介绍了利用超支化聚甘油（HPG）对红细胞（RBCs）细胞膜进行修饰的方法。通过水相两相分配、渗透脆性试验和补体介导的溶血试验对修饰后的红细胞进行了表征。采用流式细胞术和微分型系统（MTS）血型分型卡评估了表面蛋白和抗原的伪装效果。
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摘要
摘要
红细胞（RBC）输注对于治疗多种急性和慢性疾病至关重要，例如重型地中海贫血和镰状细胞贫血1-3。由于红细胞表面存在大量抗原（目前已知约308种抗原4），接受长期输血治疗的患者会因输入红细胞上次要抗原的不匹配而产生同种异体抗体4, 5。在红细胞膜上接枝亲水性聚合物（如聚乙二醇（PEG）和超支化聚甘油（HPG））可形成一种排斥层，阻止抗体与细胞表面抗原结合，同时不影响氧气、葡萄糖和离子等小分子的通透3。目前尚无生成通用型红细胞供体细胞的有效方法，部分原因在于红细胞表面存在大量抗原（基于蛋白质和碳水化合物），开发此类方法将显著提高输血安全性，并极大改善红细胞的可及性与使用效率。本报告介绍了通过在红细胞膜上接枝HPG以制备抗原保护型功能性红细胞及其表征所采用的实验方法。HPG是一类高度生物相容性的紧凑型聚合物6, 7，预计可定位于包围脂质膜的细胞糖萼内，并有效遮蔽红细胞表面抗原8, 910, 11。
方案
A. 超支化聚甘油修饰（SS-HPG）
- 将60 kDa的冻干HPG（0.5 g，0.0083 mmol）置于圆底烧瓶中，在90 °C下真空干燥过夜。
- 将烧瓶冷却至室温，用无水吡啶（3 ml）溶解干燥的HPG。
- 为在HPG上约八个羟基位点引入羧基官能团，向HPG溶液中加入催化量的二甲基氨基吡啶（一滴浓度为5 mg/ml的吡啶溶液）。随后，在10分钟内逐滴加入溶于0.5 ml吡啶的丁二酸酐（0.0067 g，0.0664 mmol）。在氩气保护下室温搅拌过夜。
- 将反应混合物倒入40 ml预冷的丙酮（4 °C）中，在50 ml离心管中沉淀，并使用Beckman J2-MC离心机在27,000 × g下离心15分钟。倾去上清液，并在室温下用氩气吹扫去除残留丙酮。
- 为将羧基活化为琥珀酰亚胺基丁二酸酯（SS）基团，将羧基功能化的HPG溶于3 ml无水DMF中。向该HPG溶液中加入N-羟基琥珀酰亚胺（0.0077 g，0.0664 mmol）和N,N'-二异丙基碳二亚胺（0.0084 g，0.0664 mmol），在氩气保护下室温搅拌过夜。
- 通过在冷丙酮中沉淀纯化SS-HPG。
- 用氩气吹扫去除残留丙酮。
- 通过质子（1H）核磁共振（NMR）分析测定修饰后HPG的纯度以及羧基和SS基团的取代程度。
B. 全血采集与红细胞（RBCs）分离
- 从已签署知情同意书的健康人类献血者中采集全血（40% 血细胞比容，3 ml），并收集至柠檬酸盐真空采血管中。
- 以 1,000 × g 离心 4 分钟。
- 使用巴斯德移液管移除含有血浆和血小板的上清液，以及含有白细胞和血小板的中间白膜层。
- 将压积红细胞（80% 血细胞比容，1.2 ml）转移至 12 ml Falcon 离心管中，并加入 PBS 缓冲液（8 ml，pH = 8.0）洗涤红细胞。
- 通过倒置混匀红细胞，以获得均匀的细胞分布。
- 以 1,000 × g 离心 4 分钟，并移除上清液。
- 通过重复步骤 5 和 6，再用 PBS 洗涤红细胞两次。
- 取压积红细胞（100 μl）置于 1.6 ml Eppendorf 管中，加入 PBS 缓冲液（300 μl，pH = 8.0），制备成 20% 血细胞比容的红细胞悬液。
C. HPG 接枝到红细胞上
