使用双光子显微镜定量中国台湾慕尼黑维斯塔大鼠肾小球对荧光大分子的通透性

摘要

一种利用高分辨率活体双光子显微镜直接观察和量化表层肾小球滤过功能的技术。该方法可直接测定大分子在正常和疾病状态下的通透性特征。

摘要

长期以来，人们认为肾脏疾病中出现尿液大量丢失重要的大分子物质（如血清白蛋白）的现象，是由足细胞、血管内皮细胞和基底膜共同构成的通透性屏障发生改变所致。我们实验室利用活体双光子显微镜获得的数据表明，在生理条件下，肾小球滤过屏障（GFB）的通透性比以往认为的更高，滤过的白蛋白可在一组早期细胞——近端小管细胞（PTC）中被重新吸收^1,2,3。

既往研究肾小球滤过功能及滤过屏障特性的技术，涉及对近端小管起始段管腔进行微穿刺，采集管腔内液体并进行分析⁴。这些研究表明，管腔液中的白蛋白浓度几乎检测不到，与正常尿液中所观察到的水平相近。然而，利用该技术对具有确定分子大小的葡聚糖聚合物进行表征时发现，分子大小与血清白蛋白相似的葡聚糖在肾小管管腔和尿液中的含量更高，提示其通透性增加⁵。

本文详细阐述了一种用于直接可视化并定量评估肾小球荧光白蛋白通透性的 in vivo 技术。该方法可检测白蛋白穿过滤过屏障进入鲍曼氏囊（尿液滤过的起始腔室）的情况，同时还能定量近端小管对白蛋白的重吸收，并可视化后续的白蛋白转胞吞作用⁶。在通往膀胱的远端小管各段中未观察到荧光白蛋白的存在，突显了近端小管早期节段在白蛋白回收通路中的高效性。此外，当该技术被用于测定与白蛋白大小相似的葡聚糖的通透性时，报道了几乎相同的通透性数值²。这些发现直接支持有必要将多种蛋白尿性肾病的研究重点扩展至近端小管细胞重吸收功能的改变。

方案

1. 大鼠血清白蛋白与磺化罗丹明101磺酰氯（Texas Red）的偶联

1. 在50 ml锥形管中，将100 mg大鼠血清白蛋白（RSA）溶解于6.667 ml 100 mM pH 9.0的碳酸氢钠溶液中，终浓度为15 mg/ml。
2. 将溶液置于冰/水浴烧杯中，冷却至0至4 °C之间。
3. 向含有10 mg德克萨斯红磺酰氯（TRSC）的西林瓶中加入200 μl高纯度无水二甲基甲酰胺（DMF），中速涡旋振荡15秒。
4. 中速涡旋振荡RSA溶液，然后加入已溶解的TRSC。
5. 用铝箔包裹50 ml锥形管（可使用Parafilm密封以确保密闭），水平放置于仅含冰的冰桶中，并置于摇床上缓慢振荡（避免产生气泡），在0至4 °C条件下反应1小时。
6. 配制5 L 0.9%生理盐水溶液，并润湿一个分子量截留值为50 kDa的透析装置，该装置可以是：a）带夹子的透析膜，b）浮式透析器（float-a-lyzer）中的透析管，或c）滑入式透析盒（slide-a-lyzer cassette）（均适用于去除未结合的TRSC）。
7. 将反应混合物转移至透析装置中，放入盛有5 L 0.9%生理盐水溶液的容器内，在4 °C下以磁力搅拌器轻柔搅拌，透析过夜。
8. 早晨和傍晚更换5 L透析液，直至过夜孵育后透析液几乎无颜色变化（通常需要约48小时，至少更换4次）。此外，由于50 kDa的截留分子量与RSA的分子量（66 kDa）....

结果

图3展示了一张来自慕尼黑维斯塔大鼠（Munich Wistar Frömter rat）肾小球表面的图像示例，以及测定荧光白蛋白通透性的操作步骤。该肾小球所得白蛋白GSC值为0.0111，处于进食状态下此品系慕尼黑维斯塔大鼠的典型范围内³。这些图像中所呈现的稳定性，得益于对图1和图2所示操作步骤的周密规划与准确执行。如前所述，在暴露肾脏时切口位置的选择是获得无运动伪影稳定图像的最关键步骤。

.......

讨论

此处强调的步骤是我们认为能够获得稳定且准确的通透性数值的操作，因为它们规避了以下陷阱：

1. 散射：使用红色发射荧光染料可更高效地收集光信号，因为长波长光子更不易发生散射。若使用绿色或蓝色发射荧光染料，则由于肾小球毛细血管袢和鲍曼氏囊腔内强度值的变异性增加，将导致肾小球滤过系数（GSC）的变异性增大³。
2. 成像深度：尽管通常会采集较深的三维数据集（总深度常在30–45微米之间），但最适宜用于确定GSC值的焦平面深度为表层10–15微米。更深的成像深度会导致灵敏度下降和变异性增加，这是由于发射光子的散射所致。然而更重要的是，在肾小球更深层处毛细血管袢更为密集，这些毛细血管袢被挤压至紧邻包围鲍曼氏囊腔的鲍曼氏囊壁边缘。这会增加意外选中覆盖在毛细血管袢周围众多足细胞之一正上方区域的可能性，从而导致GSC值被低估，因为滤过的白蛋白真实且较高的荧光强度将无法被准确检测。请参见图3中的B和D图示，注意毛细血管袢边缘与鲍曼氏囊腔边缘之间存在较大空间³。
3. 取样：在鲍曼氏囊腔内选择多个区域，有助于更准.......

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
奥林巴斯Fluoview 1000共聚焦/多光子显微镜	奥林巴斯美国公司		探测器滤光片：蓝色 430/100，绿色 525/50，红色 605/90
锁模钛宝石Mai Tai激光器	光谱物理公司		可调激发波长：~750-1150 nm
砷化镓磷化物光电探测器	滨松公司		注：可提供前置或侧置安装配置。
MetaMorph图像处理软件	分子动力学公司		注：版本6.1r1
Microsoft Excel	微软公司		2007版本
操作镊子	电子显微科学公司	Cat# 78266-04
梅奥解剖剪刀	电子显微科学公司	Cat# 72962
CA显微剪刀型号1C300	电子显微科学公司	Cat# 78180-1C3
凯利止血钳（直型）	电子显微科学公司	Cat# 72930
水循环毯式加热垫	Gaymar公司		T/Pump PN 11184-000 毯子-66N111CC
爬行动物用罐底加热器Repti-Therm	ZooMed公司		RH-4
德克萨斯红磺酰氯	英杰公司/分子探针	Cat# T-353
大鼠血清白蛋白	西格玛-奥德里奇公司	Cat# A-6272
高质量无水DMF	西格玛-奥德里奇公司	Cat# 270547
Strate-Line高压灭菌指示胶带	费希尔科技公司	Cat# 11-889-1
Willco-dish盖玻片底培养皿（50 mm/40 mm盖玻片）	电子显微科学公司	Cat# 70665-07