本文描述了一种定量评估秀丽隐杆线虫（Caenorhabditis elegans）趋化反应的方法。采用趋化指数（CI）来精确评价线虫对特定目标的反应，并作为不同品系和感兴趣化合物之间比较的平台。
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本文内容
摘要
摘要
许多生物利用趋化性来寻找食物来源、避开有害物质以及寻找配偶。Caenorhabditis elegans 具有显著的趋化行为。
测试线虫对气味分子反应的基本原理是将线虫放置在一个区域内，观察其在气味分子刺激下产生的运动行为。尽管已有多种可用的检测方法，但在优化线虫起始位置相对于对照区和测试区的分布、尽量减少线虫之间的相互干扰，同时保持足够大的样本量方面，仍处于持续改进之中1-10。本文所述方法旨在通过改进Bargmann et al.1 所建立的检测方法来解决这些问题。实验使用一个培养皿，将其划分为四个象限，其中两个相对的象限标记为“测试区”（Test），另外两个则指定为“对照区”（Control）。在所有测试区和对照区均加入麻醉剂。将线虫放置在培养皿中央，并在原点周围标记一个圆形区域，以确保不活动的线虫被排除在分析之外。采用四象限系统而非单区2或双区1设计，可消除线虫运动方向上的偏倚，因为无论线虫从原点的哪一侧出发，其到测试样本和对照样本的距离均相等。这种方法避免了线虫为响应气味分子而必须穿过其他线虫聚集区域的问题，此类情况可能延缓线虫移动或迫使其采取更迂回的路径，从而导致对其预期运动轨迹的错误解读。此外，该方法在实际操作中也具有优势，能够容纳更大的样本量，并允许研究人员在设定时间结束后再进行无人值守的实验结果评分。
引言
Ward 于 1973 年首次开发了趋化性实验方法5，自此以来，该方法已获得广泛的应用。神经生物学是受益于多种趋化性实验方法的领域之一。C. elegans 利用趋化性实验已证明存在嗅觉适应现象，这是一种简单的学习与记忆形式6。这些实验还被用于证明 C. elegans 能够产生乙醇耐受性——这一结果不仅表明了线虫具有行为可塑性，也说明线虫在人类酒精依赖研究中具有重要价值3。研究人员甚至开发出相关实验，通过显示线虫在化学吸引物与食物（OP50）之间建立关联的能力，证明 C. elegans 具备储存短期和长期记忆的功能7。此外，鉴于目前已有大量关于 C. elegans 基因组的详细信息，研究人员已多次通过诱导突变来改变 C. elegans 的趋化行为1,8。这为许多令人兴奋的工程应用提供了可能，例如将 C. elegans 开发为生物修复工具。因此，自 1973 年趋化性实验方法首次建立以来，该技术已被反复改进，并广泛应用于多个学科中以揭示各种科学难题。
某些实验旨在揭示蠕虫趋向目标所采取的特定路径。这类实验的原型由 Ward 5 建立。将三条蠕虫放置在熔化的琼脂表面，持续 15 分钟。通过它们在培养皿边缘向中心引诱物梯度移动时留下的痕迹，追踪其运动轨迹。每次实验结束时，使用氯仿将培养皿中所有蠕虫固定。该方法的一种衍生形式是将单个蠕虫置于培养皿中央，引诱物和对照物分别位于距起点相等且相对的位置 2。
Pierce-Shimomura 等 开发了一种实验方法，用于观察趋化性过程中运动的精确特征9。将单个线虫置于直径为 9 cm 的培养皿中，培养皿内含有均匀浓度的吸引剂或呈放射状梯度分布的吸引剂，梯度最终指向吸引剂的源头。使用能够识别线虫的计算机软件程序记录所观察到的行为。与显微镜相连的摄像机与载物台协同工作，在实验进行过程中自动调节培养皿的位置，以确保线虫始终处于视野范围内。通过该方法，研究人员进一步揭示了秀丽隐杆线虫（C. elegans）表现出翻转行为的原因。
其他检测方法与本文所述方法更为相似，用于测试大量线虫群体对测试化合物的反应。双象限趋化性检测已被用于探究当秀丽隐杆线虫（C. elegans）暴露于不同化合物时，各类神经元、受体及信号转导分子所发挥的作用1。将20至50条经洗涤的线虫置于培养皿中心附近，培养皿两端分别放置引诱剂和对照物，并加入麻醉剂叠氮化钠（NaN3）。60分钟后，根据附着在引诱剂与对照物上的线虫数量之差，计算出介于-1.0到+1.0之间的趋化指数。本文报道的检测方法也采用了类似的趋化指数，但早期方法未能严格评估非运动状态的线虫。此后，该检测方法进一步被应用于研究神经元消融对趋化性的影响。
另一种上述检测方法的变体实验如下进行：将100–200条线虫放置在含有四个象限的培养皿中央3，相邻的象限中分别含有待测物质或对照物质。与之前的检测方法相同，在计数前通过叠氮化钠的作用使线虫 immobilized（固定）。本文描述了一种类似的方法，用于评估秀丽隐杆线虫（C. elegans）对不同化合物的反应。然而，以下所述方法具有额外优势，即仅评估那些已越过设定距离阈值、从而可明确区分活动与非活动状态的线虫。
其他实验已纳入类似的准则，即忽略不移动的线虫。Frøkjær-Jensen 等 开发了一种多功能实验方法，可用于检测挥发性和水溶性化合物10。将一个培养皿分为四个象限，上部和下部象限不含溶剂，左侧象限含有水，右侧象限含有引诱剂。在测试挥发性气味物质时，待测物被放置在培养皿盖子上对应象限的上方，而水溶性化合物则直接置于琼脂上。
目前用于评估秀丽隐杆线虫（C. elegans）趋化反应的方法正在不断改进，以优化其易用性、效率和准确性。因此，尽管本文所述的检测方法能够评估最多数量的线虫（最高通量：每小时每板250条线虫，略高于Lee et al.3所展示的通量）；该方法真正的优势在于简洁地综合了先前多种检测方法的优点（表1）。