- 在步骤A6中，HPG修饰物于丙酮中沉淀后立即取出SS-HPG（150 mg），置于玻璃小瓶（1 dram）中，并加入PBS缓冲液（300 μl，pH = 8.0）溶解。
- 将SS-HPG聚合物溶液加入20%压积红细胞（Hematocrit）的洗涤红细胞中，使终体积为400 μl，SS-HPG终浓度范围为0.5 mM至3 mM。例如，制备含0.5 mM SS-HPG处理的红细胞时，从洗涤红细胞中移除36 μl PBS，并加入36 μl SS-HPG聚合物溶液。
- 轻轻涡旋混匀悬浮液，将Eppendorf管置于室温下轨道摇床上震荡1小时。
- 在1,000 × g条件下离心4分钟，用移液器吸除上清液。
- 加入1 ml PBS洗涤红细胞，离心后弃去上清液。
- 加入1 ml生理盐水，重复步骤5的操作，洗涤红细胞两次。
- 向100 μl压积红细胞（80% Hematocrit）中加入300 μl生理盐水，使终浓度为20% Hematocrit。
D. HPG 修饰红细胞的表征
一、补体介导的裂解
- 将约 8 ml 全血采集至 BD 真空采血管玻璃血清管中，室温静置 30 分钟，使血液凝固。
- 以 2,000 × g 离心 10 分钟，收集约 3 ml 血清。
- 取 1 ml 血清置于 60 °C 水浴中 30 分钟，制备热灭活血清。
- 将 60 μl 新鲜血清或热灭活血清加入含有 60 μl 20% 红细胞压积的 HPG 修饰红细胞或未修饰红细胞的离心管中。
- 在 37 °C 孵育红细胞 1 小时。
- 为定量细胞悬液中的血红蛋白含量，将 5.9 μl 20% 红细胞压积的 HPG 修饰红细胞或未修饰细胞三份加入 96 孔板中。每孔加入 294 μl 沙比氏试剂（用于分光光度法定量血红蛋白的试剂）。通过反复吹打使细胞与沙比氏试剂充分混匀。使用 SPECTRA MAX 190 酶标仪在 540 nm 处测定血红蛋白氰化衍生物的吸光度。
- 为定量上清液中的血红蛋白含量，将细胞以 13,000 × g 离心 1 分钟。取 50 μl 上清液三份加入 96 孔板中，每孔加入 250 μl 沙比氏试剂。通过反复吹打使上清液与沙比氏试剂混匀。使用 SPECTRA MAX 190 酶标仪在 540 nm 处测定血红蛋白氰化衍生物的吸光度。
- 根据上清液中血红蛋白含量（步骤 7）与样品总血红蛋白含量（步骤 6）的比值，计算溶血细胞的比例8, 11, 12。
二、使用 MTS 卡片对主要和次要抗原进行伪装
- 取50 μl HPG修饰的红细胞（10% 红细胞压积）置于EP管中，以1,000 × g离心1分钟，弃去上清液。
- 向细胞沉淀中加入110 μl MTS稀释液，通过反复吹打混匀细胞悬液。
- 向每根微型凝胶柱中加入11 μl细胞悬液。加样时避免接触凝胶。
- 将MTS卡放入离心机卡架中，以156 × g离心6分钟。
- 根据生产商说明书，通过微型凝胶柱中红细胞的位置判断表面抗原的保护情况。
三、双水相分配测定
- 根据文献13制备由（5% 葡聚糖500k、4% 聚乙二醇8K、150 mM 氯化钠、10 mM 磷酸盐）组成的葡聚糖500 kDa/聚乙二醇8 kDa双相分离系统。
- 在室温下以433 × g离心10分钟，获得双相系统（葡聚糖位于下层）。
- 小心分离两相。
- 将1.0 ml上层聚乙二醇相分装至标记好的带凹底试管中，加入20 μl 20%压积的HPG修饰红细胞，并通过轻弹管壁温和混匀细胞。
- 将含细胞的上层相0.5 ml加入0.5 ml下层相中，并通过轻弹管壁温和混匀整个系统。
