关联捕食风险、植食动物生理应激与植物凋落物的微生物分解

摘要

我们介绍了评估捕食风险如何通过诱导食草动物改变饮食以满足 heightened stress 状态下的需求，从而改变其化学品质，以及这些处于胁迫状态的食草动物尸体的分解如何减缓土壤微生物对后续植物凋落物分解的方法。

摘要

进入土壤的碎屑数量和质量决定了微生物群落的分解速率以及氮（N）和碳（C）固定的循环速率^1,2。植物凋落物构成了碎屑的主体³，因此通常认为动物生物量输入（如食草动物和食肉动物）对分解过程的影响甚微^4,5。然而，食肉动物可能通过一系列相互作用影响植物凋落物的微生物分解过程，即捕食风险改变其食草类猎物的生理状态，而当这些食草动物尸体被分解时，进一步改变土壤微生物的功能⁶。食草动物对捕食风险产生的生理应激反应会改变其生物量中的碳氮元素组成^7,8,9，因为在养分受限的系统中，捕食压力导致食草动物基础能量需求上升，迫使其将资源摄取从支持生长和繁殖的富氮资源转向支持代谢增强的富碳碳水化合物资源⁶。食草动物储存过量营养物质的能力有限，因此在增加碳水化合物碳摄入的同时会排出氮⁷。最终，遭受捕食压力的猎物体内碳氮比升高^7,10，因其可利用的活性氮较少，不利于微生物酶的合成，从而成为土壤微生物群落质量较低的资源⁶。因此，受应激的食草动物尸体分解后会对微生物群落功能产生启动效应，降低微生物后续分解植物凋落物的能力^6,10,11。

我们介绍了评估捕食风险与土壤微生物对凋落物分解作用之间关联的方法。本文描述了如何：由捕食风险诱导植食动物产生应激反应；测量这些应激反应；以及测量其对微生物分解过程的影响。我们以一个模式草地生态系统为例，该系统包括捕食性蜘蛛（Pisuarina mira）、一种优势蝗虫植食者（Melanoplus femurrubrum）以及多种禾草和非禾草植物⁹。

方案

1. 在胁迫与非胁迫条件下饲养蝗虫

1. 使用0.5 m²的圆形封闭式中宇宙系统，以防止动物物种的迁出或迁入（图1）。采用2.4 m长、1.5 m高、¼英寸孔径的铝制网栅作为支架构建中宇宙系统。用2.5 m长、1.75 m高的铝制窗纱覆盖网栅，将窗纱在网栅顶部和底部折叠后用订书钉固定。将网栅两端连接形成闭合圆圈，并将重叠的窗纱部分用订书钉钉合，形成密封。在野外通过挖掘深10 cm、宽4 cm的环形沟槽，将中宇宙系统底部埋入土中，然后将沟槽周围的草皮压实，固定沉入部分的中宇宙系统。将一块圆形窗纱用订书钉固定在中宇宙系统的顶部。
2. 在野外采用重复配对实验设计布置中宇宙系统。应选择与植物物种组成及植物相对盖度相匹配的样地位置。将围栏 cages 向下埋入土壤10 cm深。
3. 使用扫网采集早期（2^nd龄）蝗虫若虫，并以自然野外密度将其放入中宇宙系统中。
4. 使用扫网捕获一种优势的“伏击型”捕食性蜘蛛（非结网型）个体。使用快干胶将蜘蛛的螯肢（用于制服猎物的口器）粘合封闭，以分离风险效应与实际存活选择之间的关系，避免因个体蝗虫逃避蜘蛛捕食能力差异而产生的选择偏差。将蜘蛛以野外自然密度放入每对中宇宙系统中的其中一个。该组为胁迫处理组；未放入蜘蛛的中宇宙系统则为无胁迫处理组。
5. 让蝗虫若虫发育至后期（4^th和5^th龄）阶段。从围栏中收集所有个体，并从每个围栏中随机分配个体至以下三个后续测定组之一：（1）生理胁迫状态验证；（2）个体体元元素化学计量比变化验证；（3）微生物分解实验。

2. 验证蝗虫的应激状态

1. 在气流速率为 200 ml/min 的通气式呼吸测量系统中测定蝗虫的标准代谢率（SMR），即二氧化碳排放速率（）。通过将流动空气经过干燥剂以去除水蒸气。
2. 在禁食 16 小时后（期间应提供水），称量单个蝗虫（±0.1 mg），将其放入透明的 50 ml（9.2 cm 长 × 2.0 cm 直径）呼吸室中，并使其从操作干扰中恢复至少 10 分钟，然后开始测量。
3. 在呼吸室内保持恒定的平均环境温度（温度波动 ±1% 标准误差）条件下，使用红外 CO₂ 分析仪（例如 Qubit S151-1，分辨率为 1 ppm）分析呼出空气。测量 10 分钟内的平均最小稳态 。
4. 分析仪提供的是 CO₂ 的分数浓度（百万分之一），但 SMR 应以速率形式报告，因此必须将记录数据转换为 ，其中 ，在草食动物中假设 RQ 等于 0.85。

