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Summary

我们描述了超分辨率成像方法的细菌FtsZ的环探测的组织结构，细胞分裂的重要设备。这种方法是基于光活化的定位显微镜（PALM）图像的定量分析，并可以应用到其他的细菌的细胞骨架蛋白。

Abstract

细菌细胞分裂需要协调的装配超过10种必需的蛋白质，在midcell ^1,2。这个过程的核心是形成一个环形的表壳构造（Z-环）的FtsZ蛋白的划分方案^3,4。的Z-环由多个单链FtsZ的原丝，并理解的Z-环内的原丝的配置将提供洞察作为力发生器^5,6 Z-环组件和它的功能的机制。此信息一直难以实现，由于目前的限制，在传统的荧光显微镜和电子显微镜。无法提供一个高分辨率图像的Z-环，由于光的衍射极限（〜200 nm）的常规的荧光显微镜。电子cryotomographic成像检测散FtsZ的原丝在小C. crescentus的电池^7，但很难适用于较大的细胞，例如大肠杆菌或 B。 枯草芽孢杆菌 。在这里，我们描述了一个超高分辨率荧光显微镜方法的应用，光敏定位显微镜（PALM），定量表征的组织结构的E.大肠杆菌 Z-环^8。

PALM成像可以同时提供高的空间分辨率（〜35纳米）和特定的标签，使靶蛋白的明确识别。我们标记FtsZ的可光活化的荧光蛋白mEos2，切换到绿色荧光（激发波长= 488纳米）的红色荧光（激发波长= 561纳米）激活后在405 nm ^9。在一个PALM试验，单的FtsZ，mEos2分子，随机激活，相应的单分子质心的位置确定精度<20纳米。甲的超分辨率图像的Z-环然后重建通过叠加的质心位置的所有检测到的FtsZ-mEos2分子。

<p类=的”jove_content”>使用这种方法，我们发现，在Z-环具有一个固定的宽度为100 nm，并组成一个松散捆FtsZ的原丝，在三维空间中彼此重叠。这些数据提供了进一步调查的跳板的Z形环¹⁰的细胞周期依赖性变化，并可以应用到其他感兴趣的蛋白质。

Protocol

1。样品制备

1. 应变JB281的单菌落接种LB培养基[BW25113 / pJB042（P _紫胶 :的FtsZ的mEos2）]。在振动机中生长过夜，在37℃下
2. 文化1:1,000稀释到M9 ⁺最小的媒体M9盐，0.4％葡萄糖，2毫米_硫酸镁 ，0.1毫米_氯化钙 ，MEM氨基酸和维生素]和成长中旬至对数生长期（OD ₆₀₀ = 0.2-0.3）氯霉素（150微克/毫升）的存在下，在室温（RT）。
3. 诱导文化与20μMIPTG 2小时（见注1）。
4. 颗粒的离心（8000转，1分钟），重悬在M9 ^+，重复相同体积的文化。所述第二再悬浮后，在RT下继续生长2小时。
5. 修复诱导培养，用4％多聚甲醛的PBS（pH值= 7.4），在RT下40分钟。团培养等体积的PBS重悬，重复。如果活细胞成像，与等量跳过固定，球团文化，重悬的M9 ^– [M9的盐，0.4％葡萄糖，2mM的用MgSO _4，0.1mM的CaCl _2的 [MEM氨基酸;重复。
6. 稀释黄金珠，1:10再悬浮文化。应用样品制备成像室（见2.4）。

[1]注:以上感应协议（步骤1.1-1.3）表达系统的应变JB281进行了优化。详细的诱导条件下可能会有所不同其他系统或蛋白质的表达。

2。大会影像厅

1. 3％（重量/体积）的琼脂糖溶液在M9 ^{– 。}熔化琼脂糖在70℃下在台式热块为40min。专区熔化琼脂糖在50℃达5小时。
2. 将一个洁净的microaqueduct幻灯片中的上半部分与电极面朝下的摄像室。对齐的下垫圈上microaqueduct幻灯片，以便覆盖灌注通道。
3. 应用〜50μl的熔化的琼脂糖的中心的玻璃幻灯片。立即琼脂糖凝胶滴用干净，干燥的盖玻片。使凝胶在室温固化30分钟。
   1. 要清洁盖玻片:安排在一个陶瓷支架的盖玻片，超声处理20分钟，在旋转浴，丙酮，乙醇和1M KOH在玻璃罐。重复循环三次，共9超声处理，然后由一个单一的超声处理在_蒸馏水中。将清洗盖玻片新鲜_蒸馏水中。使用前，将过滤后的空气吹干盖玻片。
4. 小心地取出盖玻片，使凝胶垫的microaqueduct的幻灯片。立即加入1微升的细胞培养样品（见步骤1.6）的凝胶垫的顶部。等待〜2分钟，使溶液被吸收的凝胶垫。顶部硅胶垫一个新的干净，干燥的盖玻片。装配整体成像室根据制造商的说明。