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方案
1. 线虫的制备/清洗
- 将线虫同步至年轻成虫阶段11。
- 用移液器将 2 ml S 基本溶液滴加到一个 5 cm 化学趋向性平板上，该平板中含有已完全清除 OP50 E. coli 菌苔的同步化线虫。根据需要倾斜平板，确保线虫从平板表面被冲洗进入缓冲液中。
- 将 1 ml 含线虫的 S 基本溶液转移至微量离心管中。
- 使用 PicoFuge 以 6,600 rpm 离心 10 秒。
- 吸除 S 基本溶液，注意不要扰动管底的线虫沉淀。
- 向微量离心管中加入 1 ml S 基本溶液，轻轻颠倒数次以洗涤线虫。
- 重复步骤 1.4 至 1.6 共三次。
- 第五次离心 10 秒，此次吸除上清液，保留终体积约为 100 μl。
- 取 2 μl 线虫悬液滴加至 NGM 平板上，确认每 2 μl 样品中含 50 至 250 条线虫。根据需要，通过将线虫重悬于更小或更大的 S 基本溶液体积中，调整线虫浓度。
- 线虫洗涤后应立即用于实验，最迟不超过 1 小时。
2. 准备测试平板
- 在5 cm培养皿的底部做标记，将培养皿均分为四个象限。可使用趋化性琼脂或NGM培养基。每种待测遗传品系至少需要进行三次重复实验。
- 以原点为中心，标记一个半径为0.5 cm的圆（图1）。
- 在每个象限内标记一个点，分别用“T”表示“测试”（Test），或用“C”表示“对照”（Control），确保各点到原点的距离相等，且彼此之间的距离也相等。各点必须距离原点至少2 cm。将左上和右下象限标记为测试象限，右上和左下象限标记为对照象限（图1）。
3. 运行检测
- 通过将测试化合物与等体积的0.5 M叠氮化物（一种用于在蠕虫到达象限时使其停止活动的麻醉剂）混合，制备测试溶液。通过将稀释测试化合物所用的溶剂与等体积的0.5 M叠氮化物混合，制备对照溶液。
- 从沉淀中吸取2 μl蠕虫溶液（按1.8步骤制备），滴加至原点位置（两条线的交点处）。
- 紧接着，分别向两个“T”位点各加入2 μl测试溶液；同样，向两个“C”位点各加入等量的对照溶液。
- 待蠕虫液滴和气味物质液滴被琼脂完全吸收后，盖上盖子并将培养皿倒置。
- 60分钟后，将培养皿放入4 °C冰箱中孵育。仅在需要计数时才将培养皿从冰箱中取出。若长时间置于室温下，蠕虫可能重新恢复活动。
- 记录完全穿过内圈进入每个象限的蠕虫数量。
- 重复步骤3.2至3.6，但在测试象限和对照象限均使用对照溶液，以此作为对照组培养皿。应制备并运行三个此类对照培养皿，以获得适当的对照结果。
4. 分析评分/确定趋化指数
- 使用公式 1 计算趋化指数。这将得到一个介于 -1.0 和 +1.0 之间的趋化指数。
（1）
趋化指数 = （位于两个测试象限中的线虫数量 - 位于两个对照象限中的线虫数量）/（记录的线虫总数）
+1.0 分表示对目标物质的最大趋化性，代表有 100% 的线虫移动至含有化学目标物的象限。-1.0 的指数则表明最大排斥性。类似的方法已被用于相关检测3（表 1）。
- 报告趋化指数（CI）的平均值及平均值的标准误（SEM）。对实验组与对照组平板的数据进行学生t检验。
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结果
比较野生型（N2）C. elegans 与 odr-10(ky10) 突变体。
我们使用已知的 C. elegans 化学引诱剂二乙酰，比较野生型线虫与缺乏二乙酰受体的突变体线虫的行为反应1,12。对于野生型（N2）线虫，其对乙醇的趋化指数为 0.100±0.066，对 0.5% 二乙酰的趋化指数为 0.839±0.031。正如预期，二乙酰对野生型线虫引发显著的趋化吸引反应（P<0.003）。相比之下，缺乏二乙酰受体的odr-10(ky10)突变体，其对二乙酰的趋化指数与对照组相比无显著差异（图 3）。
| 作者 | 每板线虫数量 | 持续时间（分钟） | 1小时通量（最大线虫... |
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讨论
趋化性虽然受一系列复杂的神经和细胞机制调控，但可通过趋化性实验进行简便且客观的定量分析。为了获得最佳实验结果，必须注意若干关键步骤。首先，线虫的发育阶段必须保持一致，这是获得可重复实验结果的关键。不同发育阶段的线虫行为存在差异13；因此，混合阶段的线虫可能使实验结果产生偏差。其次，必须彻底清洗线虫表面的全部E. coli，因为残留的细菌可能干扰实验结果。还需注意，麻醉剂叠氮化钠（0.5–1 M）会使距离其施加位置1 cm范围内的线虫停止运动。因此，叠氮化钠的施加位置必须距离原点至少2 cm。若其施加位置距原点1.5 cm或更近，线虫将在内圈内被麻痹，导致无法计数。叠氮化钠放置得越远，线虫便能向象限区域移动得越远。实验过程中，培养皿应始终保持水平，以确保各次实验之间的一致性，并避免重力偏差对结果造成干扰。此外，每次实验使用的线虫数量不应超过250只。密度过高可能因多种原因阻碍线虫的正常移动。我们发现，聚集的线虫倾向于停留在原处，而不向象限区域迁移。最后，在实验进行60分钟后将培养皿置于4 °C环境中，可使线虫停止移动，便于研究人员在计数前保持培养皿状态不变。培养皿可在4 °C条件下保存数天后再进行计...
