我们描述了一种超分辨率成像方法，用于研究细菌FtsZ环的结构组织，该结构是细胞分裂所必需的重要装置。该方法基于对光激活定位显微镜（PALM）图像的定量分析，可应用于其他细菌细胞骨架蛋白的研究。
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摘要
摘要
细菌细胞分裂需要在细胞中部协调组装十余种必需蛋白质1,2。该过程的核心是由FtsZ蛋白在分裂面上形成环状超结构（Z环）3,4。Z环由多条单链FtsZ原丝组成，了解原丝在Z环内的排列方式将有助于揭示Z环的组装机制及其作为力生成器的功能5,6。由于传统荧光显微镜和电子显微镜的技术局限，这一信息至今仍不明确。传统荧光显微镜受限于光的衍射极限（约200 nm），无法提供Z环的高分辨率图像。电子冷冻断层成像已在小型的C. crescentus细胞中检测到分散的FtsZ原丝7，但难以应用于E. coli或B. subtilis等较大的细胞。本文描述了一种超分辨率荧光显微技术——光激活定位显微镜（PALM）的应用，用于定量表征E. coli Z环的结构组织8。
PALM 成像技术兼具高空间分辨率（约 35 nm）和特异性标记能力，可明确识别靶标蛋白。我们使用光激活荧光蛋白 mEos2 标记 FtsZ，该蛋白在 405 nm 激活后，荧光由绿色（激发波长 = 488 nm）转变为红色（激发波长 = 561 nm）9。在 PALM 实验过程中，单个 FtsZ-mEos2 分子被随机激活，并以 <20 nm 的精确定位其单分子对应的质心位置。随后，通过叠加所有检测到的 FtsZ-mEos2 分子的质心位置，重构出 Z 环的超分辨率图像。
利用该方法，我们发现 Z 环具有约 100 nm 的固定宽度，由在三维空间中相互重叠的松散 FtsZ 原丝束构成。这些数据为深入研究 Z 环在细胞周期依赖性变化方面提供了基础10，并可应用于其他感兴趣的蛋白质。
方案
1. 样品制备
- 用单个菌落JB281 [BW25113 / pJB042 (PLac:FtsZ-mEos2)] 接种LB培养基。在37 °C摇床中过夜培养。
- 将培养物按1:1,000比例稀释至M9+最低培养基 [M9盐溶液、0.4%葡萄糖、2 mM MgSO4、0.1 mM CaCl2、MEM氨基酸和维生素] 中，并在室温（RT）下加入氯霉素（150 μg/ml）培养至对数中期（OD600 = 0.2–0.3）。
- 用20 μM IPTG诱导培养物2小时（见注释#1）。
- 在微量离心机中沉淀培养物（8,000 rpm，1分钟），并用等体积M9+重悬；重复一次。第二次重悬后，继续在室温下培养2小时。
- 用含4%多聚甲醛的PBS缓冲液（pH = 7.4）在室温下固定诱导后的培养物40分钟。离心收集细胞后，用等体积PBS重悬；重复一次。若需成像活细胞，则跳过固定步骤，离心收集培养物后用等体积M9- [M9盐溶液、0.4%葡萄糖、2 mM MgSO4、0.1 mM CaCl2、MEM氨基酸]重悬；重复一次。
- 将金珠按1:10比例与重悬的培养物混合。将样品施加至已准备好的成像室（见步骤2.4）。
[1] 注意：上述诱导方案（步骤 1.1-1.3）已针对菌株 JB281 的表达系统进行优化。其他表达系统或目标蛋白的详细诱导条件可能会有所不同。
2. 成像室的组装
- 在 M9- 中配制 3% (w/v) 琼脂糖溶液。将琼脂糖置于台式加热块中，于 70 °C 下熔化 40 分钟。熔化后的琼脂糖可在 50 °C 下保存最多 5 小时。
- 将洁净的微通道载玻片放置于成像室上半部分，电极朝下。将下部垫圈对准微通道载玻片，使其覆盖灌流通道。
- 在玻片中央加入约 50 μl 熔化的琼脂糖。立即在琼脂糖凝胶液滴上覆盖一片洁净干燥的盖玻片。室温下静置 30 分钟，使凝胶完全凝固。
- 盖玻片清洗方法：将盖玻片置于陶瓷架中，依次在玻璃瓶内的丙酮、乙醇和 1M KOH 溶液中进行旋转超声处理，每种溶液超声 20 分钟。重复该循环三次，共进行 9 次超声处理，最后在 dH2O 中进行一次超声处理。清洗后的盖玻片保存于新鲜的 dH2O 中。使用前用过滤空气吹干。
- 小心移除盖玻片，将凝胶垫留在微通道载玻片上。立即在凝胶垫表面加入 1 μl 细胞培养样品（见步骤 1.6）。等待约 2 分钟，使溶液被凝胶垫吸收。随后在凝胶垫上覆盖一片新的洁净干燥盖玻片。按照制造商说明组装完整的成像室。
3. 图像采集
- 打开显微镜、相机和激光器。启动 MetaMorph 软件（Molecular Devices）。
