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方法文章

长期成年小鼠精原干细胞系建立的培养中精原干细胞与前体细胞（SSCs）的连续富集

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DOI：

10.3791/50017

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2013年2月25日

 , 
1Department of Surgery, Weill Cornell Medical College

本文内容

摘要

本文介绍了一种从成年小鼠中分离并维持精原干细胞及其前体细胞系的简单方法。该方法利用来源于成年小鼠睾丸体细胞区室的饲养层细胞。此技术适用于常见的小鼠品系，包括转基因、基因敲除和基因敲入小鼠。

摘要

睾丸中的精原干细胞和祖细胞（SSCs）是成年哺乳动物干细胞的经典范例，几乎在整个动物生命周期中维持其生育能力。尽管调控自我更新与分化的精确机制 体内 难以研究，此前已开发出多种系统用于小鼠精原干细胞（SSCs）的扩增 体外 使用特制培养基与饲养细胞的组合1-3.

大多数 体外 对精原干细胞生物学的探索大多源自新生个体建立的细胞系，这可能是由于获取成体细胞系较为困难所致4然而，大多数小鼠品系的睾丸会持续发育成熟至约5周龄。在出生后的早期阶段，睾丸结构以及体细胞和生精细胞的生物学特性均发生显著变化，包括多种干细胞相关基因表达水平的改变。因此，新生期来源的精原干细胞系可能无法完全重现成年睾丸达到稳态后持续存在的成年精原干细胞的生物学特性。

历史上，成年精原干细胞（SSC）系的建立受到多种因素的阻碍。首先，功能性干细胞的比例在成年过程中可能会下降，这可能是由于内在或外在因素所致5,6。此外，与其他成年干细胞类似，若不结合免疫筛选或其他分选策略，很难从全部成年睾丸细胞中充分富集SSC7。常用的策略包括使用隐睾小鼠作为供体细胞来源，因其干细胞与其他细胞类型的比值较高8。基于“从初始培养物中去除体细胞会破坏干细胞生态位与干细胞之间对SSC存活至关重要的相互作用”这一假设，我们此前已开发出无需免疫筛选或隐睾供体即可建立成年SSC系的方法，而是通过在培养中对SSC进行连续富集，以下简称SESC2,3。

下述方法通过分离成年供体的曲细精管，随后将细胞接种于由睾丸间质细胞系（JK1）构成的饲养层上，从而建立成年精原干细胞系，该过程操作简便。3通过连续传代，强黏附性的非生殖细胞污染物从培养物中被逐步去除，同时伴随精原干细胞（SSCs）的富集。以此方法获得的培养物包含处于不同分化阶段的精原细胞混合物，其中含有具备长期自我更新能力的精原干细胞。SESC方法的关键在于，它能够促使精原干细胞顺利完成从自我更新 体内 长期自我更新 体外 在截然不同的微环境中，产生长期存在的精原干细胞系，且无体细胞污染，从而能够对精原干细胞进行后续实验操作。

方案

1. 饲养细胞的制备

请注意，下述所有试剂均应以无菌方式制备（参见 表1 & 2）。本方案采用JK1细胞系（Cell Biolabs, Inc.，目录号#CBA-315）作为饲养层细胞，该细胞系是成年小鼠睾丸体细胞的转化衍生物，其特性已在其他文献中描述。3请注意，所有动物实验操作均应遵循机构的指导方针和规定。

  1. JK1细胞可在培养中维持，并可成功用作饲养层细胞至第39代。将JK1细胞接种于100 mm细胞培养皿（BD Falcon，货号#353003）中，加入10 ml过滤除菌的饲养层细胞生长培养基（DMEM添加10%胎牛血清[FBS]、2 mM L-谷氨酰胺和抗生素）。当细胞培养至95%融合度时，按1:6至1:10的比例进行传代。
  2. 从汇合的JK1饲养细胞单层中移除培养基。
  3. 用不含钙和镁的 PBS 洗涤细胞层一次。
  4. 加入预热的胰蛋白酶/EDTA溶液（1×，含0.05%胰蛋白酶/0.53 mM EDTA；Corning Cellgro，货号#25-051-CI），于37 °C孵育5–10分钟。
  5. 用等体积的饲养层细胞生长培养基灭活胰蛋白酶。收集细胞，在300 × g离心5分钟。用饲养层细胞生长培养基重悬细胞。
  6. 用0.4%明胶溶液预包被多孔细胞培养板，加入足量溶液覆盖孔底，室温孵育5分钟后移除。
  7. 每平方毫米接种约250个细胞2 在明胶包被的细胞培养皿中（例如 48孔或6孔板）。在37 °C培养16至24小时。
  8. 从孔中移除培养基。注意：为抑制细胞增殖，向每孔加入用DMEM稀释的新鲜丝裂霉素C溶液，终浓度为10 μg/ml（例如 每孔200 μl（适用于48孔板）。丝裂霉素C具有毒性，需小心操作并妥善处理。37 °C孵育4小时。
  9. 移除细胞中的丝裂霉素-C溶液。在接种干细胞前，用DMEM洗涤3次。
  10. 从饲养细胞孔中移除DMEM，并加入足量干细胞培养基（48孔板每孔100 μl；参见 表3以防止传代过程中饲养层细胞干燥。同一天按以下第3.1或3.4节所述方法，将精原干细胞（SSCs）接种于含饲养层细胞且指定孔径的培养板中。

