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方法文章

检测神经营养肽ADNF-9在C57BL/6小鼠妊娠期间对抗酒精诱导凋亡作用的实验方法

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DOI：

10.3791/50092

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2013年4月24日

1Department of Pharmacology, College of Pharmacy and Pharmaceutical Sciences, University of Toledo

本文内容

摘要

本文提出的实验设计旨在研究妊娠期间酒精暴露对胎儿大脑细胞凋亡的影响以及神经营养肽的应用。文中详细描述了从动物配种到胎儿大脑组织采集的全过程，并详细介绍了细胞凋亡检测的相关技术。

摘要

研究产前酒精暴露对胚胎早期阶段胎儿大脑发育影响的实验设计具有挑战性，这主要是由于难以对胎儿大脑进行显微解剖并切片，以确定因产前酒精暴露引起的凋亡细胞。本文所述实验提供了从小鼠繁殖到胎儿脑组织中细胞死亡鉴定的可视化技术。本研究采用C57BL/6小鼠作为动物模型，用于研究胎儿酒精暴露以及营养性肽在对抗酒精诱导的细胞凋亡中的作用。繁殖过程设置2小时的交配窗口期，以精确确定胚胎发育阶段。本研究采用已建立的胎儿酒精暴露模型，以评估产前酒精暴露对胎儿大脑的影响，该模型包括为孕鼠提供自由饮用的酒精或配对喂养的液体饮食作为其唯一的营养来源。

详细描述了涉及胚胎解剖及胚胎脑微解剖的技术，因为后者具有较大挑战性。微解剖需要体视显微镜和超细镊子。文中以图示方式提供了分步解剖胚胎脑的操作流程。胚胎脑的解剖范围从嗅囊原基底部延伸至后脑底部。

为研究细胞凋亡，首先使用可剥离模具将胎鼠脑组织包埋于明胶中，以便利用振动切片机进行切片。经多聚甲醛固定并包埋的胎鼠脑组织易于切片，所得游离切片可转移至超粘附载玻片（superfrost plus slides）上，用于检测细胞凋亡或细胞死亡。

TUNEL（末端脱氧核苷酸转移酶介导的dUTP缺口末端标记法；TdT：末端脱氧核苷酸转移酶）检测已被用于鉴定细胞死亡或凋亡细胞。值得注意的是，细胞凋亡和细胞介导的细胞毒性均以DNA片段化为特征。因此，可视化的TUNEL阳性细胞提示存在细胞死亡或凋亡细胞。

本实验设计提供了关于使用一种成熟的液体饮食来研究酒精对妊娠期间胎儿大脑影响以及神经营养肽作用的信息。该方法包括繁殖和喂养妊娠小鼠、显微解剖胎儿大脑以及检测细胞凋亡。这些可视化与文字技术相结合，可为研究有害物质产前暴露对胎儿大脑的影响提供依据。

引言

本文所述实验方法的目标是利用多种技术（包括动物繁殖、喂养、显微解剖和细胞死亡检测）在胎儿酒精暴露模型中评估营养性肽类的神经保护作用。我们实验室的研究采用将酒精混入液态饮食的方法，模拟中度饮酒状态，其酒精摄入量可能与人类饮酒模式相似1-5。我们及其他研究者已鉴定出三种肽类衍生物，能够对抗胎儿酒精暴露所引起的有害影响。利用动物模型研究胚胎期酒精暴露，有助于揭示潜在的神经保护机制，并推动干预措施的开发。这可能为妊娠期间酒精暴露所导致的神经损伤的保护作用及其有害效应的减轻提供充分的信息。

预防产前酒精暴露可能影响的方法包括对怀孕小鼠使用某些肽类进行治疗，这些肽类已被证明在体外in vitro 6,7 和体内in vivo 1,2,4,8,9 具有神经保护作用。在这些肽中，SALLRSIPA（称为ADNF-9或SAL）来源于依赖活动的神经营养因子（ADNF）7,10。另一种肽NAPVSIPQ（称为NAP），来源于依赖活动的神经保护蛋白（ADNP）6,11，已显示出对酒精暴露相关的氧化应激具有显著的保护作用12,13。此外，我们最近鉴定出一种新合成的肽——colivelin，在胎儿酒精暴露模型中似乎发挥关键的神经保护作用2。Colivelin由ADNF-9和AGA-(C8R)HNG17（PAGASRLLLLTGEIDLP）组成。使用这些肽的重要性在于它们能够穿过血脑屏障，从而防止酒精诱导的细胞凋亡和脑发育缺陷。

