讨论了一种方法，通过该方法 体内 刺激响应材料的力学行为随时间变化被监测。样品进行测试 离体 使用带有环境控制的微拉伸测试仪模拟生理环境。这项工作进一步促进了对 体内 材料的性能
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摘要
摘要
可植入微器件因其在多种生物医学应用中的潜力而受到广泛关注1-4。这类器件由多种材料制成，每种材料都有其各自的优势与局限性5,6。尤为突出的是，由于器件尺寸处于微米量级，需要较高的模量以利于植入活体组织；但另一方面，器件的刚度又应与周围组织相匹配，以尽量减少诱发的局部应变7-9。因此，我们近期开发了一类受生物启发的新型材料，可通过响应环境刺激而改变其力学性能，从而满足上述要求10-14。具体而言，我们基于聚醋酸乙烯酯的纳米复合材料（PVAc-NC）在接触水和较高温度（例如 体温）时会表现出刚度降低。然而，目前可用于量化材料在体内刚度的方法极少15，而在生理环境之外进行力学测试通常需要较大的样品，不适合用于植入。此外，刺激响应性材料在取出体外后可能迅速恢复其初始刚度。因此，我们建立了一种方法，可在模拟生理条件（通过湿度和温度控制维持）下对植入后的微小样品进行体外力学性能测定13,16,17。
为此，设计了一种定制的微拉伸测试仪，用于测试具有广泛不同杨氏模量（范围为 10 MPa 至 5 GPa）的微尺度样品13,17。由于我们的研究兴趣在于将 PVAc-NC 作为生物可适应性神经探针基底的应用，因此需要一种能够在微尺度上对样品进行力学表征的工具。该仪器经过改进，具备湿度和温度控制功能，从而最大限度地减少了样品的干燥和冷却17。因此，取出后样品的力学特性能够真实反映其在取出前的状态。
该方法的总体目标是定量评估 体内 力学性能，特别是刺激响应性、力学自适应聚合物材料的杨氏模量。该目标通过首先建立环境条件来实现，这些条件可最大限度减少样品在取出后其力学性能发生变化，同时避免因植入以外因素导致的刚度降低。随后，样品被制备用于植入、操作和测试（图1A）。每个样本被植入大鼠的大脑皮层中，此处以离体大鼠脑组织表示，植入时间为特定时长（图1B）。此时，将样品取出并立即装入微 tensile 测试仪，随后进行 tensile 测试（图1C随后的数据分析揭示了这些创新材料在大脑皮层环境中的力学行为。
方案
1. 样品制备
- 采用溶液浇铸与压缩技术制备厚度为25–100 μm的PVAc-NC薄膜10-12。
- 将薄膜置于加热板上，在70 °C（高于玻璃化转变温度）下加热两分钟，使其粘附于硅片上，以促进薄膜与硅片之间的紧密接触。此步骤可确保所制备的薄膜保持平整并牢固固定在硅片上，这对于平面微加工工艺是必要的。
- 使用激光微加工设备（VLS 3.50, VersaLASER）对薄膜进行图案化。设置CO2直写激光微加工参数为1.0%功率（0.5 W）、4.0%速度（56 mm/s）以及每英寸1,000个脉冲13,16。
- 将用于建立环境条件的样品（“设置样品”）加工成狗骨形结构，其侧向垫片尺寸为1.5 × 1.5 mm2，侧向梁尺寸为300 × 3,000 μm2，厚度与薄膜整体一致（图2）。
- 将用于ex vivo实验的样品（“植入样品”）加工成尺寸为300 μm × 6 mm的梁状结构，厚度与薄膜一致。
- 使用剃刀刀片和镊子小心地将样品从硅片上剥离。
- 为便于样品操作，准备定制加工的丙烯酸夹具，该夹具将作为微拉伸测试仪夹持系统的一部分。夹具上带有激光刻蚀标记，显示其中心线及距末端1.5 mm的位置。在丙烯酸夹具的中心线上涂抹少量氰基丙烯酸酯凝胶粘合剂，并小心地将一段1.5 mm长的植入样品粘附于夹具上，使其与标记的中心线重合（图3）。每个植入样品需使用一个丙烯酸夹具。注意确保粘合剂仅分布在与丙烯酸夹具粘接的1.5 mm长PVAc-NC区域内，否则粘合剂可能干扰样品的力学行为。
- 将所有样品置于干燥器中至少24小时，以去除水分。
- 使用光学显微镜测量样品的长度、宽度和厚度。
2. 建立环境条件
- 将干燥的样品装入微拉伸测试仪中（参见图4），先将其夹紧在移动夹具之间，再夹紧在固定夹具之间。
- 将带有盛水储液罐的喷枪固定在某一位置，喷嘴朝向微拉伸样品。通过塑料管将喷枪连接至空气压缩机。via 塑料管路连接喷枪与空气压缩机。关闭喷枪喷嘴后，启动空气压缩机。
- 开始循环微拉伸测试程序，在施加于样品的拉伸应变（正应变）与压缩应变（负应变）之间交替进行，始终保持在应力-应变曲线的线弹性范围内。对于PVAc-NC，施加的应变限制在小于2%。在本实验所用的定制微拉伸测试仪中，通过控制应变速率并测量达到该应变所需的力；也可采用另一种设置，即控制施加的力并测量产生的应变。