- 将试管置于实验台上静置约2分钟，待系统分相后，确定细胞在系统中的位置。红细胞的定位（位于上层聚乙二醇相、下层葡聚糖相或两相中）取决于HPG修饰程度及其分子量。
四、渗透脆性测定
- 配制浓度范围为 0 至 0.9 (w/v) % 的 NaCl 溶液。
- 将 0.4 ml NaCl 溶液加入 1.5 ml Eppendorf 管中。
- 向 NaCl 溶液中加入 20 μl 红细胞（20% 红细胞压积）。
- 轻轻颠倒混匀细胞，并将样品置于 37 °C 水浴中孵育 30 分钟。
- 轻轻颠倒重悬细胞。取 50 μl 红细胞悬液加入含 1 ml 沙比氏试剂（Drabkin's reagent）的比色皿中。通过移液反复吹打使细胞与沙比氏试剂充分混匀。使用 BECKMAN COULTER DU 730 UV/VIS 分光光度计在 540 nm 处测定血红蛋白氰化衍生物的吸光度。
- 为定量上清液中的血红蛋白含量，将细胞在 1,000 × g 离心 1 分钟。取 200 μl 上清液加入含 1 ml 沙比氏试剂的比色皿中。通过移液反复吹打使上清液与沙比氏试剂充分混匀。使用 BECKMAN COULTER DU 730 UV/VIS 分光光度计在 540 nm 处测定血红蛋白氰化衍生物的吸光度。
- 根据上清液中血红蛋白含量（步骤 6）与细胞悬液总血红蛋白含量（步骤 5）的比值，计算在不同 NaCl 溶液中发生裂解的细胞比例。
V. 流式细胞术检测——恒河猴D（RhD）抗原的保护
- 取5 μl对照组或HPG修饰的RBCs（20% hematocrit），每组设三个重复，加入含0.5% BSA的PBS缓冲液中，总体积为25 μl。
- 加入25 μl购自Quotient Biodiagnostics（PA, USA）的FITC标记单克隆抗Rhesus D（RhD）抗体。
- 将混合物在37 °C水浴中孵育30分钟。
- 用1.5 ml PBS缓冲液洗涤两次，每次以1,000 × g离心1分钟，弃去上清液。
- 将RBCs重悬于1 ml生理盐水中，转移至4 ml BD流式细胞术管中。
- 使用FACSCanto II流式细胞仪进行分析，采集RBC对照门内的5,000个事件，并以全部事件进行数据分析。
六、流式细胞术检测——CD47 表达
- 取1.54 μl对照组或HPG修饰的RBCs（20% hematocrit），每组设三个重复，加入含0.5% BSA的PBS缓冲液中，总体积为44 μl。
- 加入6 μl购自BD Biosciences（新泽西州，美国）的PE标记小鼠抗人CD47抗体。
- 将混合物在37 °C水浴中孵育30分钟。
- 用1.5 ml PBS缓冲液洗涤混合物两次，每次以1,000 × g离心1分钟，弃去上清液。
- 将RBCs重悬于1 ml生理盐水中，并通过26 G 5/8针头反复吹打，以最大程度减少细胞聚集。
- 将悬液转移至4 ml BD流式细胞仪专用管中。
- 使用FACSCanto II流式细胞仪进行分析，在RBC对照门内采集10,000个事件。
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结果
通过流式细胞术使用荧光标记的单克隆抗体定量分析了恒河猴D抗原和红细胞表面蛋白CD47的伪装效果，代表性结果见图1。对于HPG接枝的红细胞（灰色），与对照组红细胞（红色和绿色）相比，信号强度降低（峰向左偏移），表明抗体与细胞表面的结合减少，提示表面蛋白已被遮蔽。
图1. 采用流式细胞术评估表面抗原与蛋白的伪装效果。A) 恒河猴D抗原（RhD）保护：黑色阴影峰代表阴性对照（经PE标记的IgG1处理的未修饰红细胞），...
