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密度梯度多层聚合（DGMP）：一种用于组织工程中构建多区室、可定制支架的新型技术

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DOI：

10.3791/50018

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2013年2月12日

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1Skaggs School of Pharmacy and Pharmaceutical Sciences, University of California, San Diego , 2Biomedical Sciences Program, University of California, San Diego , 3Department of Bioengineering, University of California, San Diego

本文内容

摘要

本文介绍了一种用于构建生物相容性多层基质的独特策略，该基质具有不同层之间的连续界面，适用于组织工程。此类支架可通过多种生物、化学或力学信号，为调控细胞行为提供理想的可定制环境

摘要

复杂的组织培养基质中，生物刺激的类型和浓度（例如生长因子、抑制剂或小分子）或基质结构（例如基质的成分、浓度或刚度）在空间上存在变化，这将能够支持大量关于这些变量如何影响细胞分化、迁移及其他现象的研究。构建分层基质的主要挑战在于，在防止各层中单个组分扩散的同时，维持层间界面的结构完整性1。目前实现这一目标的方法包括光图案化2-3、光刻技术4、逐层功能化5、冷冻干燥6、微流控技术7或离心法8，其中许多方法需要复杂的仪器设备和技术操作能力。另一些方法依赖于各层的依次附着，但可能导致层间脱层9。

DGMP 通过使用惰性密度调节剂（如碘克沙醇）形成不同密度的分层结构，从而克服了上述问题10。由于密度调节剂可与任何预聚物或生物活性分子混合，DGMP 允许对每个支架层进行定制化设计。仅通过调节密度调节剂的浓度，即可在保持各层均为水相的同时防止相邻层之间的混合。随后通过一步聚合反应，形成结构连续的多层支架，其中每一层都具有独特的化学和力学特性。通过充分冲洗即可轻松去除密度调节剂，且不会干扰各层结构及其组分。因此，该技术非常适用于制备各种尺寸、形状和材料的水凝胶。

以下概述了一种制备二维聚乙二醇（PEG）凝胶的方案，其中交替层含有RGDS-350。我们使用PEG是因为其具有生物相容性和惰性。RGDS是一种细胞黏附肽11，用于展示生物信号的空间限制性；而荧光染料（Alexa Fluor 350）的偶联使我们能够直观区分不同层次。该方法可适用于其他材料（例如 胶原蛋白、透明质酸等），并可通过一些修改扩展用于制备三维凝胶10。

方案

1. 荧光标记丙烯酰基-PEG-RGDS的合成

  1. 将RGDS肽与丙烯酰基-聚乙二醇-琥珀酰亚胺羧甲酯（aPEG-SCM，PEG分子量：3400 g/mol）以及N,N-二异丙基乙胺（DIPEA）按1.2:1:2的摩尔比在二甲基亚砜（DMSO）中混合，在氩气保护下室温反应过夜。
  2. 通过基质辅助激光解吸/电离飞行时间质谱（MALDI-TOF）确认偶联结果。取1 μl aPEG-RGDS反应液点样于MALDI靶板样品位并干燥。用四氢呋喃（THF）配制通用MALDI基质的饱和溶液，涡旋1分钟，取约1 μl加至同一样品位。同时对aPEG-SCM进行相同操作作为对照。上机检测分析。aPEG-RGDS的分子量应大于aPEG-SCM（图2）。
  3. 为偶联荧光染料，将等摩尔量的Alexa Fluor 350羧酸（琥珀酰亚胺酯）溶于最小体积的DMSO中，加入步骤1.1所得aPEG-RGDS反应液，在氩气保护下室温反应过夜。
  4. 将aPEG-RGDS-350通过透析（截留分子量3500 Da）在4 °C下对去离子H2O进行纯化，体积比为1,000:1，透析液每天至少更换两次，持续48小时。
  5. 将纯化后的aPEG-RGDS-350在Labconco Freezone Plus或同等冻干系统中冷冻干燥，并于-20 °C保存。

