本文介绍了一种用于研究急性分离脑片神经元中配体门控离子通道功能的有效方法。该方法结合标准膜片钳技术记录神经元，同时使用充满药物的微电极对神经元进行局部药物施加。
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摘要
摘要
吸烟会导致多种健康问题，包括癌症、心脏病、肺气肿和中风。尼古丁成瘾是一种常见的神经精神障碍，源于尼古丁作用于中枢神经系统中广泛存在的烟碱型乙酰胆碱受体（nAChRs）所产生的生物物理和细胞效应。明确与尼古丁成瘾相关脑区中存在的各种nAChR亚型，是当前研究的重要优先方向。
采用膜片钳技术（如全细胞膜片钳或双电极电压钳记录）的实验对于目标烟碱型乙酰胆碱受体（nAChR）的药理学表征具有重要意义。表达nAChR的细胞（例如哺乳动物组织培养细胞或Xenopus laevis卵母细胞）在物理上相互分离，因此可方便地利用现代药理学工具进行研究。这些技术已取得显著进展，尤其是在靶标受体已知且易于实现异源表达的情况下。然而，通常有必要在nAChR的天然环境中对其进行研究，即在从实验小鼠或大鼠急性分离的脑片中的神经元内进行研究。例如，表达“高敏性”nAChR亚基的小鼠模型，如α4 L9′A小鼠1和α6 L9′S小鼠2，可根据特定nAChR亚基的功能性表达明确识别相关神经元。尽管熟练的电生理学家常规可在脑片神经元上进行全细胞膜片钳记录，但在脑片中对记录的细胞局部施加乙酰胆碱或尼古丁等药物仍具挑战性。将药物扩散至灌流液（浴式给药）的方式难以快速撤除，而U型管系统则不易适用于脑片实验。
本文介绍了一种在成年小鼠脑片记录神经元时快速施加nAChR激活药物的方法。通过对脑片中的神经元进行标准的全细胞记录，同时将另一根充满目标药物的微电极移至记录细胞附近。向含药微电极中注入加压空气或惰性氮气，可使少量药物溶液从电极尖端喷出并作用于记录的细胞。利用该方法，可实现毫秒级精度解析nAChR介导的电流。药物施加时间可灵活调节，且含药微电极可回撤并更换为新的电极，从而可在单个神经元上构建浓度-反应曲线。尽管本方法是在nAChR神经生物学背景下描述的，但该技术也适用于研究脑片神经元中多种类型的配体门控离子通道或受体。
方案
1. 脑片制备与电生理实验用溶液的配制
- 用于制备脑切片的溶液此前已有描述3, 4。配制基于N-甲基-D-葡萄糖胺（NMDG）的切片与恢复溶液，其成分为（单位为 mM）：93 N-甲基-D-葡萄糖胺、2.5 KCl、1.2 NaH2PO4、30 NaHCO3、20 HEPES、25 葡萄糖、5 Na+ 抗坏血酸、2 硫脲、3 Na+ 丙酮酸、10 MgSO4•7H2O、0.5 CaCl2•2H2O。用 NMDG 调节渗透压至 300–310 mOsm。用 10 N HCl 将 pH 值调节至 7.3–7.4。
- 将 MgSO4•7H2O 和 CaCl2•2H2O 溶解于 Millipore 水中，分别配制成 2 M 的储备液。
- 按所列顺序称取其余组分，在搅拌条件下加入已部分装有 Millipore 水的容量瓶中以助溶解。所有组分加入后，用 Millipore 水定容至刻度。
- 测定 pH 值，并用 10 N HCl 调节。
- 测定渗透压，必要时用 NMDG 调节。
- 配制 HEPES 保存型人工脑脊液（aCSF），其成分为（单位为 mM）：92 NaCl、2.5 KCl、1.2 NaH2PO4、30 NaHCO3、20 HEPES、25 葡萄糖、5 Na+ 抗坏血酸、2 硫脲、3 Na+ 丙酮酸、2 MgSO4•7H2O、2 CaCl2•2H2O。用蔗糖调节渗透压至 300–310 mOsm。用 1 N HCl 或 NaOH 将 pH 值调节至 7.3–7.4。
- 按所列顺序称取各组分，在搅拌条件下加入已部分装有 Millipore 水的容量瓶中以助溶解。所有组分加入后，用 Millipore 水定容至刻度。