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披露
我们没有需要披露的内容。
致谢
感谢女王大学生命科学学院及文理学院为本研究提供资金支持。同时，感谢Chin-Sang实验室提供必要的试剂、设备和技术支持。此外，感谢QGEM 2011团队，特别是Tony He在讨论中的贡献。
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| S 基础培养基（不含胆固醇）[5.8 g NaCl；1 M K 磷酸盐缓冲液，pH 6.0；加 dH2O 至 1 升] 高压灭菌 | |||
| PicoFuge | Stratagene | 400552 | |
| 显微镜 | Leica | ||
| 解剖显微镜 | Leica | ||
| P1000 移液器 | Gilson | ||
| P10 移液器 | Gilson | ||
| 0.5 M 叠氮化钠 | |||
| 趋化性琼脂 [1.6% BBL-琼脂（Benton-Dickinson）或 2% Difco-琼脂。高压灭菌。加入 5 mM 磷酸钾，pH 6.0；1 mM CaCl2，1 mM MgSO4] | |||
| 乙醇/蒸馏水 | |||
| 测试化合物（例如 0.5% 丁二酮） | |||
| 琼脂 | Bio-Rad | 166-0600 | |
| NH4Cl | Amresco | CA97062-046 | |
| MOPS | VWR | CA12001-120 | |
| NH4OH | BDH | CABDH8641-2 | |
| 0.25% Tween 20 | Bio-Rad | 170-6531 |
参考文献
- Bargmann, C. I., Hartwieg, E., Horvitz, H. R. Odorant-selective genes and neurons mediate olfaction in C. elegans. Cell. 74, 515-527 (1993).
- Bargmann, C. I., Horvitz, H. R. Chemosensory neurons with overlapping functions direct chemotaxis to multiple chemicals in C. elegans. Neuron. 7, 729-742 (1991).
- Lee, J., Jee, C., McIntire, S. L. Ethanol preference in C. elegans. Genes Brain Behav. 8, 578-585 (2009).
- Swierczek, N. A., Giles, A. C., Rankin, C. H., Kerr, R. A. High-throughput behavioral analysis in C. elegans. Nat. Methods. 8, 592-598 (2011).
- Ward, S. Chemotaxis by the nematode Caenorhabditis elegans: identification of attractants and analysis of the response by use of mutants. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 70, 817-821 (1973).
- Colbert, H. A., Bargmann, C. I. Odorant-specific adaptation pathways generate olfactory plasticity in C. elegans. Neuron. 14, 803-812 (1995).
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- Troemel, E. R., Kimmel, B. E., Bargmann, C. I. Reprogramming chemotaxis responses: sensory neurons define olfactory preferences in C. elegans. Cell. 91, 161-169 (1997).
- Pierce-Shimomura, J. T., Morse, T. M., Lockery, S. R. The fundamental role of pirouettes in Caenorhabditis elegans chemotaxis. J Neurosci. 19, 9557-9569 (1999).
- Frokjaer-Jensen, C., Ailion, M., Lockery, S. R. Ammonium-acetate is sensed by gustatory and olfactory neurons in Caenorhabditis elegans. PLoS One. 3, e2467(2008).
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- Hart, A. C. Behavior. WormBook. , (1895).
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