密度梯度多层聚合（dGMP的）:创建多室的，可定制的一种新技术，组织工程支架

Summary

在这里，我们描述了一种独特的战略，创建连续不同的层之间的接口为组织工程的生物相容性，多层矩阵。这种支架可以提供一个理想的可定制的环境来调节细胞行为的各种生物，化学或机械的线索

Abstract

复杂的组织培养矩阵，其中的生物刺激（ 例如，生长因子，抑制剂，或小分子）或矩阵结构的类型和浓度（ 例如，组合物中，浓度，或刚度矩阵）随空间，将启用了广泛的调查关于这些变量如何影响细胞的分化，迁移等现象。创建层状矩阵的主要挑战是维持层接口的结构完整性没有单个组件从每个第¹层中的扩散。目前的方法来实现这一点包括在光^2-3，光刻^4，顺序functionalization5，冷冻干燥^6，微流体^7，或离心分离^8，其中有许多需要精密的 ​​仪器和技术技能。其他依靠连续的附件，这可能会导致个别层^，9层分层 dGMP的克服了这些问题，通过使用惰性密度调节剂，如碘克沙醇，来创建层不同的密度^10。由于密度调节剂可以混合使用任何预聚物或生物活性分子，dGMP的允许每个支架的层来进行定制。简单地改变的密度调节剂的浓度可以防止相邻的层的混合，同时它们保持水。随后的单步聚合产生结构连续多层的脚手架，其中每个层具有不同的化学和机械性能。密度调节剂可以容易地除去与无扰动各个层或它们的组成部分的充分漂洗。因此，这种技术是非常适合用于创建各种尺寸，形状和材料的水凝胶。

一种协议，用于制造一个2D - 聚乙二醇（PEG）的凝胶，其中的交替层包括RGDS-350，概述如下。我们使用PEG because它是具有生物相容性和惰性。 RGDS，细胞粘附肽^11，是用来演示的生物提示的空间限制，和荧光团共轭的（的Alexa Fluor 350），使我们能够在视觉上区别各种层。此过程可适于其他材料（ 例如，胶原蛋白，透明质酸等），并可以扩展到制造三维凝胶与一些修改^10。

Protocol

1。合成荧光标记的丙烯酰-PEG-RGDS

1. 与羧甲基丙烯酰基-PEG-琥珀酰亚胺基酯（APEG供应链管理（SCM），PEG，分子量:3400克/摩尔）和NN二异丙基乙胺（DIPEA），1.2:1:2的摩尔比在二甲亚砜（DMSO）中在氩气下在室温下发生反应的RGDS肽过夜。
2. 确认结合基质辅助激光解吸/电离飞行时间质谱（MALDI-TOF）。加入1μl的样本点的MALDI靶和干APEG-RGDS反应液。准备通用的MALDI基质的四氢呋喃（THF）和涡旋混合1分钟的饱和溶液。 〜1微升该溶液加入到相同的样品点。 APEG-SCM重复步骤进行比较。加载和分析。 APEG-RGDS的分子量应该是大于APEG-SCM（ 图2）。
3. 为共轭的荧光团，加入等摩尔量的的Alexa Fluor 350羧酸（succinimydyl酯），溶于在最小体积的DMSO中，从1.1 APEG-的RGDS反应溶液，并在室温下在氩气下反应过夜。
4. 透析（MW 3500大）与DI-H _{2 O}在4°C 1000:1的体积比为48小时，每天至少两次更换透析液，净化APEG-RGDS-350。
5. 冷冻干燥纯化的APEG-RGDS-350的LABCONCO自由贸易区的Plus或相当于冷冻干燥系统，并储存在-20°C