- 在成像光路中放置适当的激发/发射滤光片（图 1）。
- 根据需要设置激光功率和采集参数。
- 488 nm 激光 = 15 mW（参见注释 #2）
- 561 nm 激光 = 75 mW
- 405 nm 激光 = 2 mW ± 中性密度滤光片（ 参见注释 #3）
- 通过配套的载物台适配器将成像室固定在载物台上。
- 选择一个适当的成像区域（100×100 像素），确保该区域被三种激光均匀照射。
- 确定一个同时包含细胞和定位标记物（金颗粒）的样品区域，两者应彼此靠近但不重叠。
- 将焦平面聚焦于靠近盖玻片的细胞表面。以 50 ms 的积分时间采集一张明场图像，然后将焦点向样品内部移动 0.5 μm（图 3Ai）。
- 使用 488 nm 激光激发，以 50 ms 的积分时间采集整体绿色荧光图像（图 3Aii）。
- 在红色通道中连续使用 405 nm 和 561 nm 激光照射，采集流式视频。对于固定细胞，采用 50 ms 帧率，共采集 20,000 帧（总计约 17 分钟），每 1,000 帧将 405 nm 激光功率增加约 10%（参见注释 #4）。对于活细胞，采用 10 ms 帧率，共采集 3,000 帧（总计约 30 秒），405 nm 激光功率保持恒定。
- 将焦平面移回至细胞的下表面，按照步骤 3.7 再次采集一张明场图像。
[2] 注意：细胞绿色荧光的积分强度与细胞中表达的 FtsZ-mEos2 分子总数成正比。所有细胞的 488 nm 激发光功率和群体荧光采集参数应保持一致，以便比较不同细胞中 FtsZ-mEos2 的相对表达水平。
[3] 注意：为了实现较慢的激活速率，从而准确定位每一个单个分子，固定细胞成像时需使用中性密度（ND）滤光片（图1，光学组件 #5）。而在活细胞成像时则移除ND滤光片，以提高激活速率，同时保持在衍射极限区域内同时激活两个分子的概率较低。活细胞成像需要更快的激活速率，以缩短整个采集时间，从而在时间上“冻结”Z环结构，并限制光损伤对细胞的影响。
[4] 注意：所采集的帧数已针对我们的系统进行了优化，具体数量取决于特定的细胞结构、标记密度、激活率，以及分析时是否需要耗尽全部荧光分子库。在活细胞中，为避免细胞结构运动导致图像模糊，需在尽可能短的时间内获得足够数量的定位点。
4. PALM 图像构建
- 确定每个检测到的斑点的质心位置。
- 将图像序列加载到 Matlab（MathWorks, Inc）中。
- 裁剪图像堆栈，选取一个细胞周围的区域，并排除所有标记微珠。
- 为斑点检测选择一个高于背景水平但低于平均斑点强度的强度阈值。我们通过使用150帧窗口计算最大强度的滑动平均值，来校正整个实验过程中背景水平的变化。然后根据滑动平均值对每一帧的强度阈值进行插值。
- 从每一帧中减去相应的阈值。将三个相邻像素的强度均高于阈值的区域识别为潜在斑点。
- 使用非线性最小二乘算法，将每个预期斑点的荧光强度拟合至二维高斯函数［方程 #1］图2）。每个荧光点的定位精度根据检测到的光子总数计算 [公式 #2]。定位精度大于 20 nm（固定细胞）或 45 nm（活细胞）的拟合不良荧光点将被剔除（参见注释 #5）。强度超过平均强度两倍以上的荧光点，可能由于发射源重叠，也将被剔除。
- 对于固定细胞，通过忽略质心位置在45 nm范围内的任何重复斑点，去除同一分子的重复观测 任何其他在其之前6帧或更少帧数出现的斑点。对于活细胞，保留所有斑点。
- 使用标志物移动校准样本漂移。
- 在标志物周围裁剪出一个 10×10 像素的区域。
- 从每一帧中减去在4.1.3节中确定的相应阈值。
- 通过最小二乘拟合算法，假设为二维高斯形状，对每帧中的强度分布进行拟合。
- 计算相对于第1帧的质心位置之间的位移。
- 根据4.2中计算的适当样本漂移，校正4.1中识别出的每个独特分子的质心位置。比较3.7和3.10中获取的明场图像。若观察到细胞相对于基准标记物发生移动，则舍弃该数据。
- 将所有校正后的质心位置叠加到一幅由 15×15 nm 像素组成的图像上。将每个唯一的分子绘制成一个单位面积的二维高斯分布曲线，其中心位于质心位置，标准差等于定位精度［公式 #2］。由此得到一幅概率密度图，其中每个像素的强度与在该像素位置检测到分子的概率成正比。图3Aiv).
- 将PALM图像与整体成像图像进行比较。
- 按照4.4中的方法重新绘制质心位置，但在一个像素尺寸为150×150 nm、标准差为250 nm的平面上进行。这将生成一幅模拟衍射极限图像的PALM图像，可用于与3.8中获得的衍射极限集合图像进行比较图 3Aiii).