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讨论
通用供体红细胞在提高输血治疗的血液可及性和安全性方面具有巨大潜力。由于红细胞具有长循环特性和固有的生物相容性，也被认为是颇具前景的药物递送载体。 14, 15本文所述实验评估了 体外 HPG修饰红细胞的特性。该 体外 性质和 体内 我们课题组近期已对HPG修饰红细胞的循环特性进行了研究 8, 11红细胞在补充有 NaCl 和磷酸钠的 Dextran500K/PEG8K 水相两相体系中的分配，取决于红细胞表面电荷及表面糖蛋白组成 16根据红细胞糖萼被HPG修饰的程度不同，修饰后的红细胞倾向于从下层的葡聚糖相转移至顶层的聚乙二醇（PEG）相。该两相系统可简便地评估红细胞表面修饰的程度。在自体血清中进行红细胞溶血试验是重要的检测手段，用于探究HPG修饰后的红细胞是否引发补体激活，因为向细胞和生物表面引入新材料会使细胞被视为外来物，从而导致免疫系统介导的溶血与清除。 17. 另一方面，渗透脆性实验可指示红细胞膜的机械性能和变形能力是否因HPG接枝而受损。红细胞的变形能力对其生理功能至关重要，对于O
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披露
未声明任何利益冲突。
致谢
本研究由加拿大血液服务中心（Canadian Blood Services，CBS）和加拿大卫生研究院（Canadian Institutes of Health Science，CIHR）研究合作基金资助。作者感谢不列颠哥伦比亚大学血液研究中心（UBC Centre for Blood Research）的LMB大分子中心提供研究设施的使用。该基础设施设施得到了加拿大创新基金会（Canada Foundation for Innovation，CFI）和迈克尔·史密斯健康研究基金会（Michael Smith Foundation for Health Research，MSFHR）的支持。R. Chapanian 获得了加拿大卫生研究院/加拿大血液服务中心输血科学博士后奖学金，以及MSFHR研究培训生博士后奖学金。J.N. Kizhakkedathu 获得了MSFHR职业研究学者奖。
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 缩水甘油 | Sigma Aldrich | （安大略省，加拿大） | |
| 三羟甲基丙烷 | Fluka | （安大略省，加拿大） | |
| 甲醇钾 | Sigma Aldrich | （安大略省，加拿大） | |
| 无水吡啶 | Sigma Aldrich | （安大略省，加拿大） | |
| 4-二甲氨基吡啶 | Sigma Aldrich | （安大略省，加拿大） | |
| 琥珀酸酐 | Sigma Aldrich | （安大略省，加拿大） | |
| 丙酮 | Fisher Scientific | （安大略省，加拿大） | |
| 无水二甲基甲酰胺 | Sigma Aldrich | （安大略省，加拿大） | |
| N-羟基琥珀酰亚胺 | Sigma Aldrich | （安大略省，加拿大） | |
| N,N'-二异丙基碳二亚胺 | Sigma Aldrich | （安大略省，加拿大） | |
| MTS 芯片 | Micro Typing System (MTS) 卡片（FL，美国） | ||
| 葡聚糖 500 kDa | Pharmacia Fine Chemicals | （瑞典） | |
| PEG 8 kDa | Sigma Aldrich | （安大略省，加拿大） | |
| FITC标记的抗RhD单克隆抗体 | Quotient Biodiagnostics | （美国宾夕法尼亚州） | |
| PE 单克隆抗 CD47 | BD 生物科学 | （美国新泽西州） | |
| Drabkin试剂 | Sigma Aldrich | （安大略省，加拿大） | |
| <强>表。 用于HPG聚合物接枝红细胞膜及其分析所用的化学品与试剂 |
参考文献
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