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LeafJ：一款用于半自动叶形测量的 ImageJ 插件

DOI：

10.3791/50028

⸱

2013年1月21日

 ,  ,  , 
1Department of Plant Biology, University of California Davis

* These authors contributed equally

本文内容

摘要

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

展示用于高通量叶片测量的关键方法。这些方法可用于加速对大量植物突变体的研究，或基于叶片表型对植物进行筛选时的表型分析。

摘要

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

高通量表型分析（表型组学）是连接基因与其功能的有力工具（参见综述1及近期实例2-4）。叶片是主要的光合作用器官，其大小和形状在植物个体发育和环境变化过程中均存在差异。因此，叶片形态学研究需要对大量叶片的多个参数进行测量，而半自动化的表型组学工具5,6最适合完成此类任务。冠层遮荫是一种重要的环境信号，会影响植物构型和生活史；植物对此类信号的一系列响应统称为避荫综合征（shade avoidance syndrome, SAS）7。在SAS响应中，遮荫诱导的叶柄伸长以及叶片面积的变化尤为适合作为评估指标8。迄今为止，已有的叶片形态分析程序（例如 SHAPE9、LAMINA10、LeafAnalyzer11、LEAFPROCESSOR12）能够测量叶片轮廓并分类叶片形状，但无法输出叶柄长度。由于缺乏大规模叶柄测量系统，制约了表型组学方法在SAS研究中的应用。本文中，我们介绍一种新开发的ImageJ插件——LeafJ，可快速测量模式植物Arabidopsis thaliana的叶柄长度及叶片参数。对于少数需要手动校正叶柄与叶片边界的情况，我们使用了触摸屏平板设备。此外，叶细胞形状和叶细胞数量是决定叶片大小的重要因素13。除LeafJ外，我们还提供了一套利用触摸屏平板测量细胞形状、面积和大小的实验方案。我们的叶片性状测量系统不仅适用于避荫反应研究，还将加速多种突变体和筛选植株的叶片表型分析。

方案

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1. 植物材料

请注意，本植物生长方案旨在检测避荫反应。您可以在您偏好的条件下培养植物。

  1. 将拟南芥（Arabidopsis thaliana）种子撒在已吸水的滤纸上，放入9 cm培养皿中，于4 °C黑暗条件下放置（春化处理）四天。
  2. 将这些培养皿转移至模拟阳光条件下培养：光合有效辐射（PAR）为80–100 μE，并补充远红光，使红光/远红光（R:FR）比值达到1.86。采用长日照条件（16小时光照/8小时黑暗）和恒定22 °C温度，培养三天以促进种子萌发。
  3. 将已萌发的幼苗移栽至土壤中，并继续在阳光条件下培养植株。对于大规模实验，建议使用 Microsoft Word 2004（或更高版本）中的“数据合并管理器”制作标签，为每株植物准备小型标签以便标识。
  4. 移栽至土壤后第11天，将一半植株转移至遮荫条件：除补充远红光使R:FR比值降至0.52外，其余条件与阳光条件相同。
  5. 再经过12天培养后，植株即可进行叶片成像。此时较老的叶片已完全成熟，而较年轻的叶片仍处于扩展阶段，从而可捕捉到叶片发育过程的一个快照。您可根据实验需求选择不同的发育时期。

2. 拍摄分离的叶片图像

  1. 准备标有植物基因型和生长条件的透明片，每张透明片上包含五个矩形区域，每个区域对应一株植物的叶片。可使用 Microsoft Excel 打印带有标签的统一网格。
  2. 分离 26 天龄植物的叶片。
  3. 使用平板扫描仪以 600 dpi 的分辨率扫描叶片。注意：一株植物的叶片应垂直放置在透明片夹层中的黑色窗口区域内。避免叶片接触黑色窗框或相互重叠，否则会在后续步骤中产生误差。