2. 解离小鼠睾丸组织以获取供体生殖细胞

  1. 以无菌方式采集成年小鼠睾丸，并将睾丸暂时存放在未加液体的加盖培养皿中。必须立即将培养皿置于冰上，以防止组织干燥并维持细胞活性。
  2. 在细胞培养超净台中使用无菌精细镊子和精细剪刀，在白膜上做横向切口，但不要完全切断睾丸（即，切至约½–¾深度），然后用镊子将曲细精管挤入培养皿一角；弃去白膜及附着组织。整个操作过程中保持培养皿在冰上，以保持组织低温，从而维持其完整性并防止蒸发。
  3. 用精细弹簧剪刀快速剪切曲细精管，每对睾丸至少剪切3分钟，同时保持培养皿在冰上。
  4. 将曲细精管碎片收集至50 ml锥形管中，并用约40 ml预冷的PBS/1%牛血清白蛋白洗涤。
  5. 以60 × g离心10分钟，使曲细精管碎片与精子及碎片分离，弃去上清液。
  6. 在15 ml锥形管中，将沉淀物重悬于每对睾丸3 ml预热的解离缓冲液中（DMEM，0.05%胰蛋白酶，0.03% I型胶原酶，80 U/ml DNA酶I，0.5%牛血清白蛋白；解离缓冲液更详细信息见表2）。
  7. 将锥形管水平放置于摇床上，设置为37 °C、150 rpm，振荡15分钟，以充分混匀。
  8. 以60 × g离心10分钟，使单细胞与未解离的组织块分离。
  9. 将含有组织块的沉淀物保留至下一步使用。收集第2.8步的上清液，并加入3 ml DMEM/10%胎牛血清以中和解离缓冲液。暂时将试管置于冰上。
  10. 对第2.9步中保留的沉淀物重复执行第2.6至2.7步操作，以对第2.8步后残留的组织块进行再次消化。
  11. 加入等体积的DMEM/10% FBS以中和解离缓冲液。
  12. 将第2.11步所得悬液与第2.9步保留的细胞悬液合并，以300 × g离心5分钟。
  13. 将沉淀物重悬于干细胞培养基中，每对睾丸使用16 ml体积（见表3）。

3. 睾丸细胞悬液的接种

  1. 在含有经丝裂霉素-C有丝分裂失活的饲养细胞的6孔板中，每孔接种2 ml细胞悬液，并将培养板置于37 °C、5% CO2的细胞培养箱中。
  2. 48小时后，吸除培养基，每孔加入2 ml新鲜培养基，放回培养箱继续培养。
  3. 再过48小时后，每孔加入0.5 ml新鲜干细胞培养基，放回培养箱继续培养。
  4. 再过48小时后，此后每周喂养细胞三次，直至出现较大且界限清晰的克隆（>50个细胞）（通常在7至21天内出现）。每周第一次和第二次喂养（例如周一和周三），移除约50%的培养基，并补充等体积的50%新鲜培养基；第三次喂养（例如周五），吸除全部培养基，更换为2 ml新鲜培养基。该策略的依据在于避免完全更换培养基，以尽量减少分泌到培养基中的旁分泌信号分子浓度的波动9。

