使用双光子显微镜定量中国台湾慕尼黑维斯塔大鼠肾小球对荧光大分子的通透性

摘要

一种利用高分辨率活体双光子显微镜直接观察和量化表层肾小球滤过功能的技术。该方法可直接测定大分子在正常和疾病状态下的通透性特征。

摘要

长期以来，人们认为肾脏疾病中出现尿液大量丢失重要的大分子物质（如血清白蛋白）的现象，是由足细胞、血管内皮细胞和基底膜共同构成的通透性屏障发生改变所致。我们实验室利用活体双光子显微镜获得的数据表明，在生理条件下，肾小球滤过屏障（GFB）的通透性比以往认为的更高，滤过的白蛋白可在一组早期细胞——近端小管细胞（PTC）中被重新吸收^1,2,3。

既往研究肾小球滤过功能及滤过屏障特性的技术，涉及对近端小管起始段管腔进行微穿刺，采集管腔内液体并进行分析⁴。这些研究表明，管腔液中的白蛋白浓度几乎检测不到，与正常尿液中所观察到的水平相近。然而，利用该技术对具有确定分子大小的葡聚糖聚合物进行表征时发现，分子大小与血清白蛋白相似的葡聚糖在肾小管管腔和尿液中的含量更高，提示其通透性增加⁵。

本文详细阐述了一种用于直接可视化并定量评估肾小球荧光白蛋白通透性的 in vivo 技术。该方法可检测白蛋白穿过滤过屏障进入鲍曼氏囊（尿液滤过的起始腔室）的情况，同时还能定量近端小管对白蛋白的重吸收，并可视化后续的白蛋白转胞吞作用⁶。在通往膀胱的远端小管各段中未观察到荧光白蛋白的存在，突显了近端小管早期节段在白蛋白回收通路中的高效性。此外，当该技术被用于测定与白蛋白大小相似的葡聚糖的通透性时，报道了几乎相同的通透性数值²。这些发现直接支持有必要将多种蛋白尿性肾病的研究重点扩展至近端小管细胞重吸收功能的改变。

方案

1. 大鼠血清白蛋白与磺化罗丹明101磺酰氯（Texas Red）的偶联

1. 在50 ml锥形管中，将100 mg大鼠血清白蛋白（RSA）溶解于6.667 ml 100 mM pH 9.0的碳酸氢钠溶液中，终浓度为15 mg/ml。
2. 将溶液置于冰/水浴烧杯中，冷却至0至4 °C之间。
3. 向含有10 mg德克萨斯红磺酰氯（TRSC）的西林瓶中加入200 μl高纯度无水二甲基甲酰胺（DMF），中速涡旋振荡15秒。
4. 中速涡旋振荡RSA溶液，然后加入已溶解的TRSC。
5. 用铝箔包裹50 ml锥形管（可使用Parafilm密封以确保密闭），水平放置于仅含冰的冰桶中，并置于摇床上缓慢振荡（避免产生气泡），在0至4 °C条件下反应1小时。
6. 配制5 L 0.9%生理盐水溶液，并润湿一个分子量截留值为50 kDa的透析装置，该装置可以是：a）带夹子的透析膜，b）浮式透析器（float-a-lyzer）中的透析管，或c）滑入式透析盒（slide-a-lyzer cassette）（均适用于去除未结合的TRSC）。
7. 将反应混合物转移至透析装置中，放入盛有5 L 0.9%生理盐水溶液的容器内，在4 °C下以磁力搅拌器轻柔搅拌，透析过夜。
8. 早晨和傍晚更换5 L透析液，直至过夜孵育后透析液几乎无颜色变化（通常需要约48小时，至少更换4次）。此外，由于50 kDa的截留分子量与RSA的分子量（66 kDa）较为接近，可能始终无法获得完全澄清的溶液；这取决于透析膜孔径分布情况；60小时和5次换液已足够充分。
9. 测量终体积，用初始的100 mg质量除以体积，计算TR-RSA的近似浓度；通常浓度范围为10–13 mg/ml。最终染料与白蛋白的摩尔比应约为4:1，即每15,000道尔顿蛋白分子量含有1个荧光基团。将溶液储存于4 °C；切勿冷冻TR-RSA溶液，因为可能发生的断裂会改变其通透性测定值。