- 为了确认所检测到的分子能够代表整个群体，需比较重建的集合图像（图 3Aiii，步骤 4.5.1）与实验组荧光图像（图 3Aii，步骤 3.8）以确认两幅图像显示的结构具有相似的形状、方向和相对强度。
[5] 注意：每种成像方法所需的最低定位精度是通过实验确定的，方法是对给定样本中所有分子的定位精度进行作图，并选择适当的截断值。
5. PALM 图像分析
- 测量Z环宽度和直径。
- 旋转PALM图像，使细胞的长轴垂直定向（图4A）。
- 裁剪出包含Z环的细胞区域。
- 沿细胞长轴投影强度分布，计算累积强度。
- 将强度分布拟合为高斯分布。环的宽度定义为拟合高斯分布的半高全宽（FWHM）（图4B）。
- 沿细胞短轴投影步骤5.1.2中的累积强度分布。环的直径定义为强度分布的全长（图4C）。
- 绘制FtsZ密度（见注释#6）。
- 重新绘制质心位置，如步骤(4.4)所示，但不使用高斯拟合，使得每个独特分子赋值为1，并分配至对应其质心位置的单个像素。通过此方法，每个像素的强度代表在该像素中检测到的分子总数。密度PALM图像也可显示为等高线图（图5E）。
- 确定空间分辨率。
- 理论可达空间分辨率：利用所有检测到分子的平均定位精度，为整个样品创建一个代表性的点扩散函数（PSF），并计算其半高全宽（FWHM）（公式#3）。
- 实验可达空间分辨率：计算同一分子多次观测之间的平均位移。
[6] 注意：我们采用全内反射 PALM 技术（TIR-PALM，图 1 和 5），将激活与激发限制在细胞/玻璃界面以上的一薄层（约 200 nm）范围内，从而仅能检测到与盖玻片最近的膜结合的 FtsZ 分子。
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结果
图3Aiv展示的是通过上述PALM成像方法获得的Z环的二维超分辨率图像。下文总结了可从中获取的定性与定量信息。
定性观察显示，Z环是一种不规则结构，可呈现多种构型（单一带状或螺旋弧形），这些构型在常规荧光图像中难以区分（比较图3A-Dii与iv）。此类观察可用于确定细胞群体中呈现特定结构构型的比例。
我们还可以对 Z 环的尺寸进行定量测量。测定环宽度和直径的方法详见步骤 5.1，并在图中予以示意。 图4从 图 4B，环的宽度被确定为113 nm（FWHM）。该值宽于预期的单根FtsZ原丝纤维的宽度（5–10 nm，基于 体外 EM11）。在 图4C环的直径测量为1,050 nm。该直径可用于定量描述细胞分裂过程中的收缩程度。
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讨论
PALM 图像包含细胞内分子数量和位置的信息，能够对目标蛋白质分子的分布与排列进行详细分析，而这种分析通过其他方法难以实现。下面我们概述在提取 PALM 图像中准确的定量信息时应采取的注意事项，同时保持其生物学相关性。我们还探讨了使用活细胞与固定细胞所能获得的最佳信息类型。最后，我们提出了获取有关细胞分裂机制更多超分辨率信息的可能途径。
上述方法已通过以下方式优化，以获得准确的 PALM 成像结果。首先，我们对融合蛋白的功能进行了表征和优化，以确保其可作为 Z 环结构的可靠标记物10。其次，我们精细调控了融合蛋白的表达水平，因为过高或过低的表达均会导致异常结构的形成10,12,13。第三，我们根据荧光染料的光致闪烁特性（photoblinking properties）设定了唯一分子判定的阈值（步骤 4.1.5）14。光致闪烁会干扰对唯一分子的识别，若忽略该现象，将导致单分子计数过高。尽管过度计数不影响尺寸测量，但会放大绝对密度测量值，并可能造成虚假簇状结构的假象。在将本方法应用于其他目标蛋白时，应充分考虑上述各项...
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致谢
资助项目：5RO1GM086447-02。
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 50 x MEM 氨基酸 | Sigma | M5550 | |
| 100 x MEM 维生素 | Sigma | M6895 | |
| IPTG | Mediatech | 46-102-RF | |
| 16% 多聚甲醛 | Electron Micrsocopy Sciences | 15710-S | |
| SeaPlaque GTG 琼脂糖 | Lonzo | 50111 | |
| 50 nm 金珠 | Microspheres-Nanospheres | 790113-010 | |
| FCS2 成像室 | Bioptechs | ||
| 载物台适配器 | ASI | I-3017 | |
| 倒置显微镜 | Olympus | IX71 | |
| 1.45 NA，60x 物镜 | Olympus | ||
| IXON EMCCD 相机 | Andor Technology | DU897E | |
| 488-nm Sapphire 激光器 | Coherent | ||
| 561-nm Sapphire 激光器 | Coherent | ||
| 405-nm CUBE 激光器 | Coherent |
参考文献
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