2. 制备二维模具及具有交替RGDS-350层的二维PEG凝胶的构建

  1. 制备疏水性玻片。将洁净的玻片放入玻璃培养皿中，置于真空烘箱内，80 °C加热30分钟，以彻底干燥表面。将盛有玻片的培养皿置于通风橱中，每张玻片上加入250 μl Sigmacote，轻轻摇晃30秒，使溶液均匀覆盖整个表面。用100%甲醇彻底冲洗涂覆后的玻片，随后用蒸馏水洗涤，每次至少使用10 ml，浸泡两次，每次5分钟。
  2. 使用10 mm活检打孔器切割0.8 mm厚的硅胶垫片。
  3. 对硅胶间隔片和经Sigmacote处理的载玻片进行高压灭菌。
  4. 在单独的微量离心管中配制各相应层的溶液，将聚乙二醇二丙烯酸酯（PEGda）前体（终浓度为15% w/v）与不同体积的碘克沙醇（碘克沙醇60%水溶液储备液）混合，以获得不同的终浓度（例如 40%、30%、20% 和 10%），用磷酸盐缓冲液（PBS）补足至终体积，以获得不同密度梯度的溶液。类似地，对于交替层结构，将 aPEG-RGDS-350（终浓度 8 mM）与碘克沙醇和 PBS 混合，得到不同浓度的溶液。例如 35%、25% 和 15%
  5. 向各层溶液中加入光引发剂（2-羟基-4'-(2-羟基乙氧基)-2-甲基苯丙酮，333 mg/ml 储存液溶于N-乙烯基吡咯烷酮中）（每毫升各层溶液中加入10 μl 储存液）。光引发剂应在最后加入，以防止凝胶在模具中分层前发生聚合，因其对光敏感。
  6. 本方案的后续步骤将在生物安全柜中进行，以确保无菌环境。
  7. 使用无菌1 ml注射器和0.2 μm滤器对每种溶液进行过滤除菌。将间隔片夹在两个经Sigmacore处理的玻璃载玻片之间，按图示方式用夹具固定，组装模具装置。 图1.
  8. 通过加入密度最高的溶液来制备分层凝胶例如 PEGda 加入 40% 碘克沙醇）先加入，随后加入密度较低的溶液（例如 aPEG-RGDS-350 与 35% 碘克沙醇）。重复交替叠加，以获得如图所示的多个具有目标组分和密度的层 图1.
  9. 使用便携式UVR-9000灯以365 nm光照照射模具3分钟。让聚合后的凝胶固化5分钟。取下夹具，然后轻轻抬起上层玻璃载片和模具；分层的DGMP凝胶将保留在载片上。用无菌刮勺小心地将凝胶转移至含有无菌PBS或培养基的50 ml离心管中进行洗涤。
  10. 用 PBS 以 1,000:1 的体积比洗涤聚合后的凝胶，每天至少更换缓冲液两次，以去除密度调节剂、光引发剂和未反应的聚合物。或者，可用细胞培养基替代 PBS 进行更换。将 DGMP 凝胶保存在 PBS 或培养基中，用于第 3 步所述的细胞培养实验。
  11. 为观察交替层结构，将DGMP凝胶（这些凝胶不可用于细胞培养）沿样品托盘中的标尺排列于VersaDoc凝胶成像系统的样品托盘上。在350 nm波长下曝光凝胶，曝光时间根据荧光染料浓度而定。DGMP水凝胶中交替出现的深色与蓝色条带表明已形成具有不同化学组成的离散层。图3).

3. 在 DGMP 凝胶上进行二维细胞培养

  1. 对于含有RGDS肽的凝胶，应使用依赖黏附的细胞，例如C2C12成肌细胞。
  2. 在生物安全柜中，使用无菌细胞刮棒小心地将保存在PBS中的DGMP凝胶插入48孔细胞培养板的孔中。
  3. 将培养基（含10% v/v胎牛血清和1% v/v 100倍青霉素-链霉素溶液的Dulbecco改良Eagle培养基，即DMEM）和PBS置于37 °C水浴中预热。
  4. 用PBS清洗一片60%融合度的C2C12细胞培养皿（直径10 mm）三次，吸除PBS后，加入1 ml 0.25%胰蛋白酶-EDTA溶液，在37 °C孵育2分钟以收获细胞。将细胞重悬于生长培养基中并计数，随后在含有DGMP凝胶的细胞培养孔中接种C2C12成肌细胞（20,000个细胞/cm2）。将细胞置于37 °C、5%CO2/95%相对湿度条件下培养。4小时后轻柔更换培养基，注意避免移除尚未牢固贴壁的细胞。
  5. 24小时后，可通过倒置荧光显微镜和相差显微镜（Zeiss Axiovert 200）观察确认C2C12成肌细胞在含RGDS的DGMP凝胶层上的贴附情况。

结果

基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱（MALDI-TOF）分析证实了RGDS肽与丙烯酰基-PEG的成功偶联（图2）。凝胶成像显示，在光聚合后形成了交替分布的RGDS-350（蓝色）层（图3A）。如图3A所示，二维数字光加工微图案（DGMP）凝胶的尺寸可根据硅胶模具的直径进行调节（左侧为10 mm，右侧为8 mm），因此可灵活定制以适用于多种检测——本例中可适配48孔细胞培养板（图3B）。在DGMP凝胶上培养的C2C12成肌细胞经落射荧光与相差显微镜观察，显示细胞选择性地附着于含有RGDS-350的PEG层区域（图4），表明细胞黏附肽（RGDS）实现了空间区室化分布。

基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱图，aPEG-SCM 与 aPEG-RGDS 的强度对比分子量。
图 1. 通过基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱（MALDI-TOF）分析分子量，比较RGDS肽偶联后获得的 aPEG-SCM 与 aPEG-RGDS。