- 逐步增加喷枪喷嘴的气流流量，并监测应力-应变曲线斜率随喷枪流量变化的情况。在60秒内不会导致杨氏模量显著降低（>10%）的最大流量，即为后续ex vivo实验所采用的流量水平。此时，已确定不会润湿干燥样品（从而避免杨氏模量下降）的湿度条件，同时也可最大限度减少样品在in vivo暴露于生物液体后的干燥效应。
- 测量样品附近的温度。理想情况下应配备带数字读数的热电偶，并在喷枪运行时进行测量。调节辐射热源的强度和距离，使样品温度维持在37 °C，以模拟生理条件。
3. 比较环境控制组与非环境控制组
- 将样品浸入磷酸盐缓冲液中至少 30 分钟。经过该时间后，样品已完全饱和，并在给定温度下达到其最低的杨氏模量。
- 迅速将一个样品装入微型拉伸测试仪中，在喷气装置关闭的情况下开始循环微型拉伸测试，同时让样品干燥。这将确定样品在非受控条件下干燥的速度。
- 将第二个经 PBS 饱和的样品装入微型拉伸测试仪中，在喷气装置开启的情况下开始循环微型拉伸测试。这将确定样品在受控环境条件下干燥的速度。
4. 探针植入与取出
- 将植入样品固定在显微操作器夹具上，并使其垂直于皮层组织放置。
- 插入前，用生理盐水充分润湿组织，以确保组织力学性能的均一性。
- 使用显微操作器的手动控制将聚合物样品插入皮层。将样品保留在皮层组织内直至达到预定的植入时间，通常为1至30分钟。对于超过5分钟的时间点，为防止组织干燥，应每隔5分钟用浸有生理盐水的棉签轻轻蘸拭组织表面。
- 当探针植入皮层期间，准备微拉伸测试仪以加载当前已植入的样品：将驱动杆设置至距固定样品夹具3.0 mm的零位移位置。同时，将气动喷笔喷嘴调节至设定的气流状态，并将辐射热源调至第2.4步中确定的适当强度。
- 在指定的植入时间结束后，使用显微操作器的手动控制将探针从皮层中提起。立即小心地将样品从显微操作器夹具上取下，并按照第5.2步中所述的详细步骤将其装入微拉伸测试仪中。
5. 植入物样品的微拉伸测试
- 为节省取出植入物后的时间，在植入前应确保微拉伸测试仪已完全准备好接收植入物样本，具体操作如步骤4.4所述。
- 样本取出后立即置于微拉伸测试仪的两组夹具之间。由于样本已安装在丙烯酸支架上，该支架设计为充当其中一组夹具的上半部分，因此应将植入样本组件放置在移动夹具上，样本面朝下。必须确保样本安装方向正确，以便施加的应变沿预定方向进行 仅 沿探针长度方向固定，以避免测试过程中对样本施加扭矩。因此，样本必须安装在每个夹具的中心位置，且夹具之间必须保持水平对齐。
- 调整样品位置，使两个夹具之间的距离为3.0 mm，并将探针末端放入固定夹具中。夹具间3.0 mm的距离为样品的标距，将在后续计算中用于确定样品的应变。
- 在将样本夹紧于两个夹具之间后立即开始操作，并在从神经组织中取出样本后的2分钟内，启动电机沿拉伸方向以恒定速率对样本进行拉伸10 μm/sec 同时测量并记录样品的伸长量（使用位移指示器，Mitutoyo 543-561）以及使样品产生应变所需的力（使用载荷传感器，Transducer Techniques MDB-2.5）。
- 在试样发生机械失效或驱动杆行程结束时，停止微拉伸试验。导出采集的数据，并进行数据分析。
- 对每个样本和/或每组条件重复进行微拉伸测试（即 插入时间）。
6. 数据分析
- 通过将伸长量除以初始标距长度，将原始伸长数据转换为施加于植入样品上的工程应变，如公式1所示，其中 ε 为施加的应变，t 为时间，d 为千分表指示器测得的位移，L0 为样品的初始标距长度：
(1) - 通过将测得的力（单位：牛顿）除以横截面积，将原始力数据转换为样品上的工程应力，如公式2所示：
(2)
其中 σ 为样品上的应力，F 为载荷传感器测得的力（单位：牛顿），w0 为样品的初始宽度，t0 为样品的初始厚度。 - 使用计算机程序（如 Microsoft Excel）绘制每个样品的应力（σ[t]）与应变（ε[t]）曲线。
- 截取曲线中的线性弹性部分，并使用基于软件的曲线拟合工具对该部分进行最佳拟合直线分析。最佳拟合直线的斜率即为样品的杨氏模量。所截取的部分应至少包含10个应力-应变数据点，并应选自曲线上斜率最大的区域。
- 对于循环测试，需对每一循环分别确定杨氏模量。此过程可采用自动化或手动方式进行。
- 对于循环测试，绘制每一循环的杨氏模量随时间的变化曲线。该曲线可反映测量得到的模量随时间的变化情况，从而表征样品在实验装置中润湿或干燥的速度。