3。图像采集

1. 打开的显微镜，照相机和激光器。打开的MetaMorph软软件（Molecular Devices公司）。
2. 将适当的激发/发射滤波器的摄像路径中（ 图1）上。
3. 将激光功率和相应的采集设置。
   1. 488纳米激光= 15毫瓦（见注2）
   2. 561 nm激光= 75毫瓦
   3. 405 nm激光= 2兆瓦±中性密度滤镜 （见说明3）
4. 锁定成像室分成的阶段，通过互补阶段适配器。
5. 指定一个合适的成像区域（100×100像素），均匀照亮所有三个激光器。
6. 确定样区，包含细胞和基准标记（黄金珠）非常接近，但不重叠。
7. 集中最接近的盖玻片的细胞的表面上。一个明场图像采集与整合时间为50毫秒，移动焦点到0.5微米的样品（ 图3AI）。
8. 合奏与激发绿色荧光图像采集的488-N m激光使用的是50毫秒积分时间（ 图3Aii）。
9. 采集视频流在红色通道，连续照明405 nm和561 nm的激光器。对于固定的细胞中，50 ms的帧速率，总共20000张（共17分）与405纳米的激光功率斜坡〜10％，每1000帧（见注＃4）。对于活细胞中，一个10毫秒的帧速率被用于共3000帧（〜30秒总）在一个恒定的405-nm的激光功率。
10. 将焦点返回到的下表面上的细胞，并在步骤3.7中获得另一个明视野图像。

[2]注:一个细胞的绿色荧光的积分强度是成正比的FtsZ-mEos2分子在细胞中表达的总数。 488 nm激发动力和合奏荧光的采集设置应保持不变，为所有的细胞相对FtsZ的mEos2在不同细胞中的表达水平进行比较。

ontent”[3]注:固定细胞成像与中性密度（ND）滤镜（ 图1，光学组件＃5）在地方，以达到一个缓慢的启动速度，使每个单个分子可以准确识别。 ND滤光器除去成像时增加活细胞的激活率，同时保持较低的概率的两个分子，受衍射限制的区域中被同时激活。施加到活细胞成像速度是必要的，以减少总的采集时间，从而”冻结”的Z-环在时间和限制的光损伤的细胞的影响。

[4]注:收购的帧的数目进行了优化，为我们的系统中，并且依赖于特定的蜂窝结构，标签密度，活化率和，是否排出整个池荧光团是非常重要的分析。在活细胞中，重要的是在尽可能短的期间的钛，以获得足够数量的本地化我要尽可能避免蜂窝结构的移动引起的图像的模糊。

4。 PALM形象建设

1. 确定每个检测点的质心位置。
   1. 将图像堆栈到Matlab（MathWorks公司）。
   2. 裁剪图像堆栈的区域周围一格，排除基准珠的。
   3. 选择斑点检测，是上述的背景水平，但低于平均光斑强度的强度阈值。我们占本底水平的变化在整个实验的最大强度计算平均使用150帧窗口。然后，对每一帧的强度阈值从正在运行的平均值插值。
   4. 减去从每一帧中的各自的阈值。准点确定为与阈值以上的强度的三个相邻像素。
   5. 适合每个准点的荧光强度，以一个二维Gaussian函数[方程＃1]使用的非线性最小二乘算法（ 图2）。使用检测的光子的总数[等式＃2]来计算每个点的定位精度。任何不良的合适的点与定位精度大于20nm（固定的细胞）或45纳米（活细胞）（见注＃5）被丢弃。的具有的强度大于2倍的平均强度，这可能是由于重叠发射器的任何位置，也被丢弃。
   6. 固定细胞，除去重复观察同一分子无视任何地点，其质心位置是在45纳米 任何其他点，它之前由6或更少的帧。对于活细胞，所有景点都将保留。
2. 校准样品漂移基准标记的运动。
   1. 周围的基准标记出一个10×10像素区域的作物。
   2. 减去在4.1.3确定的各自的阈值，从每一帧中。
   3. 在每个适合的强度分布帧通过最小二乘法拟合算法假设一个二维高斯形状。
   4. 计算质心的相对位置第1帧之间的位移。
3. 纠正每一个独特的分子质心位置的确定在4.1与4.2计算合适的样品漂移。比较亮场图像中获得3.7和3.10。如果细胞观察到的基准标记的相对移动，数据将被抛出。
4. 15×15 nm的像素组成一个单一的形象叠加校正质心位置。绘制每个唯一的分子作为一个单位区域，二维高斯分布的重心位置为中心的，其标准偏差等于定位精度[等式＃2]。这样的查询结果中的概率密度图，其中的像素的强度正比于在该象素（ 图3Aiv）找到一个分子的可能性。
5. 比较PALM图像到合奏图像。
   1. 重新绘制的中心id会在4.4的位置，但在一个平面上与150×150 nm的像素和一个标准偏差等于250nm。这会产生一个PALM模仿受衍射限制的图像，它可以被用来比较受衍射限制的，合奏中3.8（ 图3Aiii）获取的图像的图像。
   2. 要确认所检测到的分子是代表整个人口，比较重建的合奏图像（ 图3Aiii，步骤4.5.1）与实验乐团荧光图像（ 图3Aii，步骤3.8），以确认这两个图像显示类似形状的结构，定向和相对强度。

