜电位，因此，尽管产生光反应的能力有助于鉴定细胞类型，但可能并非必需。因此，我们通常在白光下制备视网膜切片。然而，即使在强光照明下制备，蝾螈视网膜神经元仍可产生显著的光反应，如图3所示。这部分归因于其较大的外节体积中含有相对丰富的发色团储备，也可能反映了穆勒细胞为视锥细胞再生11-顺式视黄醛的能力¹²。为了获得完全暗适应的光反应，可以在红外照明下制备切片。在红外光下进行解剖时，我们将第三代图像增强器（GenIII image intensifiers，Nitemate NAV3，Litton Industries，Tempe，AZ）连接至解剖显微镜的目镜，并使用红外LED手电筒照射组织。对于不在解剖显微镜下进行的切片及其他操作，我们采用头戴式图像增强器。在放置膜片钳电极时，我们使用安装在直立式固定载物台显微镜上的红外敏感CCD相机（例如 Watec 502H，Watec Inc.，Middletown，NY）来观察切片。采取这些预防措施后，可以获得表现出单光子敏感性的视杆细胞反应^{6, 13}。

在视网膜切片中工作的一个局限性是，大视野视网膜神经元的长细胞突起可能在切片过程中丢失大量树突。因此，视网膜切片制备更适用于研究那些突触连接集中在胞体附近突起的细胞的生理特性。两栖类和哺乳类视网膜具有许多相同的细胞类型，并采用相似的生理机制^14-16。尽管蝾螈视网膜在许多方面是哺乳类视网膜的良好模型，但一个重要差异在于哺乳类存在专门的视杆细胞通路，该通路涉及特化的视杆双极细胞与AII无长突细胞之间的连接¹⁴。蝾螈视网膜的另一个局限性是针对该物种开发的遗传工具数量较少。然而，针对其他物种中高度保守区域设计的抗体和shRNA试剂可在蝾螈中成功应用，许多小分子抑制剂和肽类试剂也可通用。此外，通过在技术上稍作修改，还可从其他一些工具更易获得的物种中制备视网膜切片。

除了适用于成对全细胞记录外，蝾螈视网膜切片制备还可用于多种其他研究方法。如上所述，视网膜切片可结合多种电压钳制方案用于研究光反应¹⁷视网膜神经元也可加载对Ca²⁺敏感的荧光染料²⁺，Cl⁻^-，或 Na⁺ 通过膜片电极引入或浴式给药^15,18-20一种可结合突触带的荧光肽²¹ 可通过膜片移液管引入，并用于成像视网膜突触小带¹⁰ 或者，当与荧光素偶联时，可急性且选择性地损伤突触带²²我们还结合使用视网膜切片和量子点来监测视杆细胞和视锥细胞突触终末处单个钙通道的运动。²³因此，视网膜垂直切片是一种多功能的实验制备方法，可用于研究视觉信号通路中第一突触处的基本突触机制及其独特的信息处理功能。

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
组织切片器	Stoelting	51425
双刃剃须刀片	Ted Pella, Inc	121-6
硝酸纤维素膜	Millipore	AAWP02500	AAWP 型，孔径 0.8 mm
硼硅酸盐玻璃移液管	World Precision Instruments	TW120F-4	外径 1.2 mm，内径 0.95 mm
Ag/AgCl 小球电极	Warner	E206
MicroFil	World Precision Instruments	MF34G-5	34 号填充针头，长 67 mm