溶剂密度梯度示意图、二维多层组织基质、碘克沙醇、光子装置。
图2. 密度梯度微图案（DGMP）凝胶制备的示意图。 在梯度层叠加后，可静置不同时间（ts）以形成渐变界面，随后进行光聚合。分层的DGMP凝胶可轻松从模具中取出，用于后续实验。 点击此处查看高清大图。

微流控图案分析示意图；用于细胞培养测试的多孔板实验。
图 3. A) 光聚合后通过 VersaDoc 凝胶成像系统在 350 nm 和白光通道下获得的 2D 多层凝胶图像。灰度图像显示含有 RGDS 的层呈白色，交替分布。 B) 将 DGMP 凝胶插入 48 孔细胞培养板中。

成纤维细胞的显微镜图像；在50 μm尺度下进行细胞形态学研究；生物医学研究。
图4. 在DGMP凝胶上培养的C2C12成肌细胞的相衬与落射荧光合并图像（比例尺：50 μm）。

弹性模量与碘克沙醇浓度关系图；星号表示统计学显著性。
图 5. 碘克沙醇对凝胶表面弹性的影响。 采用已有方法，通过原子力显微镜测量交联 PEG 基质的静态样品，触发力为 2 nN12。*p< 0.05，**p<0.01。

讨论

DGMP 是一种制备多层凝胶的简单策略，无需依赖昂贵的仪器。该方案可适用于其他生物相容性材料（如胶原蛋白和透明质酸）来构建支架。生物活性小分子（例如促进细胞黏附的 RGDS 肽）可共价连接至聚合物基质中，以防止不同层之间的信号分子混合。蛋白质可在不同层中被包埋，且无需化学偶联，因为根据基质网孔尺寸的不同，蛋白质较不易在水凝胶中扩散10。本文中我们使用了碘克沙醇（Nycoprep），这是一种惰性的密度调节剂，此前已被用于活细胞相关应用。其他密度调节剂（如蔗糖和右旋糖）也可使用。通过调节沉降时间（ts），可精确调控两层之间的界面，以按需形成平滑或陡峭的过渡（较长的沉降时间产生更平滑的过渡）10。例如，DGMP 凝胶层之间的平滑过渡可用于构建生物信号的连续梯度，以研究细胞趋化性等细胞过程。

密度调节剂对凝胶刚度的影响如图5所示，该数据基于15% aPEGda凝胶；目前我们正在进一步评估凝胶刚度和孔隙率随PEGda和碘克沙醇浓度变化的更完整表征。尽管本示例中的PEGda浓度相对较高，但我们观察到，与不含碘克沙醇的凝胶相比，含30%碘克沙醇的凝胶其弹性模量高出60%。通过调节大分子单体浓度或交联密度，可对凝胶刚度的变化进行调控。

我们还应用了 DGMP 技术，利用聚丙烯酰胺和聚乙二醇前体来制备三维多层凝胶10。通过改变预聚物的浓度或交联程度，可实现支架结构的多样化，从而用于研究细胞在三维环境中的极性生长和迁移等行为。

总之，数字光处理微立体光刻（DGMP）是一种可灵活应用的技术，可用于多种生物相容性材料，制备适用于广泛生物医学及基础研究领域的二维和三维支架。

披露

作者无任何利益冲突需要披露。

致谢

作者感谢美国国立卫生研究院（NIH）院长新创新者奖（1DP2 OD006499-01 资助 A.A.，1DP2 OD006460-01 资助 A.J.E.）以及沙特阿拉伯科学技术城（King Abdulaziz City for Science and Technology）对加州大学圣地亚哥分校纳米医学卓越中心的支持。我们感谢杰西卡·摩尔女士（Ms. Jessica Moore）对本文稿提出的宝贵意见。

材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
聚乙二醇琥珀酰亚胺羧甲基（a-PEG-SCM）Laysan120-64
聚乙二醇二丙烯酸酯（PEGda）Dajac Labs9359
精氨酸-甘氨酸-天冬氨酸-丝氨酸（RGDS）American Peptide49-01-4
N,N-二异丙基乙胺（DIPEA）SigmaD125806
二甲基亚砜（DMSO）SigmaD2438
N,N-二甲基甲酰胺（DMF）FisherD119-4
四氢呋喃（THF）FisherT397
透析夹（3500 Da）Thermo Scientific66330
Alexa Fluor 350 羧酸琥珀酰亚胺酯Life TechnologiesA-10168
SigmacoteSigmaSL2
硅胶垫片Grainger1MWA4
活检打孔器AcudermP1025 (10 mm)
P850 (8 mm)
杜氏磷酸盐缓冲液（DPBS）HycloneSH30028
碘克沙醇（NycoPrep）FisherNC9388846
2-羟基-4'-(2-羟基乙氧基)-2-甲基苯丙酮Sigma410896
杜氏改良伊格尔培养基（DMEM）Life Technologies11054
胎牛血清Life Technologies10082
青霉素-链霉素Life Technologies15140
C2C12 成肌细胞ATCCCRL-1772
MALDIBrukerN/A
UVR-9000BaycoUVR-9000
VersaDocBio-RadN/A

参考文献

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