3. 验证生物体元素化学计量比的变化

1. 测定从野外中型生态系统中采集的蝗虫样品的碳氮比（C:N）含量。
2. 在解剖显微镜下移除蝗虫肠道内容物，以减少因近期摄食造成的碳氮比（C:N）差异。
3. 将去除肠道后的残体和身体部分冷冻干燥48小时，然后将每个个体的尸体和肠道研磨成均一粉末。
4. 使用碳氮氢自动分析仪（CNH autoanalyzer）测定粉末中的碳氮比（C:N）含量。

4. 微生物分解

1. 在野外试验地点放置多组重复的聚氯乙烯（PVC）环（直径15.4 cm，插入土壤约4 cm）图3C）。通过在土壤表面剪除的方式清除其中所有植被。这些环状样地用于分解作用的测定。此外，在整个样地范围内设置一组PVC环状样地，用作 ¹³C 自然丰度对照（见下文），不添加蝗虫或草屑。
2. 在每对套管中的一个套管内，加入2只完整的、冻干的蝗虫尸体（记录加入的生物量），这些蝗虫按照上述方法利用田间围栏在有捕食风险条件下饲养获得；在每对套管中的另一个套管内，加入2只同样完整但冻干的蝗虫尸体，这些蝗虫在无捕食风险条件下饲养获得。
3. 用筛网覆盖PVC套环，以防止食腐动物将蝗虫从样地移走，并让蝗虫尸体分解40天。
4. 在尸体分解过程中，对草屑进行标记 ¹³C.
   1. 构建一个透明的亚克力腔室（60 cm × 60 cm × 1.5 m），并配备进气口和出气口阀门图3B).
   2. 将一个 60 cm × 60 cm 的木制方形框架下沉至地下 5 cm，框架底部附有涂覆硅脂的橡胶密封圈图3B).
   3. 将腔室滑至木架顶部，使腔室被橡胶密封图3B).
   4. 将腔室入口连接至装有99原子%高纯气体的压缩气瓶 ¹³CO_2. 腔室内的植物将被标记 ¹³C，其中CO₂ 浓度保持在环境水平（因为提高浓度会改变植物的碳分配）。通过仅脉冲式加入标记的CO₂来维持环境水平₂ 在短时间内进行。同时监测培养室温度，若温度达到环境温度以上5 °C，则移除培养室。
   5. 标记一周后，比较 δ¹³使用Thermo DeltaPlus同位素比值质谱仪（Thermo，San Jose，CA，USA）测定从相同草种的随机样本中采集的天然丰度草屑样品的碳同位素组成。
5. 40天后，加入10 g风干的 ¹³将C标记的草屑添加到先前已加入蝗虫尸体的每个环中。
6. 监测草本凋落物的矿化速率 原位 75天内通过封闭每个环并同时监测总土壤呼吸和土壤呼吸的 ¹³CO₂采用流通式腔室法，利用腔衰荡光谱技术（CRDS；Picarro 公司，美国加利福尼亚州圣克拉拉；型号：G1101-i），对每个环状采样室释放的气体样品进行实时监测，每份样品连续监测 8 分钟。CRDS 技术可同时追踪测定气体总量和 δ¹³土壤呼吸的C
7. 估算的贡献 ¹³利用同位素混合方程测定C标记的草地凋落物对土壤总呼吸的贡献。草地凋落物来源的CO₂量₂ 计算公式如下：C_{草源凋落物衍生的} = C_总计 × (δ¹³C_呼吸作用- δ¹³C_自然异常.)/ (δ¹³C_{草-凋落物}- δ¹³C_nat.abn），其中 C_总计 是在给定测量期间呼吸释放的碳总量，δ¹³C_呼吸作用 是 δ¹³添加标记草本凋落物的环中呼吸碳的碳同位素比值，δ¹³C_{神经解剖学异常}. 是平均 δ¹³三个自然丰度培养管中呼吸作用产生的碳的碳同位素组成（C of respired C）即 未添加凋落物的处理组）以及δ¹³C_草屑 是 δ¹³添加到环中的草屑的碳含量。
8. 使用手持式探针在实验区域内同步监测土壤温度和土壤水分，以校正因温度和水分差异导致的土壤呼吸变化。
9. 尽管该腔衰荡光谱仪（Picarro Inc.，Santa Clara, CA, USA；型号：G1101-i）设计用于野外作业，但其读数对移动敏感。因此，应在所有设置有PVC环的样地中央建立一个基准测量站，并使用PVC管将仪器与各环连接。