3. 使用 LeafJ 进行叶片图像分析

  1. 从 http://malooflab.openwetware.org/Resources.html#Software_Tools 或 http://bitbucket.org/jnmaloof/leafj 下载 ImageJ。将 LeafJ.jar 文件拖入 ImageJ 的插件文件夹中。
  2. 在 ImageJ 1.45s 或更高版本中打开图像文件14。
  3. 通过“图像 > 颜色 > 拆分通道”将图像拆分为三个颜色通道（红、绿、蓝），并对蓝色通道中的图像应用阈值。
  4. 使用矩形工具选择来自同一植株的所有叶片（图 1A）。
  5. 从插件菜单中选择“LeafJ”。
  6. 在弹出的对话框中选择该植株的注释信息。可通过点击“编辑这些选项”来修改此处显示的默认值。
  7. 运行 LeafJ 插件后，在点击“确定”按钮之前，可在感兴趣区域（ROI）管理器窗口中编辑已追踪的线条（如需要；图 1B）。此步骤使用触摸屏平板设备（例如 iPad）较为方便。可通过 Air Display 软件将 iPad 连接至计算机作为外接显示器使用。
  8. 将测量结果及相关信息（文件名、开花时间、解剖者、测量者等）导出至 Microsoft Excel 或类似软件。

4. 在 ImageJ 中进行叶细胞图像分析

  1. 扫描后（步骤2），按照参考文献15所述方法固定已解剖的叶片。FAA固定的叶片可在4 °C下保存至少6个月。
  2. 将FAA固定液更换为水合氯醛溶液以透明叶片，并在显微观察前孵育1~2小时15。
  3. 将叶片置于显微镜载玻片上，使表皮毛朝上。使用复式显微镜的40倍物镜，对每片叶片主脉两侧中央区域的叶肉层进行成像，避免拍摄靠近表皮毛或叶脉的细胞。
  4. 借助触摸屏平板和手写笔（如步骤3所述），使用ImageJ的ROI管理器工具勾勒叶细胞轮廓。细胞图像分析采用ImageJ内置功能，无需使用LeafJ插件。

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结果

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1. 显示叶柄与叶片边界估计值及其测量窗口的叶片图像

LeafJ 最有用的功能之一是能够自动检测叶片与叶柄的边界（图1）。LeafJ 的算法工作流程如下：利用 ImageJ 内置的 ParticleAnalyzer 功能，识别用户选定区域内的叶片并确定其方向。对于每一片叶子，沿其整个主轴方向测定叶片的宽度。然后通过滑动窗口法计算主轴上每一位置处的宽度变化（以目标位置远端七个位置的平均宽度减去近端七个位置的平均宽度）。叶柄/叶片边界被定义为从叶基起始后，宽度变化超过所有计算出的宽度差值的90%的第一个位置。LeafJ 还进行了额外的验证以提高该判断的可靠性：具体包括 1）该位置的宽度必须超过整条长度中最小5%宽度值（以避免在叶柄基部出现异常判断）；2）目标位置近端区域的宽度无显著变化；3）目标位置远端20%处的叶片宽度至少比该位置宽150%（若目标位置确为边界，则其远端20%应已进入叶片部分，因此宽度明显更大）。

一旦 LeafJ 确定了叶柄/叶片边界，便使用 ImageJ 内置的类和方法来测定叶片的...

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讨论

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我们的“LeafJ”插件能够半自动地测量叶柄长度，使测量通量比手动测量提高近6倍。叶柄长度是避荫反应（SAS）的一个重要指标，也是其他多种现象的标志性参数，例如耐淹性和负向性生长17。因此，该插件可能对广泛的植物研究领域科研人员具有实用价值。

我们的插件基于一个成熟的 Java 开源软件 ImageJ 实现，因此可轻松进行跨平台安装。由于 ImageJ 已拥有大量使用 Java 和 ImageJ 宏语言编写的插件库，LeafJ 插件也具备易于修改的优势（http://imagejdocu.tudor.lu/doku.php?id=tutorial:start）。目前我们仅测试了拟南芥（Arabidopsis）的叶片，但经过适当修改后，本插件中用于叶柄与叶片边界检测的算法也可适用于其他双子叶植物的叶片。

在测试 Leaf...