2. 成像用倒置显微镜载物台的准备 / 显微镜设置

1. 在底部带有40 mm盖玻片的50 mm培养皿内（盖玻片底培养皿），将约4–7段长度约为¾英寸的高压灭菌指示胶带完全重叠堆叠放置。胶带应靠近培养皿的一侧边缘放置，使得胶带边缘能与肾脏的曲率边缘接触，但不遮挡物镜的光路（图1A和1B）；体型较大的大鼠需要在胶带与培养皿边缘之间留出更多空间。
2. 将2个Repti-therm加热垫放置在载物台旁侧，紧邻50 mm培养皿（图1A）。在载物台上覆盖加热循环水毯。
3. 为提高图像采集效率，确保物镜转盘上配备有10倍空气物镜或20倍（空气或水浸）物镜，以及一个更高倍数的水浸物镜，用于定量图像的采集。
4. 成像过程中，向物镜加水最有效的方法是将物镜旋转至侧方，使用连接长段PE-200导管的1 mL注射器向物镜顶部加水。
5. 通过软件中的中性密度滤光片将10瓦激光器的激发强度设置为约15–20%。使用磷化镓砷化物非扫描型光电探测器时，绿色荧光信号的采集设定为750，红色荧光信号设定为625。蓝色荧光信号（如核染料Hoechst 33342）则使用标准非扫描多碱探测器，设定值在750–800之间。
6. 为确保肾小囊腔内低强度荧光信号的准确采集，需设置探测器的下限值，避免排除这些信号。若灵敏度设置过低，视觉警示标记将提示这些信号的强度值已被设为零。
7. 用1 mL注射器吸取约5–8 mg荧光标记白蛋白溶液，并用0.9%无菌生理盐水稀释至总体积为1 mL。

3. 对慕尼黑维斯塔大鼠进行活体双光子成像前的肾脏暴露

1. 使用戊巴比妥钠（50 mg/ml 溶液，120 μl/100 g 体重）、戊基巴比妥（Inactin，130 mg/ml 溶液，120 μl/100 g 体重）或异氟烷（5% 诱导，1.5 至 2.5% 维持）对大鼠进行预先麻醉，并建立静脉通路（颈静脉或股静脉），同时将左侧腹侧从肋缘下方至左大腿上方区域剃毛。
2. 将大鼠平置于右侧，使左侧剃毛侧朝上；确保其身体平直地放置于操作台上，体位伸展而非蜷缩，前肢相互接触，后肢也相互接触（图 2A）。
3. 非常轻柔地触诊以感知肾脏位置，确定其在腹膜后间隙的自然位置，并使用记号笔沿身体方向（从肋缘至大腿）画一条与之平行的直线（图 2A）。
4. 用有齿镊夹起皮肤，再用止血钳沿所画线夹捏皮肤，压碎组织以防止出血；随后使用手术剪沿夹捏处切开。在切割前压碎表层皮肤及肌肉层可显著减少甚至完全避免出血。
5. 对外层肌肉层重复上述操作，该层较薄。
6. 对于切开内层肌肉（将暴露腹膜）的操作，需再次触诊肾脏以估计其大小；夹捏的切口线应略小于肾脏尺寸，确保切口正位于肾脏上方。建议初始切口偏小，必要时再扩大；若切口过大，则需缝合。此最后一层切口至关重要：若切口位置任何方向偏移过多，将影响器官在操作台上的稳定性，可能引起呼吸所致的运动伪影（较轻情况），或牵拉肾蒂导致肾灌注不良（最严重情况）。
7. 找到肾脏（如 图 2B 所示），用镊子夹住周围脂肪组织，采用交替推进的方式逐步向肾脏下极分离。
8. 到达肾脏下极后，轻柔地将肾脏拉出切口，同时在肾脏下方轻轻挤压以协助其完全外置。若切口过小，可再次压碎肌肉层并剪开以扩大切口；重复操作直至成功外置肾脏。

