以下方案提供了通过巯基-烯烃光点击反应形成逐步增长型聚乙二醇-多肽水凝胶来包封胰岛β细胞的技术。该材料平台不仅为细胞包封提供了细胞相容性的微环境，还可实现用户可控地快速回收在水凝胶内形成的细胞结构。
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摘要
摘要
水凝胶是一类亲水性交联聚合物，可为具有治疗意义的细胞或组织培养提供具有类似组织弹性且高通透性的三维微环境。由聚乙二醇（PEG）衍生物制备的水凝胶因其可调控的理化特性和良好的细胞相容性，正被广泛应用于多种组织工程领域。在本实验方案中，我们采用巯基-烯烃逐步生长光聚合反应制备用于包封胰腺MIN6 β细胞的PEG-肽类水凝胶。该凝胶由四臂PEG-降冰片烯（PEG4NB）大分子单体与一种对胰蛋白酶敏感的肽交联剂（CGGYC）形成。PEG的亲水性和抗非特异性吸附特性为细胞在三维环境中的存活与增殖提供了良好的细胞相容性微环境，而采用胰蛋白酶敏感肽序列（CGGY↓C，箭头表示酶切位点，末端半胱氨酸残基用于巯基-烯烃交联）则可实现对在水凝胶内形成的细胞结构进行快速回收。本方案详细阐述了以下技术：（1）将MIN6 β细胞包封于巯基-烯烃水凝胶中；（2）通过定性和定量细胞活力检测评估细胞存活与增殖情况；（3）利用胰蛋白酶介导的凝胶降解回收细胞球体；（4）对回收的细胞球体进行结构与功能分析。
引言
水凝胶是一类亲水性交联聚合物，作为组织修复与再生的支架材料具有巨大的应用潜力1-3。水凝胶的高含水量有利于氧气扩散以及营养物质和细胞代谢产物的交换，这些因素对于维持细胞活性至关重要。此外，由于水凝胶具有高度可调控性，因此也是实现可控释放和细胞递送的优良载体2。合成水凝胶（例如由聚乙二醇（PEG）制备的水凝胶）在组织工程中的应用日益广泛，这主要归因于其良好的细胞相容性、类似组织的弹性以及在材料物理和力学性能方面的高度可调性4-6
尽管聚乙二醇二丙烯酸酯（PEGDA）是一种常用的水凝胶平台，但研究表明，通过链增长光聚合形成的PEGDA水凝胶在网络交联过程中容易对包封的细胞造成损伤 原位 细胞封装7 细胞损伤在很大程度上归因于光引发剂分子产生的自由基物种，这些自由基通过PEGDA上的乙烯基传播，使聚合物链交联形成水凝胶。然而，这些自由基物种在细胞包封过程中也会引起应力和细胞损伤，尤其对自由基敏感的细胞（如胰腺β细胞）更为显著。8-10 为了获得更大的网格尺寸以促进扩散和提高细胞存活率，细胞封装通常采用较高分子量的 PEGDA。然而，这会损害聚合动力学，并导致凝胶的生物物理性能次优化。7,11,12 除了上述缺点之外，由于交联网络的异质性和不可降解性，从 PEGDA 水凝胶中回收细胞结构非常困难。虽然可通过将蛋白酶敏感性肽段引入 PEG....
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方案
A. 大分子单体与多肽的合成
- 使用已建立的方案合成4臂PEG-降冰片烯（PEG4NB）和光引发剂芳基磷酸锂（LAP）。18,19
- 使用微波多肽合成仪（CEM Discover SPS）通过标准固相多肽合成方法合成含双半胱氨酸的胰蛋白酶敏感性多肽CGGY↓C（箭头表示胰蛋白酶切割位点）。
- 根据树脂的取代率和合成规模计算所需树脂（Rink-酰胺MBHA树脂）的量。在反应瓶（RV）中用二甲基甲酰胺（DMF）溶胀树脂15分钟。
- 使用含20%哌啶和0.1 M HOBt的DMF溶液去除树脂上的Fmoc保护基。采用下表所列参数进行微波辅助Fmoc去保护（适用于所有Fmoc-氨基酸）：
....