- 对于植入样品，每个样品及其植入时间对应循环测试中的一个循环。按照上述方法，对每个植入样品测量其杨氏模量。
- 绘制杨氏模量随植入时间的变化曲线。此时可将其与台式实验等其他研究结果进行比较。
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结果
几乎所有聚合物材料的力学性能（包括我们的 PVAc-NC）都依赖于环境条件的暴露。其中尤为显著的是材料对热和湿气的暴露。当材料因吸湿而发生塑化，或经历热转变时，其杨氏模量会降低。在为ex vivo样本的力学表征准备受控温湿度环境时，必须确保在将样本装入微拉伸测试仪的过程中以及力学测试期间，样本的含水量变化最小。通过对照组实验来评估这一条件，以确保样本不受气动喷雾器产生的湿气影响，也不会在外部环境中迅速干燥。图5展示了一个示例曲线，显示在适当的气动喷雾器湿度设置下，干燥对照组样本在循环拉伸测试中的力学行为。当开启气动喷雾器时，样本杨氏模量的变化极小。这一点至关重要，因为外部环境不应导致样本刚度的增加或降低。当气动喷雾器的气流设置过高时，样本的杨氏模量将在约60秒内显著下降。
控制力学测试环境还可确保材料不会过早干燥。例如，使用我们所控制的湿度环境，可延长取出的样品干燥并恢复植入前力学性能所需的时间。图6展示了两个对照组样品在完全饱和后，在受控与非受控环境条件下进行循环拉伸测试时的干燥行为。在非受控环...
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讨论
用于与生物系统相互作用的可植入生物微机电系统（bioMEMS）的进步，正在推动具有高度定制化性能的新材料的开发。其中一些材料被设计为在响应生理环境中存在的刺激时，表现出材料性能的变化。最近开发的一类材料在氢键形成液体（例如水）存在且温度升高的条件下，可使表征材料刚度的杨氏模量降低三个数量级10,11,18。这类聚合物纳米复合材料由软聚合物基体（即聚醋酸乙烯酯）和作为纳米填料相的纤维素纳米纤维组成。纤维素纳米纤维之间的相互作用决定了材料整体的力学性能，并在干燥状态下“开启”、在湿润状态下“关闭”。此外，水对聚合物纳米复合材料具有增塑作用，使其玻璃化转变温度降至体温（37 °C）以下，从而进一步降低杨氏模量。此类材料的一个应用是作为皮层内探针的生物自适应基底，用于与单个神经元进行交互13,17。然而，机械自适应材料的优势并不仅限于与神经系统进行交互。
本文介绍了一种用于评估PVAc-NC基微探针在神经组织中植入特定时间后其力学行为的方法。利用该方法， 离体 机械数据可被采集以与台式研究进行...
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披露
我们没有需要披露的内容。
致谢
本研究工作得到了凯斯西储大学生物医学工程系的实验室启动资金（J. Capadona）以及美敦力研究生奖学金（K. Potter）的支持。本研究的额外资助部分来自美国国家科学基金会（NSF）项目 ECS-0621984（C. Zorman）、凯斯校友协会（C. Zorman）、美国退伍军人事务部杰出研究奖（B7122R），以及先进平台技术中心（C3819C）。
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 硅片 | University Wafer | 机械级 | |
| 挤出式丙烯酸板 | Professional Plastics | SACR 062EF | 厚度 0.062" |
| 剃须刀片 | McMaster-Carr | 3962A3 | |
| 镊子 | McMaster-Carr | 8384A47 | #5 尖端 |
| 超级胶水凝胶 | Loctite | 130380 | |
| 喷枪 | Snap-on Industrial | BF175TA | |
| 空气压缩机 | Paasche | B002YKN8YO | D500 |
| 热电偶 | Omega | HH12A | |
| 加热板 | Cimarec | SP131325Q | |
| CO2 直接写入激光器 | VersaLaser | 3.5 | |
| 干燥器 | Fisher Scientific | 08-595 | |
| 灯 | 定制构建 | ||
| 微拉伸测试仪 | 定制构建 |
参考文献
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