幼年斑马鱼前脑电生理记录

摘要

本文介绍了一种记录幼年斑马鱼前脑细胞外场电位的简单方法。该方法可提供癫痫样活动的稳定体内读数。该技术可用于携带癫痫相关基因的转基因斑马鱼幼鱼，或通过给予致惊厥药物诱发癫痫的模型。

摘要

癫痫影响着美国近300万人以及全球多达5000万人。癫痫被定义为自发性、无诱因的惊厥发作，可能由脑部损伤或基因突变引起。在动物模型中研究惊厥的努力主要采用在啮齿类动物中诱导脑损伤（如致惊厥药物、电刺激或脑外伤）或进行遗传操作（如反义寡核苷酸敲低、同源重组或转基因技术）。斑马鱼作为一种脊椎动物模型系统^1-3，可为基于啮齿类的癫痫研究提供有价值的替代方案。斑马鱼被广泛用于脊椎动物遗传学或发育研究，其基因与哺乳动物具有高度相似性，并且表达了约85%已知人类单基因癫痫突变的同源基因。由于体型较小（体长4–6 mm），斑马鱼幼体在早期发育阶段可维持在低至100 μl的液体体积中，并可排列于多孔板内。试剂可直接加入胚胎发育所处的溶液中，从而简化药物给药过程，并实现测试化合物的快速体内筛选⁴。合成寡核苷酸（吗啉代寡核苷酸）、诱变、锌指核酸酶以及转基因技术均可用于在斑马鱼中快速生成基因敲低或突变^5-7。这些特性使得斑马鱼在研究癫痫等神经系统疾病时，相较于啮齿类动物具有前所未有的统计功效分析优势。由于癫痫研究的“金标准”是监测和分析起源于中枢脑结构的异常电活动（即惊厥），本文介绍了一种高效记录斑马鱼幼体脑活动的方法。该方法是对传统细胞外记录技术的改进，可在完整斑马鱼幼体中实现稳定、长期的脑活动监测。文中展示了通过浴式施加致惊厥药物诱导的急性惊厥记录，以及在基因修饰鱼中记录到的自发性惊厥实例。

方案

1. 卵的产生与收集

1. 斑马鱼的饲养遵循先前描述的标准操作流程⁸。简言之，将成年斑马鱼放入带有隔离板的繁殖缸中。次日早晨光照开启后，移除繁殖缸中的隔离板，让鱼自由交配约20至60分钟。
2. 用滤网收集繁殖缸中的卵，并用卵水冲洗。随后将卵转移至含有卵水的培养皿中，使用移液管去除未受精的卵和碎片。
3. 将含有收集卵的培养皿置于孵育箱中（28–32 °C）。卵受精后约两天（dpf）孵化，此时用移液管去除卵膜及其他碎片。
4. 在所需的受精后天数（3至8 dpf），取出含有自由游动幼鱼的培养皿，置于室温下的实验台面上。

2. 微电极的拉制与制备

1. 使用微量移液器拉制仪，将一根外径为1.2 mm的硼硅酸盐玻璃毛细管拉制成两根微电极针，并将其放置在150 mm的培养皿或空的移液器盒中，架在橡皮泥制成的斜坡上保存。微电极针可预先拉制。可根据所用放大器头级的类型，选用不同外径的玻璃毛细管。
2. 使用带有Nalgene滤器（4 mm）和Microfil推杆（Warner Precision Instruments）的1 ml注射器，从微电极后端装入细胞外记录液（2 M NaCl）。轻轻摇动或轻敲注射器，使液体团块向针尖移动，直至残留气泡极少或完全消失。

3. 琼脂固定

1. 配制新鲜的1.2%低熔点琼脂溶液于养鱼用水中，并将琼脂溶液置于约37 °C的水浴中保温。
2. 准备带有记录腔室的盖玻片，放入冰箱冷冻5–10分钟。记录腔室应与电生理装置上使用的腔室一致。我们使用Warner Instruments公司生产的低剖面开放式钻石浴成像腔室（型号RC-26GLP）。
3. 使用巴斯德吸管或移液器，将一条幼年斑马鱼转移至洁净培养皿中的少量养鱼用水液滴中。向该液滴中加入含有麻醉剂（0.02%三卡因）和麻痹剂（1 mg/ml α-银环蛇毒素）的溶液液滴。
4. 观察斑马鱼运动是否停止（5至10分钟）。
5. 从冰箱中取出盖玻片/记录腔室，将其放置在体视显微镜的载物台上。使用移液器将数毫升1.2%低熔点琼脂糖溶液与含有斑马鱼的液滴混合，并将混合液转移至盖玻片/记录腔室中。
6. 在体视显微镜下使用移液器吸头或细钝针调整幼鱼位置，使其背侧朝向琼脂糖凝胶表面。静置使琼脂糖凝固（5–10分钟），然后使用扁平刮铲将凝胶块转移至电生理记录装置上的记录腔室中。

