利用双光子显微镜在慕尼黑Wistar大鼠量化肾小球通透性荧光大分子

Summary

利用高分辨率intavital 2 - 光子显微镜的技术直接可视化和量化表面肾小球过滤gloemrular。此方法允许在正常和疾病状态的大分子渗透特性的直接测定。

Abstract

肾疾病，尿中丢失大必不可少的大分子，如血清白蛋白，一直被认为由足细胞的通透性屏障，血管内皮细胞，和以协调方式工作的基底膜的改变引起的。数据从我们的实验室中使用活体双光子显微镜揭示一个更具渗透性的肾小球滤过屏障（GFB），比以前认为的生理条件下，过滤白蛋白发生在早期的子细胞，称为肾小管上皮细胞^（PTC）1,2检索^{， 3。}

用以前的技 ​​术研究肾小球滤过和建立滤过屏障特性，包括微注射，这些早期的管状部分的内腔中的流体含量的采样和分析^4。这些研究确定管腔液中的白蛋白浓度几乎不存在相应密切通常是在尿中检测到。然而，葡聚糖聚合物，用这种技术定义的大小的表征显示大小类似血清白蛋白的管状腔体和尿中有更高的水平;提示通透性增加^5。

本文是一个详细的轮廓，所使用的技术，直接可视化和量化肾小球荧光体内白蛋白通透性 。这种方法可以检测过滤白蛋白整个鲍曼的空间（初始尿过滤室）的滤过屏障进入，也允许由近端肾小管重吸收白蛋白定量和随后的白蛋白transcytosis的⁶可视化。荧光白蛋白的情况下购买沿管状段途中膀胱突出检索通路在较早的近端小管段的效率。此外，当这种技术用于测定渗透率葡聚糖具有类似大小白蛋白几乎相同的渗透率值报告^2。这些意见直接支持需要扩大许多蛋白尿的肾脏疾病的重点包括改变近端小管细胞填海的。

Protocol

1。共轭大鼠血清白蛋白磺酸罗丹明101磺酰氯（德州红）

1. 溶解100mg大鼠血清白蛋白（RSA）6.667毫升100毫米碳酸氢钠pH值9.0;终浓度为15毫克/毫升，50毫升锥形管。
2. 将溶液在冰/水的烧杯中，并冷却至0至4℃之间
3. 高品质的无水二甲基甲酰胺（DMF）中加入200微升10毫克小瓶德克萨斯红磺酰氯（TRSC）培养基上，在15秒的涡流。
4. 的涡RSA解决方案培养基上，并添加溶解TRSC。
5. 余音50毫升​​锥形箔（封口膜可以用来保证形成紧密的密封），在水平方向冰桶/冰和摇杆慢慢搅拌溶液（避免形成气泡）的地方，使反应继续在0至4℃，1小时。
6. 5升0.9％的生理盐水溶液，湿50 kDa的分子量切断腔室可以是一个）透析膜用夹子，二）二"辩管浮法一个仪，或c）滑一仪盒（适合除去未结合TRSC）。
7. 在透析室和5升的容器瓦特/ 0.9％的生理盐水溶液，将反应混合物在4℃透析过夜用温和的用搅拌棒搅拌。
8. 更改在早晨和傍晚5升透析液，直到孵育过夜结果几乎没有颜色的变化（这通常需要交流至少4〜48小时）。此外，用截留分子量为50 kDa的如此接近的采用RSA，分子量66kDa;可能永远不会产生澄清的溶液，这将依赖于膜的孔径分布在60小时和第5交流超过足够的时间。
9. 测量体积和划分的初始重量为100毫克的体积，得到浓度大约TR-RSA，典型的浓度范围为63-82毫克/毫升。最终染料:白蛋白....

Results

图3显示拍摄的图像，例如，从一个表面肾小球慕尼黑WistarFrömter的大鼠和所采取的步骤，以确定荧光蛋白的渗透性。 GSC的白蛋白的值0.0111来自这个人肾小球下降的慕尼黑Wistar大鼠的供给条件³时，该菌株在看到的范围内。在这些图像中看到的稳定性是由于仔细地规划和在图1和图2中所示的指令的执行。如前所述，切口的位置外肾是最关​​键的一步，在生产稳定的图像无运动伪影。

图1。定位方向的详细图解大鼠前显微镜舞台上成像。轻轻地将大鼠肾脏面朝下（如在A所示.......

Discussion

这里强调的步骤代表我们的感受是，将产生一致和准确的渗透值，因为他们规避以下陷阱:

1. 散射:使用红色发光的荧光基团可以更有效地收集光，因为较长的波长的光子是不容易分散。使用绿色或蓝色发光荧光团将在GSC的引入更大的变化，因为增加了毛细血管袢和鲍曼的空间变异强度值。
2. 图像深度:尽管深通常是收集3D数据集（通常是总深度在30-45微米之间）;高10-15微米代表震源深度最合适的确定GSC值。再次更深的深度来，在灵敏度和变化性的增加，由于发射的光子的散射减少。然而更重要的是拥挤发生毛细血管袢ð肾小球内eeper。在这里，毛细血管袢推高密切鲍曼的胶囊鲍曼的空间周围的边缘。这无意中选择一个区域，直接超过了无数足细胞周围的毛细血管循环的机会增加。这会导致低估GSC的，因为真正的，更高强度的过滤白蛋白不会被报告。注意面板B和D在图3和毛细管循环的边缘和边缘鲍曼的空间³空间之间存在大量的。
3. 采样:选择几个地区鲍曼的空间内，确保检测过滤白蛋白水平的最佳逼近。同样重要的是，以避免区域，如11和12点的位置，毛细管循环。通过三维体积为重点，揭示了几.......

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
奥林巴斯 Floview 1000 共聚焦/多光子显微镜	奥林巴斯美国		探测器滤光片：蓝色 430/100、绿色 525/50、红色 605/90
锁模钛：蓝宝石 Mai Tai 激光	光谱物理		可调谐激发波长：~750-1150 nm
磷化砷化镓光电探测器	滨松公司		注：提供正面或侧面安装配置。
变形图像处理软件	分子动力学		注意：版本 6.1r1
Microsoft Excel	Microsoft Corportation		2007 版本
处理 镊子	电子显微镜科学	Cat# 78266-04
Mayo 解剖剪刀	电子显微镜科学	Cat# 72962
CA 微型剪刀 型号 1C300	电子显微镜科学	Cat# 78180-1C3
Kelly 止血钳（直）	电子显微镜科学	Cat# 72930
水套毯 + 加热垫	Gaymar		T/泵 PN 11184-000 毯子-66N111CC
Repti-Therm 罐下加热器	ZooMed		RH-4
德克萨斯红磺酰氯	Invitrogen/分子探针	Cat# T-353
大鼠血清白蛋白	Sigma Aldrich	Cat# A-6272
高质量无水 DMF	Sigma Aldrich	Cat# 270547
标准线高压灭菌带	Fisher Scientific	Cat# 11-889-1
Willco-dish 盖玻片底部培养皿（50 mm/40 mm 盖玻片）	电子显微镜科学	Cat# 70665-07