- 测定 pH 值，必要时用 NaOH 或 HCl 调节。
- 测定渗透压，必要时用蔗糖调节。
- 配制标准 aCSF 记录溶液，其成分为（单位为 mM）：124 NaCl、2.5 KCl、1.2 NaH2PO4、24 NaHCO3、12.5 葡萄糖、2 MgSO4•7H2O、2 CaCl2•2H2O。用蔗糖调节渗透压至 300–310 mOsm。用 1 N HCl 或 NaOH 将 pH 值调节至 7.3–7.4。
2. 急性脑切片的制备
- 脑切片的切割与恢复操作如前所述3, 4。将两个盛有NMDG恢复液的玻璃培养皿用95%氧气/5% CO2混合气体（碳合气）充气，其中一个置于冰上，另一个置于33 °C环境中。
- 在室温下，用碳合气对盛有HEPES保存aCSF的玻璃培养皿进行充气。
- 使用Na+戊巴比妥（200 mg/kg，腹腔注射）麻醉成年小鼠（年龄为2至12个月）。当动物对脚趾夹捏无反应时，开始后续操作。
- 如有需要，剪取尾部组织样本以备后续基因型鉴定。
- 打开胸腔，暴露心脏，并夹闭降主动脉。撕裂右心房。
- 经心脏灌注5–10 ml的0–4 °C NMDG恢复液。
- 处死动物，取出脑组织并置于4 °C NMDG恢复液中1分钟。
- 在预冷的金属板上，将脑组织按所需方向（冠状面、旁矢状面、水平面等）修整，以包含目标区域。
- 用速干胶将脑组织块固定在振动切片机（DSK-Zero 1；Dosaka）干燥的切片台上，将脑组织块浸入4 °C NMDG恢复液中，并持续用碳合气充气。
- 切割目标脑区的切片。切片厚度为200–400 μm，具体取决于目标脑区、动物年龄及实验需求。
- 切片完成后，立即将所需切片放入经碳合气饱和的33 °C NMDG恢复液中，精确孵育12分钟，随后转移至经碳合气饱和的室温HEPES保存液中，初始孵育60分钟。此60分钟孵育结束后，切片即可用于记录。在当天使用前，切片均保存在HEPES保存液中。
3. 脑片中神经元的膜片钳记录
- 使用可编程的Flaming-Brown拉制仪（Sutter P-97或同等垂直拉制仪）拉制标准的膜片钳玻璃微电极。适用于形成吉欧姆封接的微电极通常具有4–6 MΩ的电阻。
- 将一片脑片转移至直立显微镜（Nikon FN-1）载物台上的记录室（RC-27L；Warner Instruments）中，并以持续灌流（1.5–2.0 ml/min）的方式用含碳合气（carbogenated）的标准记录用人工脑脊液（aCSF），在32 °C下加热并维持脑片活性。也可选择在室温下维持脑片。
- 使用10倍空气物镜（Nikon Plan Fluor 10X；NA 0.3；WD：16 mm）定位并居中目标脑区。
- 通过连接近红外差分干涉对比（IR-DIC）光学系统和高速近红外电荷耦合器件（CCD）视频摄像机（Hamamatsu C-7500）的40倍近红外（IR）水浸物镜（Nikon APO 40XW；NA：0.80；WD：3.5 mm）观察单个神经元。在IR-DIC观察下，健康的神经元表现出光滑、浅灰色的细胞膜。
- 用合适的细胞内记录液填充微电极。在大多数应用中，我们使用以下溶液（单位为 mM）：135 钾葡萄糖酸盐、5 EGTA、0.5 CaCl2、2 MgCl2、10 HEPES、2 Mg-ATP 和 0.1 GTP（用Tris碱调节pH至7.25，用蔗糖调节渗透压至290 mOsm）。对已观察到的神经元建立全细胞记录模式。
4. 脑片中神经元的药物局部施加
- 按照上述方法拉制标准的膜片钳玻璃微电极。当需要在同一细胞上使用多种药物溶液时，使用如Sutter P-97这类可从同一根玻璃毛细管拉出两个相同“姐妹”尖端的电极拉制仪具有优势。若用上述细胞内液填充，电极尖端电阻约为5 MΩ时为最佳。
- 用溶解在通有碳合气（carbogenated）的标准记录aCSF中的药物溶液从后端填充微电极。将电极尖端朝下，轻弹装有药物的微电极，以去除溶液柱中可能存在的气泡。