3. 细胞外场电位记录

1. 向记录室中加入 2–5 ml 斑马鱼记录液。如需更换药物，以约 1 ml/min 的流速用记录液灌注记录室。记录液无需供氧。
2. 将微电极（尖端直径约 1 μm，阻抗 2–7 MΩ）插入安装在三维显微操作器上的放大器头级。检查显微操作器是否处于合适位置，以确保具有足够的移动和调节范围。将微电极尖端移至显微镜视野平面，先将其置于远离载物台的高位，再通过粗调将其下降至斑马鱼头部略前方且稍高于头部的位置。
3. 将放大器置于“电流钳”模式，对电极进行调零。
4. 使用粗调缓慢降低电极尖端，使其刚好接触斑马鱼体表，位置位于前脑略前方。
5. 通过微调逐步推进电极尖端，直至刺穿斑马鱼皮肤。待其稳定后，再将电极向前推进数微米，进入前脑区域。
6. 使用 Axoscope 软件在电流钳模式下记录电活动。数据采集采样率为 10 kHz。

结果

在图1中展示了在琼脂包埋的斑马鱼幼鱼前脑中记录到的类似癫痫样放电的脑电图实例。这些样本中的高幅多峰簇状放电由浴槽施加致惊厥药物诱发：图A中为40 mM的匹鲁卡品（pilocarpine，6 dpf），图B中为1 mM的苦味毒（picrotoxin，8 dpf）。在这些记录过程中，固定并包埋于琼脂中的斑马鱼被持续监测长达90分钟。鱼类在该记录条件下可保持存活长达24小时。药物被加入灌流液中，通常在30至45分钟内扩散进入琼脂，从而诱发斑马鱼幼体前脑的电活动。该方法可使用相对少量的药物溶液（2–5 ml），因为幼鱼无需持续灌流，必要时可在静态浴槽配置中进行记录。图C显示了一只在3 dpf时的转基因斑马鱼出现的自发簇状放电；记录在斑马鱼记录液中进行。在1–2细胞期注射吗啉寡核苷酸（morpholino oligonucleotide）以敲低结节性硬化复合物（Tuberous Sclerosis Complex, tsc1a）基因的表达，该基因与一种伴有癫痫和自闭症的小儿癫痫类型相关。此外，也可从视顶盖获取细胞外记录。相关示例参见Baraban et al. (2005)⁹

讨论

本文介绍的细胞外记录方法能够对脑部活动进行高灵敏度和快速的分析。这些记录类似于临床上常用的脑电图（EEG）监测，可用于评估是否存在异常的电活动放电即，癫痫啮齿类动物模型中的癫痫发作）¹¹ 和患者¹²细胞外记录可与药理学干预相结合，如此处所示。此类记录还可用于评估基因修饰斑马鱼中潜在的癫痫表型。对于通过ENU诱变筛选鉴定出的许多基因突变，通常可获得相应的突变型斑马鱼（参见Zebrafish International Resource Center, http://zebrafish.org/zirc/home/guide.php或通过新兴的 Tol2 转基因方法⁷ 和锌指核酸酶¹³ 技术。如本研究所示，使用吗啉代寡核苷酸进行快速基因敲降，随后在最早3天受精后（dpf）即开展电生理监测，为评估致癫痫基因缺陷提供了一种额外的方法。记录电极可轻松放置于斑马鱼的任何脑区结构，包括视顶盖或小脑，必要时亦...

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
低熔点琼脂糖	Fisher-Scientific	BP1360-100	在胚胎培养液中溶解至1.2%
记录介质	Fisher-Scientific	BP3581, P330-3, BP410-1, BP214-500, D16-1, C77-500	1 mM NaCl，2.9 mM KCl，10 mM HEPES，1.2 mM MgCl2，10 mM葡萄糖，2.1 mM CaCl2 用 1 N NaOH 将 pH 调至约 7.3
Tricaine	Argent 实验室	MS-222	0.02%
α-bungarotoxin	Tocris Bioscience	2133	1 mg/ml
毛细玻璃管	Warner Instruments	G120TF-3	拉至电阻为 2-7 MΩΩ
膜片钳放大器	Warner Instruments	PC-505B	我们使用Warner放大器，设置为电流钳模式；增益设为2 mV/pA，贝塞尔滤波器设为2K。可根据制造商说明使用其他类似型号。
滤波器/放大器	赛格纳斯科技	FLA-01	我们使用 Cygnus 前置放大器；增益设定为 10-20；截止频率设定为 1-2K；启用陷波滤波器。可根据制造商说明书选用性能相当的其他型号。
Axon A/D 板与 Axoscope 软件	Molecular Devices	Axon Digidata 1320A；Axoscope 8.2	使用Axoscope以无间隙采集模式收集数据，采样频率为10 KHz。可根据制造商说明使用其他类似型号的设备和软件。
卵水	Instant Ocean		3 克 Instant Ocean 海盐，2 毫升 0.1% 亚甲蓝溶于 10 毫升去离子水中