4. 初次传代的菌落挑取

  1. 移除含有待传代集落的孔中培养基，并加入新鲜干细胞培养基。
  2. 使用10倍物镜识别集落。将显微镜略微散焦后，位于孔边缘的SSC集落呈现为均一的明亮团块，由许多直径为11–12 μm的细胞组成，细胞边界难以或无法分辨，因细胞看似融合在一起（图1A）。非SSC集落可能显得更暗、更颗粒化或均一性较差，且具有可分辨的边界（图1A，插图）。
  3. 使用200 μl移液枪头，将移液器设定至50 μl，首先吸取孔中的培养基并排出，以润湿枪头。随后，用枪头轻轻触碰集落，再迅速吸取50 μl培养基，通过负压将集落吸入枪头内，使其脱离（图1B）。
  4. 将含有集落的培养基排入一个48孔板的孔中，该孔内含有经灭活的饲养细胞及100 μl干细胞培养基（图1C）。
  5. 重复步骤4.3，将最多8个集落加入同一孔中，每孔总体积不超过500 μl。
  6. 重复步骤4.3至4.5，以在48孔板的其他孔中接种一代SSC集落。
  7. 7–14天后或当出现多达500个细胞的大团块时，孔中的细胞即可进行传代（图1D）。

5. 通过吹打法对精原干细胞进行后续扩增与传代

  1. 传代一次的细胞应在培养最多14天后以1:2的分种比例接种至新鲜饲养层细胞上，前3次传代均采用该比例，之后每次传代（每7天一次）分种比例改为1:4至1:6，具体操作如下：轻柔吹打使半汇合孔中的细胞集落脱落例如 使用1 ml移液枪头，以洗涤液轻柔冲洗细胞，使约300,000个精原干细胞/6孔板孔的细胞脱落。可见克隆开始脱离。若液体流速过快或用力过大，会导致不需要的饲养层细胞同时脱落。
  2. 将研磨后的细胞收集至锥形管中，以300 × g离心5分钟。注意：如研究者需要，可在此步骤安全添加胰蛋白酶消化过程。
  3. 吸弃上清液，加入新鲜干细胞培养基，通过反复吹打彻底重悬细胞，以分散细胞团。
  4. 将 SSC 接种于经丝裂霉素-C 处理失活的新鲜制备的饲养细胞层上，具体操作如第 1 节所述。
  5. 每周喂养细胞三次，具体如下：第一次和第二次喂养（例如 周一和周三）加入相当于培养基体积50%的新鲜培养基。第三次换液时（例如 星期五），吸除所有培养基，更换为 2 ml 新鲜培养基。培养板将在 7–10 天内达到汇合状态。培养物应包含 >98% 生殖细胞（即, <1% 的污染体细胞），依据免疫染色结果（经过5-7代传代后）例如 使用小鼠生殖细胞标志物GCNA来区分生殖细胞与体细胞10注：这些方法的制定符合威尔康奈尔医学院机构动物照护与使用委员会（Institutional Animal Care and Use Committee）所颁布的法规与要求。

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结果

第7天时零代野生型成年精原干细胞集落的形态如图所示 图1三维集落由一层扁平细胞组成，这些细胞附着在饲养层细胞或饲养层细胞分泌的底层细胞外基质上，其上方则有多层精原干细胞（SSCs）生长。健康的SSCs折光性强，大小均匀，直径为11-12 μm 直径，细胞边界难以分辨，且菌落大小在同孔内以及来自不同小鼠的孔之间可能差异显著。使用带有数字显示的相差显微镜并略微散焦焦平面有助于观察菌落，这可增强均一性较高的精原干细胞（SSC）菌落与早期传代（0-2代）培养物中混杂的体细胞之间的对比度，后者无法形成紧密堆积的菌落（参见 图1A 插图）。需要注意的是，使用丝裂霉素-C灭活后，当从DMEM/10%培养基转换为干细胞培养基时，饲养层细胞的形态会逐渐发生变化。此外，初始细胞悬液不进行过滤或过筛，因为残留的体细胞团块被认为有助于干细胞在初次接种时的存活，因此不应在干细胞集落形成之前去除。连续传代（>需要经过5-7次纯化，以使生殖细胞达到近乎均一的程度（>98%）并去除残留的体细胞。如果后续实验需要从培养物中的全部生殖细胞群体中特异性富集干细胞，则可采用免疫磁珠或流式细胞术进行...