结果

在应激和无应激条件下蝗虫标准代谢率的一个示例图谱如图所示 图2由于不同个体蝗虫的体重存在差异，且代谢率随体重变化而变化，因此图表应呈现代谢率与蝗虫体重之间的关系。不同处理组的趋势平行表明，代谢率以标准代谢率的恒定倍数上升。即 所有应激个体中均不存在体重与代谢率的交互作用。

在风险和无风险条件下，蚱蜢体内碳（C）和氮（N）元素含量如表1所示。值得注意的是，不同处理组之间个体体内的碳氮比差异极小（4%）。然而，这些微小差异可能在土壤微生物群对草本凋落物的分解过程中转化为显著差异（图3）。

将禾草凋落物添加到先前接种了受胁迫或未受胁迫蝗虫的PVC环中，会导致不同程度的凋落物分解，这反映在由微生物呼吸作用引起的土壤累积CO₂释放曲线中（图3）。实验应持续监测至累积曲线开始趋于饱和。

	胁迫	无胁迫
碳 (%)	48.44±0.32	44.73±0.46
氮 (%)	12.11±0.08	11.62±0.12
碳:氮	4.00±0.03	3.85±0.04

表1. 蝗虫植食性尸体在面临捕食风险（胁迫）和无捕食风险（无胁迫）条件下化学成分的比较。数值为平均值 ± 1 个标准误。

图1. 实验中所用野外中宇宙装置的设计示意图，以及评估胁迫效应对凋落物分解影响的整体实验方案。

图 2. 植食性动物标准代谢率与植食性动物体重关系的图示。数据根据实验处理分为两类：来自包含捕食者的中型生态系统（捕食）以诱导应激，以及不包含捕食者的中型生态系统（对照），因而无应激诱导。数据来自 D. Halwena 和 O.J. Schmitz 2010 年未发表的研究。

图3. 曲线描述了微生物群落在分解实验性草本凋落物输入过程中累积释放的CO₂量。图中数值为平均值±1个标准误。该图表明，接种受胁迫蝗虫尸体（捕食者处理）的土壤，其植物凋落物的分解速率比接种无胁迫蝗虫尸体（对照）的土壤低19%（ANOVA F_1,6 = 9.06，P < 0.05）。插图为野外使用的PVC环装置。本图引自Hawlena 等⁶ 点击此处查看高清大图。

讨论

本文所介绍的方法流程可系统地测量地上食物网中物种所受胁迫如何启动土壤微生物群落，进而导致植物凋落物后续分解过程的改变。这些方法非常适合研究由节肢动物消费者和草本植物组成的生态系统，因为完整的食物网可以在空间上被明确界定并容纳于中型实验系统（mesocosms）中。

由于背景土壤湿度、土壤温度、植物养分含量等因素的梯度变化，可能存在空间异质性。etc. 研究设计允许将微宇宙和PVC环沿空间环境梯度分块排列，从而在分析效应时能够考虑此类环境变异。

尽管该仪器设计用于野外使用，但腔衰荡光谱仪（Picarro 公司，美国加利福尼亚州圣克拉拉；型号：G1101-i）的读数对移动较为敏感。因此，应在所有设置有PVC套管的样地中央建立一个基准测量站，并使用PVC管将仪器与各套管连接。

土壤凋落物分解的传统测定方法是将已知量的凋落物封入玻璃纤维网袋中，将网袋放置于田间土壤表面，并定期重新测量网袋以量化凋落物的消失速率（即分解速率）。该方法的局限性在于无法追踪已分解物质的去向，也无法区分添加的凋落物所贡献的土壤改良剂CO₂矿化量与背景土壤自身CO₂矿化量。本文介绍的使用标记CO₂的示踪方法有助于克服这一技术限制。

生态系统生态学与生物地球化学长期遵循一种工作范式，即由于未被取食的植物凋落物构成了碎屑的主体，地上食物网中较高营养级生物（如植食性动物本身）的生物量输入对地下生态系统过程的影响微乎其微⁶。然而，越来越多的证据表明，生态系统中较高营养级的物种可能对地下过程产生深远影响^1,4,5。本文所介绍的方法有助于更准确地量化较高营养级生物对生态系统养分循环的贡献，这种贡献既可直接通过尸体沉积（例如 ^{12, 13}）、排泄和排遗（例如 ^{14, 15}）带来的生物量输入实现，也可间接通过改变植物群落组成（例如 ⁹）产生影响。此类量化研究有助于揭示动物如何调控生态系统动态的机制，从而推动对当前关于生物调控生态系统功能的工作范式的完善与修订。

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
腔衰荡光谱仪	Picarro Inc., Santa Clara, CA, USA	型号 # G1101-i
CO2呼吸测定仪	Qubit Systems, Kingston, ON, Canada	型号 # S151
13C	Sigma-Aldrich	372382
分光光度计	Thermo, San Jose CA, USA	型号: Delta V Plus 同位素比值质谱分光光度计