4. 将慕尼黑维斯塔大鼠放置于成像台上

1. 将肾脏置于盖玻片培养皿的边缘处，使肾脏略微向大鼠背部（背侧）方向旋转，从而使肾脏的腹侧与盖玻片培养皿底部接触（图1A）。向培养皿中加入预热的无菌0.9%生理盐水溶液。
2. 通过10倍或20倍物镜观察，检查是否存在运动。若观察到运动，可将大鼠身体略微翻转，使胸腔远离盖玻片培养皿底部；确保肾脏尽可能靠近培养皿边缘，但不要牵拉肾蒂（图1B）。

5. 获取图像以定量分析白蛋白的肾通透性

1. 要计算任何大分子的肾小球通透性（肾小球滤过系数；GSC），需在输注荧光分子前，对单个肾小球拍摄参考背景图像。如果显微镜配备有可标记位置的电动载物台，可先使用低倍物镜找到并居中单个肾小球，并标记每个位置。此操作理想情况下应使用双通道荧光素/罗丹明落射荧光滤光片，但单独使用任一发射滤光片亦可（相差显微镜或其他非荧光照明方式则不可行）。在双通道滤光片下观察时，肾小球呈现为空心的圆形结构，周围被具有天然黄橙色自发荧光的近端小管所包围。
2. 若显微镜无电动载物台，则使用低倍物镜以光栅扫描方式遍历肾脏，并根据自然解剖标志（如位于肾包膜上方的大型表浅血管或脂肪斑块）粗略绘制单个肾小球的位置图。
3. 将物镜转至高倍水浸物镜，对每个肾小球采集三维数据集，确保毛细血管袢和鲍曼腔清晰可见。使用伪彩调色板（而非黑白）有助于更好地分辨这些结构。
4. 聚焦于一条表浅血管，缓慢输注荧光标记白蛋白，并留出足够时间以确保其在全身充分分布。对于GSC较低的分子，关键在于最大化血浆中的荧光强度，但不可达到使显微镜光电探测器饱和的水平，以提高滤过分子的可检测性。注意：荧光白蛋白注入后通常需5–7秒才会在屏幕上显现（以约每秒1帧的速度采集完整图像帧）。
5. 在采集用于计算白蛋白GSC的三维图像（以1 μm为间隔）前，需等待约10分钟，以便可能存在的小分子量片段清除。通常，慕尼黑Wistar大鼠的Simonsen品系表面肾小球数量较少，因此所有可观察到的肾小球均应成像并定量；而Frömter品系的肾小球数量显著更多，因此我们通常限制定量数量至约10个。
6. 实验结束时，通过过量使用实验所用麻醉剂处死大鼠，并实施双侧气胸以确保动物死亡。

6. 从三维体积计算荧光白蛋白的GSC

1. 使用 Metamorph 图像处理软件加载每个肾小球的三维数据集，包括背景数据集和注入荧光白蛋白后获得的数据集。
2. 在含有荧光白蛋白的体积图像中，定位一个浅表的毛细血管袢，并确保其明确边界与鲍曼氏囊边缘之间有足够的空隙。
3. 在背景图像体积中，找到与含白蛋白图像具有相同焦点平面的位置，该平面应包含含白蛋白图像中的所有视觉参照特征。选择毛细血管袢内感兴趣区域，并记录该区域的平均强度值；随后选择鲍曼氏腔内的一个区域，并记录其平均强度值。这些数值将用作背景值。
4. 为进行定量分析，在含白蛋白图像的鲍曼氏腔内选择相似区域。至少重复此操作两次，以获取鲍曼氏腔内平均强度的平均值。
5. 选择血浆荧光强度最亮的毛细血管袢，并在其周围绘制感兴趣区域。接着使用阈值功能突出显示循环血浆中的高亮度信号，注意避开其中呈暗条纹状的循环红细胞。记录所选血浆区域的平均强度值。优先选择血浆中较亮区域非常重要，因为血液中的某些因素会导致血浆荧光水平被低估。
6. 使用 Microsoft Excel 电子表格输入上述数值，用于计算 GSC，其中：