2。 RGDS-350层的二维模具和制造的二维PEG凝胶的制备与交流

1. 准备疏水性的载玻片上。将干净的玻璃在真空炉中的玻璃皿滑入。加热至80℃，进行30分钟至完全干燥的表面。将菜在通风橱中的幻灯片，并加入250μlSigmacote到每张幻灯片，轻轻摇晃30秒，整个表面涂层。彻底冲洗包被的载玻片，然后用100％甲醇通过在蒸馏水中洗涤两次5分钟，浸泡在执法机关T 10毫升。
2. 剪切硅氧烷间隔件（0.8mm厚），用10毫米活检冲头。
3. 高压灭菌的硅氧烷的衬垫和Sigmacote处理的载玻片。
4. 制订解决方案，为每个单独的微量离心管中的各自的层中混合，聚乙二醇二丙烯酸酯（PEGDA）前体（终浓度为15％）与不同量的碘克沙醇（在水中60％的原液），得到各种不同的最终浓度（ 例如 40％w / v的30％，20％和10％），补充的剩余体积用磷酸盐缓冲盐水（PBS），得到的梯度密度的解决方案。以类似的方式，交替层，混合APEG-RGDS-350（最终浓度为8毫摩尔）与碘克沙醇及PBS，得到各种浓度（ 例如 35％，25％，和15％）。
5. 添加光引发剂（2 - 羟基-4'-（2 - 羟基乙氧基）-2 - 甲基苯丙酮，N-乙烯基吡咯烷酮的333mg/ml库存的）各种层（10μl的每个层溶液每毫升原液）的每个解决方案。光引发剂我S添加，以防止聚合，因为它是分层的凝胶在模具之前，对光线敏感。
6. 此协议的后续步骤将在生物安全柜中进行，以确保无菌。
7. 使用无菌1毫升注射器和0.2微米的过滤器过滤，消毒，每个解决方案。组装模具设定通过夹着隔板间Sigmacore处理载玻片和安全放置，如在图1中示出用夹子固定。
8. 铸造层状的凝胶，通过添加最密集的水溶液（ 如 40％的碘克沙醇PEGDA）第一，其次由密度较小的解决方案（ 例如 APEG-RGDS-350用35％的碘克沙醇）。重复备用层叠来实现，如在图1中所示的几个层的所需的组合物和密度。
9. 使用的是便携式UVR-9000灯照射3分钟365纳米的光模具。允许聚合凝胶固化5分钟。取下夹子，然后轻轻地抬起顶部玻璃幻灯片和模具的分层dGMP的凝胶会保持在幻灯片上。使用无菌抹刀，小心地将凝胶含有无菌PBS或培养基中用于洗涤，在50毫升的试管。
10. 在PBS中的聚合凝胶洗净1,000:1体积比，交换缓冲液每天至少两次以除去的密度调节剂，光引发剂，和未反应的聚合物。另外，PBS可以交换与细胞生长培养基中。存储dGMP的在PBS中的凝胶或生长培养基中，在步骤3中所述的细胞培养实验。
11. 交替层可视化，安排dGMP的凝胶（凝胶可用于细胞培养），沿着样品盘的VersaDoc凝胶单元上的标尺。公开的凝胶在350 nm处，曝光时间将取决于上的荧光基团的浓度。交替黑暗和蓝波段在dGMP的水凝胶中的证明形成独特的化学组合物（ 图3）的离散层。

3。二维细胞培养dGMP的凝胶

1. 对于装有RGDS肽凝胶，使用粘附依赖性细胞，如C2C12细胞。
2. 入井的48孔细胞培养板中，使用在生物安全柜无菌细胞刮刀轻轻插入dGMP的凝胶（存储在PBS中）。
3. 预温生长培养基（Dulbecco改良的Eagle氏培养基或DMEM培养液，用10％体积/体积的胎牛血清和1％体积/体积的100倍的青霉素 - 链霉素溶液）及PBS在37℃下在水浴中设置
4. 60％汇合的板（10毫米）的C2C12细胞3次，用PBS洗净。吸干PBS和收获细胞，通过添加1毫升的0.25％胰蛋白酶-EDTA，在37℃下孵育2分钟。重悬在生长培养基中的细胞，计数细胞。种子dGMP的凝胶含有细胞培养C2C12细胞（20000个细胞/ cm ^2）。在5％CO _2/95％相对湿度在37℃下孵育细胞。 4小时后，轻轻地交换介质，注意不要重新移动轻轻的贴壁细胞。
5. 24小时后，C2C12成肌细胞附着的的RGDS含dGMP的凝胶层的上落射荧光相差显微镜（蔡司Axiovert 200）可以确认。

Results

MALDI-TOF分析证实RGDS肽丙烯酰基-PEG（ 图2）的共轭。凝胶成像显示RGDS-350（蓝色）层交替光聚合后（ 图3A）。正如图3A中所示，2D dGMP的凝胶尺寸可以变化的基础上的硅氧烷模具的直径（10毫米，左; 8毫米，右），并因此很容易定制的用于在多个检测的-在这种情况下，以适应48孔细胞培养板（ 图3B）。落射荧光和相衬显微镜C2C12细胞培养上dGMP的凝胶上显示选择性连接RGDS-350-含PEG层（ 图4），这表明细胞粘附肽（RGDS）的条块。