- 将装有药物的微电极安装在连接管路的压力喷射系统（如Picospritzer III，General Valve Co.）配套的电极架上。电极架应固定于显微操作器上，其分辨率应与常规膜片钳记录所用操作器相当（例如Sutter MP-285）。此外，该操作器应支持对脑片进行斜向进出移动。手动向微电极施加3至4次压力脉冲，以在液柱后方建立足够的压力。
- 通过显微操作器控制，将药物电极在红外微分干涉差（IR-DIC）光学系统下缓慢插入脑片。理想情况下，应先在视野中识别并居中一个待记录的神经元，随后在将记录电极插入脑片之前，先将药物电极定位至该细胞附近。若在形成吉欧姆封接（gigaohm seal）后再移动药物电极，其操作可能引起记录细胞周围组织位移，从而干扰记录。
- 利用红外视频系统，将药物微电极置于脑片组织表面。执行一次压力喷射，并观察：1）电极尖端周围是否有因喷射引起的碎屑移动；2）电极尖端是否存在堵塞或阻塞迹象。若发现尖端堵塞，应撤回电极并更换新的电极。
- 从脑片上方以斜向方式接近记录细胞，使药物填充电极尖端最终位置满足以下两点：1）与记录细胞及记录电极尖端处于同一焦平面或略低于该平面；2）距离记录细胞10至40 μm。若药物电极尖端位于记录细胞上方，压力喷射产生的力可能破坏吉欧姆封接。
- 在电压钳或电流钳模式下记录目标细胞反应。我们常规在电压钳模式下记录乙酰胆碱和/或尼古丁诱导的细胞电流。尽管使用Picospritzer III时可手动触发压力喷射，但为了获得更可重复的结果，建议通过数据采集系统（Axon Digidata 1440和pClamp 10.3）发送数字TTL脉冲来自动触发压力喷射。
5. 使用压电驱动器控制载药微移液管
- 如果可能，将装有药物的移液管固定器安装到单维压电位移器上（例如 压电驱动器（Piezojena PA-100 或 Burleigh PZM-150），能够接收来自采集系统的模拟电压输入信号，并安装至高精度显微操作器（Sutter MP-285）上。使用压电平移装置的优势在于，可更精确地控制药物填充移液管进出脑片的运动，包括进入和退出的时间与速度，从而在不同实验间实现更一致的操作。在研究烟碱型乙酰胆碱受体（nAChRs）时，若使用压电平移装置仅在施加压力喷射的瞬间将移液管移近细胞，可最大限度减少因移液管中尼古丁泄漏所导致的受体脱敏效应。
- 使用压电电压控制放大器上的手动电位计，将电压调节至最大值。
- 使用显微操作仪，将装有药物的移液管定位至脑片中，使其能够将内容物释放到记录细胞上；然后通过手动将压电电压控制放大器的电压降至零，回撤移液管。
- 通过记录采集系统的模拟输出信号，在压力喷射TTL脉冲发生前300毫秒开始，用250毫秒的时间将充满药物的移液管移入脑片中。在TTL脉冲结束50毫秒后，开始用250毫秒的时间将移液管撤回。
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结果
在我们的实验中，通常记录腹侧被盖区（VTA）和黑质致密部（SNc）中多巴胺（DA）能神经元的电活动。在电压钳模式下，对这些细胞施加乙酰胆碱或尼古丁，通常会引发快速的内向阳离子电流，电流在100–200毫秒内达到峰值（图1A-B）。电流的衰减主要取决于药物从作用位点的扩散情况，以及脑片中是否存在能够将药物代谢为无活性形式的酶。例如，乙酰胆碱可被富含多巴胺神经元脑区细胞表面的乙酰胆碱酯酶迅速水解5，从而导致诱发电流快速衰减（图1A）。相比之下，尼古丁不会被水解，因此尼古丁诱发的电流衰减速度远慢于乙酰胆碱诱发的电流（图1B），这使其能够强烈激活并导致烟碱型乙酰胆碱受体（nAChRs）脱敏6。
压力喷射系统允许操作者调节压力脉冲的时间。这一特性在研究脑切片中神经元表面的烟碱型乙酰胆碱受体（nAChRs）时非常有用，因为它使研究者能够确定药物脉冲是否已引发最大诱发电流。例如，图2中的两条记录曲线显示，250毫秒的药...