合成规模 0.1 mmol 0.2 mmol 功率 20 W 50 W 温度 75 °C 75 °C
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结果
图1-4展示了在巯基-烯烃水凝胶中包封、存活、增殖、球状体形成及球状体回收的代表性结果。图1显示了（1）使用PEG4NB和CGGYC进行逐步增长型巯基-烯光聚合反应的示意图，以及（2）由胰蛋白酶介导的凝胶侵蚀过程，该过程遵循表面侵蚀机制。图2和图3展示了通过活/死细胞染色和AlamarBlue检测获得的细胞活力结果。我们观察到，即使在较低的细胞密度下，细胞仍能在PEG4NB-CGGYC水凝胶中增殖，表明巯基-烯烃水凝胶体系具有良好的细胞相容性。图4展示了包封后回收的β细胞球状体的相差显微图像，以及回收后β细胞球状体的尺寸分布情况。
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讨论
所述方案详细介绍了通过逐步增长光聚合形成巯基-烯烃水凝胶以实现细胞简易包封的技术细节。本方案中采用降冰片烯与巯基官能团1:1的化学计量比，但该比例可根据具体实验需求进行调整。除正确的配方外，保持预聚物溶液的均一性至关重要。尤其应注意使用轻柔的移液操作，确保细胞在预聚物溶液中均匀分布，从而避免细胞聚集以及凝胶性能的不一致。尽管本方案采用2分钟的聚合时间进行凝胶交联，但在大多数与细胞包封相关的配方中，巯基-烯烃水凝胶的凝胶点通常短于10秒。例如，4 wt% PEG4NB/CGGYC水凝胶的凝胶点为7 ± 2秒，5 wt%的凝胶点为6 ± 1秒。该水凝胶体系的快速凝胶化可迅速固定细胞，与需要数分钟甚至数小时才能达到凝胶点的其他光聚合体系相比，实现了更优的三维细胞分布。7,20
此外，通过胰蛋白酶家族酶介导的凝胶侵蚀，可从硫醇-烯烃水凝胶中回收自然形成的β细胞球体。然而，胰凝乳蛋白酶属于胰蛋白酶家族，其高浓度或长时间孵育可能对细胞间相互作用产生负面影响，甚至在回收过程中破坏球体结构。为避免这一潜在局限，可使用其他巯基化底物交联水凝胶，并通过不会引起.......
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披露
未声明任何利益冲突。
致谢
本项目由美国国立卫生研究院（NIH，项目编号：R21EB013717）和印第安纳大学与普渡大学印第安纳波利斯联合分校校务研究办公室（IUPUI OVCR，研究支持基金）资助。作者感谢 Han Shih 女士提供的技术协助。
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 4臂PEG（20kDa） | Jenkem Technology USA | 4ARM-PEG-20K | |
| Fmoc-氨基酸 | Anaspec | ||
| 活细胞/死细胞活力检测试剂盒 | Invitrogen | L3224 | 包含钙黄绿素AM和碘化乙啶同型二聚体-1 |
| AlamarBlue 试剂 | AbD Serotec | BUF012 | |
| CellTiter Glo 试剂 | Promega | G7570 | |
| DPBS | Lonza | 17-512F | 无钙+2 和 Mg+2 |
| HBSS | Lonza | 10547F | 无钙+2 和 Mg+2 |
| 高糖DMEM | Hyclone | SH30243.01 | |
| FBS | Gibco | 16000-044 | |
| 抗生素-抗真菌剂 | Invitrogen | 15240-062 | |
| β巯基–乙醇 | Sigma-Aldrich | M7522-100ML | |
| 胰蛋白酶-EDTA | Invitrogen | 15400-054 | |
| 无胰蛋白酶 α-胰凝乳蛋白酶 | 沃辛顿生化公司 | LS001432 | |
| 小鼠胰岛素ELISA试剂盒 | Mercodia | 10-1247-01 | |
| 1 ml 一次性注射器 | BD 生物科学 |
参考文献
- Tibbitt, M. W., Anseth, K. S. Hydrogels as extracellular matrix mimics for 3D cell culture. Biotechnology and bioengineering. 103, 655-663 (2009).
- Lin, C. C., Anseth, K. S. PEG hydrogels for the controlled release of biomolecules in regenerative....
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重印与许可
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