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Drosophila 成年果蝇嗅觉休克学习

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DOI：

10.3791/50107

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2014年8月7日

 , 
1Physiology and Pharmacology, University of Bristol

本文内容

摘要

介绍了测量成年Drosophila关联记忆的方法。该检测基于果蝇将某种气味与负面强化刺激（电击）相关联的能力，并能在后续时间回忆该信息，从而实现对记忆的测量。

摘要

Drosophila 已被用于经典条件反射实验超过40年，极大地促进了我们对记忆的理解，包括阐明认知疾病中涉及的分子机制1-7。可在幼虫中检测学习与记忆，以研究神经发育相关基因的作用8-10，也可在成蝇中测定成体可塑性基因的贡献1-7。此外，Drosophila 短暂的寿命有利于分析介导年龄相关记忆损伤的基因5,11-13。大量可诱导启动子可用于细分 Drosophila 神经系统，从而能够确定特定基因在正常记忆形成以及不同强化信号传递过程中所需的时间和空间位置3,4,14,16。

在成年 Drosophila 中研究记忆，能够对相关行为和神经回路进行详细分析，并可测量长期记忆15-17。成虫阶段的较长生命周期便于开展长期的遗传、行为、饮食和药物干预以研究记忆，此外还可用于确定衰老和神经退行性疾病对记忆的影响3-6,11-13,15-21。

通过同时呈现中性气味线索（条件刺激，CS）来诱导经典条件反射+）以及一个强化刺激， 例如，一种电击或蔗糖（非条件刺激，US），动物会将其相互关联1,16. 第二个条件刺激（CS-随后在不呈现非条件刺激（US）的情况下进行。在测试阶段， 果蝇 同时呈现CS+和CS-气味。在之后的 果蝇 给予动物一定时间在两种气味间进行选择，并记录动物的分布情况。该程序能够可靠地测量关联性厌恶或趋近条件反射，同时避免因动物对任一条件刺激气味的先天偏好而引入的偏差。此外，还进行多种对照实验，以检验不同基因型动物对气味和强化刺激本身是否均能正常响应。

引言

本文所述方法基于Tully和Quinn提出的方法，并做了一些小的修改1。实验分为两个阶段：第一阶段对果蝇进行训练，第二阶段对训练后的果蝇进行测试。在训练过程中，一组果蝇在训练管中同时暴露于气味1（CS+）和电击（US）。随后，果蝇接受气味2（CS-）而不伴随电击。这种将特定气味与电击配对一次的过程称为单周期训练（1-cycle training），最常用的气味为4-甲基环己醇（MCH）和3-辛醇（OCT）。

单次训练会形成一种不稳定的记忆阶段，可持续长达7小时；然而，通常在训练后立即进行测试，以确定所谓的学习、习得或2 min 记忆。在训练后30 min 或1小时测得的记忆被称为短期记忆，而3 小时的记忆则被称为中期记忆。对果蝇进行多次重复训练，且训练周期之间留有间隔（即间隔训练），可诱导形成一种依赖CREB转录的巩固型长期记忆，可持续长达一周。无间隔的训练（即集中训练）则会形成一种麻醉抗性记忆（ARM），与长期记忆类似，通常在完成5个训练周期后的24小时进行检测7,13,15-17,20,21。

利用该方法，可以确定不同基因突变对记忆各个阶段的影响。通过启动子驱动光敏感或温度敏感的转基因表达，以激活或抑制特定神经元的神经活动，从而研究哪些神经元参与了记忆的获取、巩固和提取过程3,4,11,15,16,20,22-241小时时的记忆通常在研究与年龄相关的记忆损伤时进行测量，因为这种记忆形式似乎特别容易受到衰老的影响。11-13在记忆实验中会进行一系列行为学和遗传学对照，例如，用于确定表现缺陷是源于中枢记忆缺陷，还是源于外周感觉缺陷（后者会阻碍果蝇感知电击或嗅觉线索）。5-7,17,25,26.

方案

1. 果蝇准备

  1. 对所有突变体进行杂交 Gal4/UAS 以及其他带有野生型菌株的品系，例如 CSw-在行为实验前至少进行六代遗传背景控制26.
  2. 在标准的玉米粉、酵母和糖蜜培养基中饲养果蝇，置于25 °C、12小时光照与12小时黑暗交替的条件下，除非特定实验操作需要其他温度。
    1. 为确定转基因表达的影响：使用 18 °C 以抑制转基因的表达 Gal4 Gal80ts （TARGET系统）发育完成后，将果蝇转移至30 °C培养箱中，行为学实验前1-2天开始培养。在30 °C条件下进行实验，以检测转基因表达的效果3,4,6,7,14.
    2. 对于使用热激活型TRPA1通道刺激神经元的实验：将果蝇饲养在23 °C条件下，该温度可维持通道处于非活性状态，随后转移至30 °C的行为实验室内以激活表达TRPA1的神经元。
    3. 对于使用以下条件的实验 Shibire温度敏感 阻断突触输出11,14,24：在 18 °C 下培育果蝇，并在 30 °C 下进行测试。
  3. 在实验前1-2天收集果蝇，在轻度CO₂麻醉下将果蝇按每组约25只进行计数2 麻醉。将果蝇在25 °C、70%相对湿度、12小时光照:12小时黑暗的环境控制室内，置于食物小瓶（不含酵母）中至少饥饿处理过夜，直至实验时使用（除非特定操作需要其他温度条件）。
    注意：此储存步骤可使果蝇适应后续在环境受控室中进行的学习测试，该环境受控室具备实验所需的最适条件 果蝇 学习，更重要的是，消除了可能影响行为表型的任何日常环境变化。