结果

图3展示了一张来自慕尼黑维斯塔大鼠（Munich Wistar Frömter rat）肾小球表面的图像示例，以及测定荧光白蛋白通透性的操作步骤。该肾小球所得白蛋白GSC值为0.0111，处于进食状态下此品系慕尼黑维斯塔大鼠的典型范围内³。这些图像中所呈现的稳定性，得益于对图1和图2所示操作步骤的周密规划与准确执行。如前所述，在暴露肾脏时切口位置的选择是获得无运动伪影稳定图像的最关键步骤。

...

讨论

此处强调的步骤是我们认为能够获得稳定且准确的通透性数值的操作，因为它们规避了以下陷阱：

1. 散射：使用红色发射荧光染料可更高效地收集光信号，因为长波长光子更不易发生散射。若使用绿色或蓝色发射荧光染料，则由于肾小球毛细血管袢和鲍曼氏囊腔内强度值的变异性增加，将导致肾小球滤过系数（GSC）的变异性增大³。
2. 成像深度：尽管通常会采集较深的三维数据集（总深度常在30–45微米之间），但最适宜用于确定GSC值的焦平面深度为表层10–15微米。更深的成像深度会导致灵敏度下降和变异性增加，这是由于发射光子的散射所致。然而更重要的是，在肾小球更深层处毛细血管袢更为密集，这些毛细血管袢被挤压至紧邻包围鲍曼氏囊腔的鲍曼氏囊壁边缘。这会增加意外选中覆盖在毛细血管袢周围众多足细胞之一正上方区域的可能性，从而导致GSC值被低估，因为滤过的白蛋白真实且较高的荧光强度将无法被准确检测。请参见图3中的B和D图示，注意毛细血管袢边缘与鲍曼氏囊腔边缘之间存在较大空间³。
3. 取样：在鲍曼氏囊腔内选择多个区域，有助于更准...

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
奥林巴斯Fluoview 1000共聚焦/多光子显微镜	奥林巴斯美国公司		探测器滤光片：蓝色 430/100，绿色 525/50，红色 605/90
锁模钛宝石Mai Tai激光器	光谱物理公司		可调激发波长：~750-1150 nm
砷化镓磷化物光电探测器	滨松公司		注：可提供前置或侧置安装配置。
MetaMorph图像处理软件	分子动力学公司		注：版本6.1r1
Microsoft Excel	微软公司		2007版本
操作镊子	电子显微科学公司	Cat# 78266-04
梅奥解剖剪刀	电子显微科学公司	Cat# 72962
CA显微剪刀型号1C300	电子显微科学公司	Cat# 78180-1C3
凯利止血钳（直型）	电子显微科学公司	Cat# 72930
水循环毯式加热垫	Gaymar公司		T/Pump PN 11184-000 毯子-66N111CC
爬行动物用罐底加热器Repti-Therm	ZooMed公司		RH-4
德克萨斯红磺酰氯	英杰公司/分子探针	Cat# T-353
大鼠血清白蛋白	西格玛-奥德里奇公司	Cat# A-6272
高质量无水DMF	西格玛-奥德里奇公司	Cat# 270547
Strate-Line高压灭菌指示胶带	费希尔科技公司	Cat# 11-889-1
Willco-dish盖玻片底培养皿（50 mm/40 mm盖玻片）	电子显微科学公司	Cat# 70665-07