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讨论

利用成年睾丸来源的饲养层细胞诱导成年精原干细胞的方法具有较高稳定性，且在使用相同遗传背景时已取得成功（例如 FVB、C57Bl6 和混合型 129SV/C57Bl/6 以及不同的突变品系被采用2,3,7,14事实上，该培养系统所创造的微环境足以克服维持成体精原干细胞的一些遗传屏障 体内 (例如 在plzf的情况下-/- 动物7尽管我们使用JK1细胞作为饲养层细胞，但未转化的成年睾丸体细胞也可与JK1细胞同样有效地作为饲养层使用。2,3.

SESC 被设计用于高效获得长期存活的成年精原干细胞系。然而，这种高效率是以以下局限性为代价的。该方法的一个显著局限在于：在初次接种时省略了过滤或过筛步骤，且操作过程本身可能影响细胞存活率，从而导致不同孔之间接种的细胞数量存在较大差异，因此无法在初始集落形成阶段进行有效的定量分析。不过，在稍后代次的培养中可进行定量检测，此时可通过标准的胰酶消化法轻松制备单细胞悬液>传代 5-7 次。

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披露

M.S. 通过威尔康奈尔医学院向 Cell Biolabs, Inc. 授权分发 JK1 细胞，从而获得版税收入。

致谢

本研究由纽约州卫生部（C026878）提供资助。M.S. 是纽约干细胞基金会-德鲁肯米勒研究员。部分资助来自出生缺陷基金会（March of Dimes Foundation）研究基金编号 5-FY11-571。

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材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
DMEM康宁10-013解离缓冲液稀释剂
胰蛋白酶/EDTA美迪特25-051-CI
干细胞基础培养基（StemPro-34）Life Technologies10639-011根据 Shinohara 的要求进行补充 等人. (2003)*
干细胞培养基添加剂各种见表3根据 Shinohara 的要求进行补充 等人. (2003)*
JK1细胞Cell Biolabs, Inc.CBA-315可根据 Seandel 的方法替换为成年睾丸间质细胞 等人. (2007)
丝裂霉素-C（注意）Sigma-AldrichM4287有毒；请小心操作。
明胶Sigma-AldrichG1890水中0.4%溶液
EVOS xl 数字倒置显微镜高级显微镜组-
表1. 特定试剂与设备
*参见表3
DMEM康宁10-013解离缓冲液稀释剂
胰蛋白酶（1:250）Life Technologies27250-018解离缓冲液：终浓度 0.05% wt/vol
胶原酶 I 型，235 U/ml沃辛顿CLS1 235解离缓冲液：终浓度 0.03% wt/vol
DNA酶 ISigma-AldrichDN25解离缓冲液：终浓度 80 U/ml
牛血清白蛋白ICP 生物ABRE-100g解离缓冲液：终浓度 0.5% wt/vol
表2. 解离缓冲液
StemPro-34 SFMLife Technologies10639-011
StemPro-34 营养添加剂Life Technologies10639-011
额外补充剂**
非必需氨基酸Sigma-AldrichM71451X
MEM 维生素溶液Life Technologies11120-0521X
L-谷氨酰胺美迪特25-0052 mM
牛血清白蛋白ICP 生物ABRE0.50%
抗生素-抗真菌溶液Mediatech30-004-CI1X
D(+)葡萄糖Sigma-AldrichG87696 mg/ml
β-雌二醇Sigma-AldrichE275830 ng/ml
孕酮Calbiochem534160 ng/ml
胎牛血清可变的n/a1%
牛全转铁蛋白Sigma-AldrichT1283100 μg/ml
胰岛素Gemini Bio-Products700-112P25 μg/ml
人 GDNFLife TechnologiesPHC704110 ng/ml
人碱性成纤维细胞生长因子Life TechnologiesPHG002310 ng/ml
小鼠EGFLife TechnologiesPHG031320 ng/ml
腐胺研究用有机物0778P60 μM
亚硒酸钠Sigma-AldrichS526130 nM
丙酮酸Alfa AesarA1387530 μg/ml
DL-乳酸J.T. Baker0196-041 μg/ml
β-巯基–乙醇Life Technologies21985-02350 μM
抗坏血酸Sigma-AldrichA4544100 μM
D-生物素Sigma-AldrichB463910 μg/ml
表3. 干细胞培养基
*注意： 使用培养基前添加以下补充成分。过滤除菌后，置于4℃保存。 °C. 该培养基至少可保持稳定2周。
我们使用过这些试剂的不同生产商、配方和/或批号，均未发现明显不良影响。通常应使用细胞培养级试剂。

参考文献

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