[5]注:凭经验确定所需的最小定位精度为每个成像方法对于一个给定的样本，并通过绘制所有分子的精度，选择一个合适的切断。

5。 PALM图像分析

1. 测量Z-环WIDTh和直径。
   1. 旋转对PALM图像，以便以垂直方向的长轴的细胞（ 图4A）。
   2. 作物满分蜂窝区域含有的Z-环。
   3. 计算累积强度投射的强度分布沿细胞的长轴。
   4. 适合的强度分布为高斯分布。被定义为拟合的高斯分布（ 图4B）的全宽度半最大值（FWHM）的环宽度。
   5. 5.1.2项目的累积强度分布沿细胞的短轴。环直径的整个长度上的强度分布图（ 图4C）被定义为。
2. 绘制FtsZ的密度（见注＃6）。
   1. 重新绘制在（4.4）中的重心的位置，但没有的高斯分布的情况下，使得每一个独特的分子被赋予一个值1，并分配给对应于它的质心位置的单个像素。在这种方式中，每个的强度像素表示该像素中检测到的分子的总数。密度PALM图像，还可以可视化的等高线图（ 图5E）。
3. 确定空间分辨率。
   1. 从理论上讲，可以实现空间分辨率:创建一个有代表性的PSF整个样本确定的平均定位精度的检测的分子和计算FWHM（方程3）。
   2. 实验达到的空间分辨率相同的分子之间的重复观测计算的平均位移。

[6]注:我们使用全内反射的PALM（TIR-PALM， 如图1和图5），以限制上面的小区/玻璃界面的薄层（〜200 nm）的激活和激发。将被检测到，以便只FtsZ的分子与膜最接近盖玻片。

Representative Results

Discussion

PALM图像包含有关分子计数和在小区内的位置的信息，允许的靶蛋白分子的分布和排列是难以通过其他方式实现的详细分析。下面，我们列出了应采取的预防措施，提取准确的定量信息，同时保持生物PALM图像的相关性。我们还探索能最好地利用活细胞与固定的信息。最后，我们建议的渠道，获得额外的超分辨率细胞分裂机械信息。

上面描述的方法进行了优化，以产生精确的PALM图像以下列方式。首先，其特征在于，优化的融合蛋白的功能，以确保它作为一个可靠的标记Z-环结构^10。第二，我们微调的表达的融合蛋白，因为过表达不足的结果在异常结构的形成^10,12,13。第三，我们选择了阈值，确定独特的分子（4.1.5）根据荧光photoblinking ^14。 Photoblinking的决心独特的分子复杂，如果忽略，导致超量的单分子。 ，虽然超量不影响尺寸测量，它没有放大的绝对密度测量和可能会造成虚假集群的外观。所有这些因素时，应慎重考虑将该方法应用到其他蛋白质的。

用于成像的活的或固定细胞的选择取决于所需的信息和吞吐量。活细胞成像速度快（30秒），但只报告本地化的（ 即滞销）分子。这通常意味着，唯一的膜相关的分子在活细胞中观察到的，而固定的细胞提供对所有标记的​​分子的信息。活细胞成像公关ovides高分辨率的结构尺寸和形态，但不能提供准确的分子密度测量由于单个分子的运动。固定的细胞图像可以提供所有这些信息，但需要UV活化水平低，使独特的分子可以。这导致延长成像时间（> 15分钟）。此外，固定可能会导致结构异常。所有这些因素都应该是平衡的选择样品类型使用时。

我们已经描述了PALM方法提供的Z-的环结构，可以跨不同的菌株，细胞周期的状态，和生长条件相比，超分辨率的细节。最近的技术进步的实施可以在cytokinetic的Z环的机制提供额外的洞察力。例如，引入散光到检测途径是最简单的方式来增加三维能力（〜100 nm的z轴分辨率）的光学设置illust评价图1中的^15。此外，同时成像，同时在两个或两个以上的蛋白质，可光活化荧光蛋白的光谱不同的迅速崛起已成为一个现实的选择。最后，一​​个的荧光蛋白photoactivates在UV独立的方式发展，而不会产生405 nm的光照诱导的DNA损伤的单细胞进行长期监测。

Materials

50 x MEM Amino Acids	Sigma	M5550
100 x MEM Vitamins	Sigma	M6895
IPTG	Mediatech	46-102-RF
16% Paraformaldehyde	Electron Micrsocopy Sciences	15710-S
SeaPlaque GTG Agarose	Lonzo	50111
50 nm Gold Beads	Microspheres-Nanospheres	790113-010
FCS2 Imaging Chamber	Bioptechs
Stage Adaptor	ASI	I-3017
Inverted Microscope	Olympus	IX71
1.45 NA, 60x Objective	Olympus
IXON EMCCD Camera	Andor Technology	DU897E
488-nm Sapphire Laser	Coherent
561-nm Sapphire Laser	Coherent
405-nm CUBE Laser	Coherent