本实验方法采用 C57BL/6 小鼠来检测对酒精诱导的细胞凋亡的神经保护作用。我们采用了2小时的交配窗口而非过夜交配，以便更准确地确定胚胎第0天（E0），该时间点可通过检测阴栓和阴道涂片来确认1-5。我们使用带有饲喂管的液体饮食，因为这被视为自由摄取，而通过灌胃途径给予酒精可能会对怀孕小鼠造成应激。另一方面，由于胎儿脑组织较为柔软，在早期胚胎阶段解剖胎儿大脑时可能会遇到微解剖操作的困难。本文展示了应对这些微解剖挑战的可视化技术。此外，由于胎儿脑切片也存在技术难点，我们采用了一种使用可剥离包埋模具将胎儿大脑包埋于明胶中的方法。我们已成功制备出厚度为50 μm的游离漂浮胎儿脑切片。这使我们能够检测胎儿脑切片中蛋白质含量的任何变化，包括细胞死亡的鉴定。

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方案

1. 动物繁殖与营养肽处理

  1. 将雌性 C57BL/ 小鼠（约 6 周龄，平均体重 20 g）放入雄性小鼠的饲养笼中 2 小时以进行繁殖。
  2. 随后立即检查阴道栓或阴道涂片。
  3. 若结果为阳性，则将该时间点定为胚胎发育第 0 天（E0）。
  4. 在 E7 天，根据近期报道的方法4，将怀孕雌鼠按体重匹配分配至对照组和处理组（共 3 组）：1）酒精（乙醇）液体饮食组（ALC）；2）配对喂养对照组（PF）；3）肽治疗组，该组应在接受酒精液体饮食的同时进行腹腔（i.p.）注射 ADNF-9 肽（ALC/ADNF-9）。ALC 和 PF 饮食的制备细节以及 i.p. 注射操作程序详见我们近期的研究4。
  5. 每日测量可自由摄取且作为唯一营养来源的酒精液体饮食摄入量。同时，也可每日测量与 ALC 组母鼠个体匹配的 PF 液体饮食摄入量。
  6. 通过 30 ml 带刻度的螺口试管记录前 24 小时内消耗的液体饮食体积，并从 E7 到 E13 每日提供新鲜配制的饮食。

2. 胎儿解剖及胎脑显微解剖

  1. 在E13天处死怀孕小鼠，先用CO2方法进行深度安乐死，随后实施颈椎脱位。
  2. 用70%乙醇清洁腹部手术切口部位。
  3. 使用无菌剪刀和镊子进行腹部切口。
  4. 打开腹腔后，用一把镊子夹住子宫，另一把镊子撕离子宫周围的子宫系膜，从而分离出子宫。操作时务必缓慢进行，以避免刺破胚胎。
  5. 将胚胎从子宫中取出，并转移至含有冰冷Hanks平衡盐溶液（HBSS）的细胞培养皿（60 mm × 15 mm）中。
  6. 在体视显微镜下对完整胚胎进行解剖，分离出胎鼠脑组织用于显微解剖。
  7. 使用超细显微解剖镊，从胚胎头部顶端开始剥离皮肤，以暴露颅骨。
  8. 在显微解剖体视显微镜下清晰暴露颅骨后，从脊髓和脑干区域的脑后部开始，逐步剥离颅骨。
  9. 务必从头部后部向前部逐片剥离颅骨。
  10. 一旦胎鼠脑组织完全暴露，即可继续进行脑组织的取出操作。
  11. 从嗅球原基底部至后脑底部完整解剖分离胎鼠脑组织。
  12. 将所有解剖获得的胎鼠脑组织用4%多聚甲醛固定2–3天。若需进行Western blot或酶活性检测，也可将同一只母鼠的其他胎鼠脑组织冷冻保存。