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披露

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未声明任何利益冲突。

致谢

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LeafJ 由 JNM 在 Gladstone 研究所 Katherine Pollard 博士实验室访学期间编写。

本工作获得了美国国家科学基金会的资助（资助号 IOS-0923752）。

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材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
远红光LED灯 Orbitec定制
透明度测量仪IKONHSCA/5
扫描仪 EpsonEpson Perfection V700 PHOTO
Image J NIHhttp://rsbweb.nih.gov/ij/
LeafJ 定制http://www.openwetware.org/wiki/Maloof_Lab
Air DisplayAvatron Software Inc.http://avatron.com/
iPad2 Apple Inc.http://www.apple.com/

参考文献

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Furbank, R. T., Tester, M. Phenomics--technologies to relieve the phenotyping bottleneck. Trends Plant Sci. 16, 635-644 (2011).
  2. Berger, B., Parent, B., Tester, M. High-throughput shoot imaging to study drought responses. J. Exp. Bot. 61, 3519-3528 (2010).
  3. Borevitz, J. O. Natural genetic variation for growth and development revealed by high-throughput phenotyping in Arabidopsis thaliana. G3 (Bethesda). 2, 29-34 (2012).
  4. Albrecht, D. R., Bargmann, C. I. High-content behavioral analysis of Caenorhabditis elegans in precise spatiotemporal chemical environments. Nat. Methods. 8, 599-605 (2011).
  5. Chitwood, D. H., et al. Native environment modulates leaf size and response to simulated foliar shade across wild tomato species. PLoS ONE. 7, e29570(2012).
  6. Chitwood, D. H., et al. The developmental trajectory of leaflet morphology in wild tomato species. Plant Physiol. 158, 1230-1240 (2012).
  7. Casal, J. J. Shade Avoidance. The Arabidopsis Book. , e0157(2012).
  8. Smith, H. Photomorphogenesis in Plants. Kendrick, R. E., Kronenberg, G. H. M. , Kluwer Academic Publishers. 377-416 (1994).
  9. Iwata, H., Ukai, Y. SHAPE: a computer program package for quantitative evaluation of biological shapes based on elliptic Fourier descriptors. J. Hered. 93, 384-385 (2002).
  10. Bylesjo, M., et al. LAMINA: a tool for rapid quantification of leaf size and shape parameters. BMC Plant Biol. 8, 82(2008).
  11. Weight, C., Parnham, D., Waites, R. LeafAnalyser: a computational method for rapid and large-scale analyses of leaf shape variation. Plant J. 53, 578-586 (2008).
  12. Backhaus, A., et al. LEAFPROCESSOR: a new leaf phenotyping tool using contour bending energy and shape cluster analysis. New Phytol. 187, 251-261 (2010).
  13. Tsukaya, H. Mechanisms of Leaf-shape determination. Annual Review of Plant Biology. 57, 477-496 (2006).
  14. Abramoff, M. D., Magalhaes, P. J., Ram, S. J. Image Processing with ImageJ. Biophotonics International. 11, 36-42 (2004).
  15. Horiguchi, G., Fujikura, U., Ferjani, A., Ishikawa, N., Tsukaya, H. Large-scale histological analysis of leaf mutants using two simple leaf observation methods: identification of novel genetic pathways governing the size and shape of leaves. Plant. J. 48, 638-644 (2006).
  16. Horiguchi, G., Ferjani, A., Fujikura, U., Tsukaya, H. Coordination of cell proliferation and cell expansion in the control of leaf size in Arabidopsis thaliana. J. Plant. Res. 119, 37-42 (2006).
  17. Pierik, R., de Wit, M., Voesenek, L. A. C. J. Growth-mediated stress escape: convergence of signal transduction pathways activated upon exposure to two different environmental stresses. New. Phytol. 189, 122-134 (2011).

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