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讨论
本文介绍的方法在脑片制备中研究配体门控离子通道功能方面具有广泛的应用价值。然而，使用该方法时，有许多因素会显著影响实验数据的质量和可重复性。例如，诱发电流对充满药物的移液管尖端直径非常敏感。尖端过小会导致药物溶液难以推出，而尖端过大、电阻过低则更容易破坏记录细胞与记录电极之间的吉欧姆密封。该方法的另一个局限性在于，距离记录细胞10 μm范围内的其他细胞可能暴露于药物移液管释放的药物中，这可能会增加这些细胞的活性，进而可能影响记录细胞的活动。
在使用同一移液管对细胞多次施加药物时，每次施加都必须将移液管准确放回脑片中的同一位置。即使微小的偏差（例如 1-2 μm）的微小位置变化就可能导致观测到的峰值反应出现显著差异。使用可编程的压电驱动移液器（如上所述）或机器人显微操作器有助于精确定位给药移液管。另一个关键因素是记录细胞在脑片中的深度。位于脑片表面的细胞周围药物容易较快扩散，而位于脑片深层的细胞在给药时药物可能被“困”在组织内部。这一因素在应用尼古丁时尤为重要，因为当暴露时间超过100-200毫秒时，尼古丁会迅速导致nAChRs脱敏。同样，施加到药物填充移液管中的压...
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致谢
本工作由美国国立卫生研究院（NIH）资助项目 DA030396 支持。感谢 Drenan 实验室成员对本文手稿提供的有益讨论和批评建议。特别感谢 Mi Ran Kim 在技术方面的协助，以及 Jonathan Thomas Ting 在成年小鼠脑切片方面的建议。
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| N-甲基-D-葡糖胺 | Sigma | M2004 | |
| KCl | Sigma | P3911 | |
| NaH2PO4 | Sigma | S9638 | |
| NaHCO₃3 | Sigma | S6014 | |
| HEPES | Sigma | H3375 | |
| 葡萄糖 | Sigma | G5767 | |
| Na+ 抗坏血酸 | Sigma | A4034 | |
| 硫脲 | Sigma | T8656 | |
| Na+ 丙酮酸 | Sigma | P2256 | |
| MgSO₄4∙7H2O | Sigma | 230391 | |
| CaCl2∙2H20 | Sigma | 223506 | |
| NaCl | Sigma | S9625 | |
| Na+ 戊巴比妥钠 | Vortech Pharmaceuticals | 76351315 | |
| 葡萄糖酸钾 | Sigma | G4500 | |
| EGTA | Sigma | E3889 | |
| Mg-ATP | Sigma | A9187 | |
| GTP | Sigma | G8877 | |
| DSK-Zero 1 振动切片机 | Ted Pella, Inc. | ||
| P-97 Flaming/Brown 微量移液器拉制仪 | Sutter | ||
| RC-27 记录室 | 沃纳 | ||
| TC-344B 灌流加热控制器 | 沃纳 | 640101 | |
| SH-27B 溶液加热器 | 沃纳 | 640102 | |
| 尼康 FN-1 | 尼康 | ||
| C-7500 CCD 视频相机 | 滨松 | ||
| Picospritzer III | 通用阀门公司 | ||
| MP-285 微操作器 | Sutter | ||
| PA-100 压电控制器–电翻译器 | piezosystem jena, Inc. | ||
| 12V40 压电放大器 | piezosystem jena, Inc. | ||
| Axopatch 200B | Molecular Devices Corp. | ||
| Digidata 1440A | Molecular Devices Corp. |
参考文献
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