注意： 动物实验程序已获托莱多大学机构动物护理和使用委员会批准，符合美国国立卫生研究院机构动物护理和使用委员会指南以及《实验动物护理和使用指南》的要求。

3. 胎儿大脑的明胶包埋切片

  1. 制备10% A型明胶。
  2. 将剥离式包埋模具填充至一半高度，静置直至明胶凝固。
  3. 将对照组和产前处理的胎脑并排置于已凝固的明胶表面，以确保对照组与实验组在细胞死亡免疫检测条件上保持一致。
  4. 在胎脑上方加入液态明胶，形成完整包埋块（注意明胶温度不宜过高）。
  5. 将含有胎脑的明胶包埋块置于冰箱中冷藏15分钟。
  6. 剥去包埋模具的塑料外壳，然后将含有胎脑的预制明胶块转移至4%多聚甲醛中固定两天。
  7. 使用振动切片机（Leica VT 1000S）对固定后的胎脑进行明胶包埋切片，冠状面切片厚度设为50 μm。该厚度经本研究验证可提供更佳的解剖学特征。此外，25 μm及以上厚度也可适用于10%明胶包埋胎脑的切片技术。注意冠状切片位于前脑基底神经节隆起水平，使用振动切片机完成。
  8. 将胎脑切片收集于磷酸盐缓冲液（PBS）中。
  9. 在水中将胎脑切片贴附于Superfrost Plus载玻片上。
  10. 将贴附好的切片干燥15分钟。
  11. 将载有胎脑切片的载玻片置于PBS中，留待次日进行TUNEL反应检测。

4. 细胞死亡或凋亡检测的TUNEL反应

（TUNEL：末端脱氧核苷酸转移酶介导的dUTP缺口末端标记法；TdT：末端脱氧核苷酸转移酶）。该实验旨在检测细胞死亡。

  1. 将贴附于Superfrost Plus载玻片上的胎鼠脑组织切片用蛋白酶K（20 μg/ml）在37 °C下处理5分钟（将300 μl蛋白酶K加入20 ml PBS中混合）。将载玻片组装于5-Plend开放式染色缸中。
  2. 在旋转摇床中用PBS漂洗贴附于载玻片上的胎鼠脑组织切片，每次5分钟，共漂洗三次。
  3. 在室温下用甲醇配制的3% H2O2溶液孵育切片10分钟（将3 ml 30% H2O2加入27 ml 100%甲醇中）（载玻片不应置于摇床上）。
  4. 在旋转摇床中用PBS漂洗切片，每次5分钟，共三次。
  5. 在冰上（4 °C）用通透化溶液（含0.1% TritonX-100的0.1%柠檬酸钠溶液）孵育切片2分钟（100 μl TritonX + 0.1 g柠檬酸钠 + 99.9 ml蒸馏水）。
  6. 在旋转摇床中用PBS漂洗切片两次，每次5分钟。
  7. 擦干载玻片上组织切片周围的区域。
  8. 使用PAP笔在Superfrost Plus载玻片上画出隔离圈，以防止用于检测TUNEL阳性细胞的溶液外溢。
  9. 将切片与TUNEL反应混合液（瓶1取50 μl，瓶2取450 μl）在37 °C孵育1小时；对照组仅使用瓶2中的溶液进行孵育。
  10. 在旋转摇床中用PBS漂洗三次，每次5分钟。
  11. 擦干组织周围的区域。
  12. 将切片与转化剂-POD在37 °C孵育30分钟。
  13. 用Tris HCl缓冲液（pH 7.5，0.05 M）漂洗切片三次，每次5分钟。
  14. 在冰上（4 °C）、避光条件下，在旋转摇床上用含0.05% 3'-3'-二氨基联苯胺四盐酸盐（DAB）和0.003% H2O2的溶液孵育切片7分钟（将25 μl 3% H2O2和500 μl DAB加入25 ml Tris HCl缓冲液（pH 7.5，0.05 M）中）（务必在新的5-Plend开放式染色缸中进行此步骤）。
  15. 在旋转摇床中用PBS漂洗切片三次，每次5分钟。
  16. 将载玻片切片保存在PBS中，时间不超过24小时，随后按照下一节所述方案进行尼氏染色处理。

注意：DAB 是一种致癌物。操作时需佩戴手套，实验结束后所有使用过的器皿均需用漂白剂清洗。

5. 胎儿脑切片显微观察前的尼氏染色

  1. 尼氏染色操作应在生物安全柜中进行。
  2. 用去离子水冲洗切片 2 分钟。
  3. 将切片置于 70% 乙醇中孵育 2 分钟。
  4. 将切片置于 95% 乙醇中孵育 6 分钟。
  5. 将切片置于 70% 乙醇中孵育 2 分钟。
  6. 用去离子水冲洗切片 2 分钟。
  7. 将切片置于焦油紫染液（Cresyl Violet Stain）中孵育 3 分钟。
  8. 用去离子水冲洗切片 2 分钟。
  9. 将切片置于 70% 乙醇中孵育 2 分钟。
  10. 将切片置于含 3 ml 冰醋酸的 95% 乙醇中孵育 3 分钟。
  11. 将切片置于 95% 乙醇中孵育 2 分钟。
  12. 将切片置于 100% 乙醇中孵育 2 分钟，重复三次。
  13. 将切片置于二甲苯中孵育 10 分钟，重复三次。
  14. 承载胎儿脑组织切片的载玻片可使用 Permount 封片剂和盖玻片进行封片。
  15. 封片后的载玻片需放置过夜，然后进行显微镜观察与分析。
  16. 显微镜观察及显微摄影可在 Leica 直立显微镜下进行。

