细菌分裂机器的超分辨率成像

摘要

我们描述了一种超分辨率成像方法，用于研究细菌FtsZ环的结构组织，该结构是细胞分裂所必需的重要装置。该方法基于对光激活定位显微镜（PALM）图像的定量分析，可应用于其他细菌细胞骨架蛋白的研究。

摘要

细菌细胞分裂需要在细胞中部协调组装十余种必需蛋白质^1,2。该过程的核心是由FtsZ蛋白在分裂面上形成环状超结构（Z环）^3,4。Z环由多条单链FtsZ原丝组成，了解原丝在Z环内的排列方式将有助于揭示Z环的组装机制及其作为力生成器的功能^5,6。由于传统荧光显微镜和电子显微镜的技术局限，这一信息至今仍不明确。传统荧光显微镜受限于光的衍射极限（约200 nm），无法提供Z环的高分辨率图像。电子冷冻断层成像已在小型的C. crescentus细胞中检测到分散的FtsZ原丝⁷，但难以应用于E. coli或B. subtilis等较大的细胞。本文描述了一种超分辨率荧光显微技术——光激活定位显微镜（PALM）的应用，用于定量表征E. coli Z环的结构组织⁸。

PALM 成像技术兼具高空间分辨率（约 35 nm）和特异性标记能力，可明确识别靶标蛋白。我们使用光激活荧光蛋白 mEos2 标记 FtsZ，该蛋白在 405 nm 激活后，荧光由绿色（激发波长 = 488 nm）转变为红色（激发波长 = 561 nm）⁹。在 PALM 实验过程中，单个 FtsZ-mEos2 分子被随机激活，并以 <20 nm 的精确定位其单分子对应的质心位置。随后，通过叠加所有检测到的 FtsZ-mEos2 分子的质心位置，重构出 Z 环的超分辨率图像。

利用该方法，我们发现 Z 环具有约 100 nm 的固定宽度，由在三维空间中相互重叠的松散 FtsZ 原丝束构成。这些数据为深入研究 Z 环在细胞周期依赖性变化方面提供了基础¹⁰，并可应用于其他感兴趣的蛋白质。

方案

1. 样品制备

1. 用单个菌落JB281 [BW25113 / pJB042 (P_Lac:FtsZ-mEos2)] 接种LB培养基。在37 °C摇床中过夜培养。
2. 将培养物按1:1,000比例稀释至M9⁺最低培养基 [M9盐溶液、0.4%葡萄糖、2 mM MgSO₄、0.1 mM CaCl₂、MEM氨基酸和维生素] 中，并在室温（RT）下加入氯霉素（150 μg/ml）培养至对数中期（OD₆₀₀ = 0.2–0.3）。
3. 用20 μM IPTG诱导培养物2小时（见注释#1）。
4. 在微量离心机中沉淀培养物（8,000 rpm，1分钟），并用等体积M9⁺重悬；重复一次。第二次重悬后，继续在室温下培养2小时。
5. 用含4%多聚甲醛的PBS缓冲液（pH = 7.4）在室温下固定诱导后的培养物40分钟。离心收集细胞后，用等体积PBS重悬；重复一次。若需成像活细胞，则跳过固定步骤，离心收集培养物后用等体积M9^- [M9盐溶液、0.4%葡萄糖、2 mM MgSO₄、0.1 mM CaCl₂、MEM氨基酸]重悬；重复一次。
6. 将金珠按1:10比例与重悬的培养物混合。将样品施加至已准备好的成像室（见步骤2.4）。

结果

图3Aiv展示的是通过上述PALM成像方法获得的Z环的二维超分辨率图像。下文总结了可从中获取的定性与定量信息。

定性观察显示，Z环是一种不规则结构，可呈现多种构型（单一带状或螺旋弧形），这些构型在常规荧光图像中难以区分（比较图3A-Dii与iv）。此类观察可用于确定细胞群体中呈现特定结构构型的比例。

我们还可以对 Z 环的尺寸进行定量测量。测定环宽度和直径的方法详见步骤 5.1，并在图中予以示意。 图4从 图 4B，环的宽度被确定为113 nm（FWHM）。该值宽于预期的单根FtsZ原丝纤维的宽度（5–10 nm，基于 体外 EM¹¹）。在 图4C环的直径测量为1,050 nm。该直径可用于定量描述细胞分裂过程中的收缩程度。

讨论

PALM 图像包含细胞内分子数量和位置的信息，能够对目标蛋白质分子的分布与排列进行详细分析，而这种分析通过其他方法难以实现。下面我们概述在提取 PALM 图像中准确的定量信息时应采取的注意事项，同时保持其生物学相关性。我们还探讨了使用活细胞与固定细胞所能获得的最佳信息类型。最后，我们提出了获取有关细胞分裂机制更多超分辨率信息的可能途径。

上述方法已通过以下方式优化，以获得准确的 PALM 成像结果。首先，我们对融合蛋白的功能进行了表征和优化，以确保其可作为 Z 环结构的可靠标记物¹⁰。其次，我们精细调控了融合蛋白的表达水平，因为过高或过低的表达均会导致异常结构的形成^10,12,13。第三，我们根据荧光染料的光致闪烁特性（photoblinking properties）设定了唯一分子判定的阈值（步骤 4.1.5）¹⁴。光致闪烁会干扰对唯一分子的识别，若忽略该现象，将导致单分子计数过高。尽管过度计数不影响尺寸测量，但会放大绝对密度测量值，并可能造成虚假簇状结构的假象。在将本方法应用于其他目标蛋白时，应充分考虑上述各项.......

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
50 x MEM 氨基酸	Sigma	M5550
100 x MEM 维生素	Sigma	M6895
IPTG	Mediatech	46-102-RF
16% 多聚甲醛	Electron Micrsocopy Sciences	15710-S
SeaPlaque GTG 琼脂糖	Lonzo	50111
50 nm 金珠	Microspheres-Nanospheres	790113-010
FCS2 成像室	Bioptechs
载物台适配器	ASI	I-3017
倒置显微镜	Olympus	IX71
1.45 NA，60x 物镜	Olympus
IXON EMCCD 相机	Andor Technology	DU897E
488-nm Sapphire 激光器	Coherent
561-nm Sapphire 激光器	Coherent
405-nm CUBE 激光器	Coherent