图1。分子weigHT MALDI-TOF比较APEG-SCM APEG-RGDS的RGDS肽结合后得到的分析。

图2。 dGMP的凝胶制作的示意图。梯度分层后，可以让它们来解决不同的时间段_（T S）毕业的接口，然后通过光聚合。分层dGMP的凝胶可以容易地提取从模具中以便进一步使用。 点击这里查看大图 。

图3:A）光聚合后得到的二维多层凝胶成像使用350 nm和白色光通道的Versa文件凝胶文档单位。的灰度图像显示包含在白色的RGDS的交替层B）插入，dGMP的凝胶成48孔细胞培养皿。

图4。C2C12成肌细胞生长在dGMP的凝胶（比例尺为50μm）的合并相衬和荧光显微镜图像。

图5。碘克沙醇凝胶表面弹性的影响。原子力显微镜测量静态样品的交联PEG基板的使用以前建立的方法与2 NN力扳机^12。 * p <0.05和** P <0.01。

Discussion

dGMP的是一个简单的策略，为编制多层凝胶，不依赖于昂贵的仪器。此协议可以使用其他的生物相容的材料，如胶原蛋白和透明质酸创建支架适于。生物活性的小分子物质，例如细胞的粘附促进RGDS肽，可以被拴到聚合物基体，以防止混合层与层之间的线索。蛋白质可被封装在不同的层中，而不需要进行化学缀合，因为他们，根据矩阵上的网目尺寸，是不容易扩散通过水凝胶^10。在这里，我们用碘克沙醇（Nycoprep），惰性密度改性剂，已被用于活细胞的应用。也可用于其他密度调节剂，如蔗糖和葡萄糖。不同的稳定时间_（T），可以精细调整产生光滑或尖锐的过渡，两层之间的接口（更长的稳定时间为平滑的过渡） ^{10。例如，平滑的过渡之间dGMP的凝胶层，可以用于生成一个连续梯度的研究如趋化的细胞过程的生物提示。}

密度调节剂的效果对凝胶刚度为15％aPEGda凝胶在图5中所示;作为PEGDA和碘克沙醇浓度的函数的刚度和孔隙度的一个更完整的表征是目前正在评估。虽然在这个例子中的PEGDA浓度是比较高的，我们观察到60％以上的弹性模量在30％的碘克沙醇凝胶相比，凝胶没有。凝胶刚度的变化可以进行调整，以通过调制的大单体浓度或交联密度。

我们还采用dGMP的技术来创建三维多层采用聚丙烯酰胺凝胶和PEG前体^10。变的浓度或预聚物的交联度在允许结构变异支架，它可以被用来研究细胞的行为，如在3D的极性生长和迁移。

综上所述，dGMP的是，可应用于制作2D和3D的从生物相容性材料用于范围广泛的生物医学和基础研究应用各种支架的自适应性的技术。

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
试剂或仪器	公司	目录编号
聚乙二醇succinimydyl羧甲基（α-PEG-SCM）	黑背	120-64
polyethelyene丙二醇二丙烯酸酯（PEGDA）	Dajac实验室	9359
精氨酸 - 甘氨酸 - 天门冬氨酸-丝氨酸（RGDS）	美国多肽	49-01-4
N，N -二异丙基乙胺（DIPEA）	西格玛	D125806
二甲亚砜（DMSO）	西格玛	D2438
N，N-二甲基甲酰胺（DMF）的	费舍尔	D119-4
四氢呋喃（THF）	费舍尔	T397
透析盒（3500达）	Thermo Scientific的	66330
的Alexa Fluor 350的羧酸succinimydyl酯	Life Technologies公司	A-10168
Sigmacote	西格玛	SL2
硅胶垫片	格兰杰	1MWA4
活检拳	Acuderm	P1025（10毫米） P850（8毫米）
Dulbecco氏磷酸盐缓冲盐水（DPBS）	Hyclone公司	SH30028
克沙醇（NycoPrep）	费舍尔	NC9388846
2 - 羟基-4'-（2 - 羟基乙氧基）-2 - 甲基苯	西格玛	410896
Dulbecco改良的Eagle培养基（DMEM）	Life Technologies公司	11054
胎牛血清	Life Technologies公司	10082
青霉素，链霉素	Life Technologies公司	15140
C2C12成肌细胞	ATCC	CRL-1772
MALDI	布鲁克	N / A
UVR-9000	Bayco	UVR-9000
VersaDoc	Bio-Rad公司	N / A