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结果

本文所述实验方法表明，2小时的交配窗口对于准确估算妊娠阶段至关重要。我们展示了E13天胚胎的解剖过程，同时也展示了E13天胎鼠脑组织的显微解剖。该操作包括多个步骤（a-c），如图1所示。胎鼠脑组织的解剖范围从嗅球原基底部延伸至后脑底部（图1）。随后将胎鼠脑组织置于4%多聚甲醛中固定，以进行免疫化学检测。固定后，胎鼠脑组织被包埋于10%明胶中，并按图2所述方法准备进行振动切片。请注意，胎鼠脑组织的逐步包埋操作在较低放大倍数下完成，而包埋后的胎鼠脑组织可在图1中以更高放大倍数观察。此外，可利用振动切片机获取前脑纹状体隆起水平的胎鼠脑冠状切片，并将其贴附于载玻片上进行免疫组织化学检测。该过程涉及TUNEL阳性细胞数量的检测（图3）。本文结果显示，与PF对照组（图3a）相比，产前酒精暴露导致纹状体隆起区TUNEL阳性细胞数量增加（图3b）；而ADNF-9给药显著减轻了酒精引起的TUNEL阳性细胞增多现象（

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讨论

本研究中介绍的方法和技术展示了产前酒精暴露对胎儿大脑的影响，以及营养肽在预防这些影响中的作用。这些发现可能为研究其他滥用药物或其他有毒化学物质在不同妊娠阶段对胎儿大脑的影响提供参考信息。

关于繁殖方案，在某些情况下可能无法观察到阴道栓。此时，重要的是在载玻片上进行阴道涂片的显微镜检查，这可能提供精子阳性的检测结果。

本研究指出，喂养过程包括自由摄取含有PF对照和酒精的液体饮食。在24小时自由摄取饮食期间，需维持至少30%的湿度，并将温度控制在不超过22–24 °C，以监测饮食质量1,2。此外，饮食需每日新鲜配制，喂养管在每次使用后应进行清洗。

在分离胎儿大脑时存在一些困难，这些困难取决于所测试的胚胎发育阶段。例如，与在E18阶段分离的胎儿大脑相比，在E13阶段分离的胎儿大脑更难操作。这是因为到E18时，胎儿大脑已充分发育，颅骨较易剥离；而在E13时，颅骨仍较柔软，难以完整移除。因此，在E13阶段分离胎儿大脑时，应按照本稿件所附视频中演示的方法，...

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致谢

本研究项目由美国国家酒精滥用与酒精中毒研究所（National Institutes on Alcohol Abuse and Alcoholism）资助，资助编号 R21AA017735（Y.S.）。本内容仅由作者负责，不一定代表国家酒精滥用与酒精中毒研究所或美国国立卫生研究院的官方观点。作者还要感谢 Charisse Montgomery 对本文稿的编辑工作。

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材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
Superfrost Plus 载玻片VWR48311-703
PAP 笔Research Products Int. Corp.195506
5-Plend 开口邮寄袋Heathrow Scientific, LLCHS 15983G
可剥离包埋模具Electron Microscopy Sciences70182
原位细胞死亡检测试剂盒，PODRoche Diagnostics, Inc11684817910
Hanks' 平衡盐溶液Invitrogen14170-120
明胶 A 型FisherScientificG8-500
体视显微镜W. NUHSBAUM, IncLeica M60, KL 200 LED
微型振动切片机Leica, IncLeica VT 1000S
Moria 超细镊子Fine Science Tools11370-402 对
30 ml 喂养管Dyets, Inc900012
维生素混合物Bio-Serv. Inc.F8031
矿物质混合物Bio-Serv. Inc.F8598
麦芽糖糊精Bio-Serv. Inc.3650
190 证明乙醇，5 加仑111000190-SS05Pharmco-AAPER
正置显微镜W. NUHSBAUM, IncLEICA DM 4000

参考文献

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