2. 实验前准备

  1. 在定制的亚克力T型迷宫中进行实验（图1）。
  2. 定期检查管路连接，确保实验过程中达到气密密封。如有必要，更换用于密封T型迷宫内部隔室的O型密封圈。
  3. 在训练管内放置定制的铜网。定期检查并清洁这些铜网，若发生氧化则及时更换。通过鳄鱼夹将铜网连接至导线，导线连接至与电刺激器相连的开关盒。使用电压表确认装置能够提供所需的电击刺激。
  4. 使用G型夹将迷宫牢固固定，以避免任何空气泄漏。
  5. 将T型迷宫连接至通向空气泵的管路，以便将气味输送至果蝇所在区域，并随后从T型迷宫中排出。维持约2 L/min的轻微气流。

3. 气味稀释

  1. 使用两种不同气味的物质，其浓度应使果蝇对两种气味表现出相等的偏好。可使用4-甲基环己醇（1:67）和3-辛醇（1:100），用矿物油稀释7,13。
    注意：这些浓度需谨慎确定，可能因实验室条件不同而有所差异。例如，其他研究中使用两种气味均为1:10的稀释比例24。其他常用气味包括乙酸乙酯和异戊基乙酸酯。
  2. 将30 μl 稀释后的气味溶液用移液器加入自制的气味杯中，该气味杯置于气味块内，并用顶部带孔的塑料管覆盖，使气流可通过气味杯上方，从而使果蝇暴露于气味羽流中。

4. 训练方案（图1和图2）

  1. 进行成年果蝇嗅觉休克条件化实验时，所有操作均应在暗红光下（i.e., 红色LED灯）进行，这种光照条件允许研究人员观察，但果蝇无法感知，从而使其注意力集中于嗅觉而非视觉输入。
  2. 将果蝇引入训练管后， 连接 至T型迷宫，并让果蝇在训练管中适应气流90秒。
  3. 给予第一种气味（4-甲基环己醇，MCH）的同时施加60 V电击（包含12次1.25 秒脉冲，脉冲间间隔3.75 秒），持续60秒。
  4. 电击结束后，进行30 秒无气味和电击的静息期。
  5. 给予第二种气味（3-辛醇，OCT）60秒，不施加电击。
  6. 电击结束后，再进行30 秒无气味和电击的静息期。
  7. 将T型迷宫侧放，并轻轻在软表面（如旧鼠标垫）上敲击其底部，使果蝇从训练室转移至T型迷宫的中央室。让果蝇在中央室中停留90秒。
  8. 将选择管安装至装置底部，构成T型迷宫结构。
  9. 为测量学习能力，将果蝇转移至T型迷宫的选择点，在此同时暴露于两种气味中，任其选择移动方向。测试持续120秒。
  10. 通过向上滑动中央室以封闭选择管末端，将果蝇困于选择管内。分别收集T型迷宫两臂及中央隔室中的果蝇至食物管中并计数。
  11. 为测量记忆能力，在训练结束后（步骤4.6）收集果蝇，并将其从T型迷宫转移至不含酵母的食物管中。在25 °C、70%湿度的黑暗环境中饲养，直至达到所需检测的记忆阶段时间（见引言部分）。随后按照步骤4.7重新将果蝇引入T型迷宫进行测试。
  12. 对于长期记忆实验，使用定制迷宫装置，可同时训练多批果蝇。进行5轮训练，每轮之间间隔15 分钟 （间隔训练），或无间隔（集中训练）。训练后将果蝇在18 °C、70%湿度的黑暗环境中饲养直至测试。测试前将果蝇转移至25 °C环境，使其适应至少1小时。在训练后24小时评估长期记忆。
  13. 行为实验结束后，用热水和无味洗涤剂清洗气味杯。干燥后，在杯内加入10 μl sigmacote进行包被。将sigmacote置于微波炉中加热干燥。定期用热水和无味洗涤剂清洗T型迷宫的有机玻璃管和气味模块。

5. 表现指数的计算：果蝇记忆能力的衡量指标

  1. 计算每种条件下的表现指数（Performance Index, PI），即避开与电击配对的气味（CS-）的果蝇数量减去选择与电击配对的气味（CS+）的果蝇数量，再除以果蝇总数（CS- + CS+）1。
    表现指数（PI）=（CS- 果蝇数 - CS+ 果蝇数）/（果蝇总数）
  2. 通过取MCH作为电击配对气味的实验PI值与OCT作为电击配对气味的实验PI值的平均值，计算实验的最终PI值。此方法可消除果蝇对某一特定气味偏好更强所带来的偏差。

6. 感觉运动控制

  1. 通过将约40-50只果蝇引入T型迷宫来检测嗅觉敏锐度6,7,17。
  2. 90秒后，将果蝇转移至选择点，使其有2分钟 时间在纯气味与空气之间进行选择。
  3. 收集并计数果蝇。通过将选择气味的果蝇总数除以参与测试的果蝇总数，计算回避百分比。
  4. 对于电击反应性6,7,17，将果蝇引入电击室。
  5. 静置90秒后，施加60 V直流电击，果蝇可逃至一个无电击的相似试管中。
  6. 给予2分钟 时间供果蝇选择；收集并计数果蝇。通过将逃离电击管以避免电击的果蝇数量除以实验中果蝇的总数，计算电击回避百分比。将停留在中央室的果蝇计入成功逃离电击的总数中。

结果

性能指数（PI）用作衡量记忆能力的指标。表1展示了一个典型的PI计算示例。

MCH 与电击配对3-OCT 与电击配对
避开 MCH（位于 OCT 管中）的果蝇数 = 80
偏好 MCH（位于 MCH 管中）的果蝇数 = 20
PI1 = (80-20)/(80+20)
= 0.6		避开 OCT（位于 MCH 管中）的果蝇数 = 75
偏好 OCT（位于 OCT 管中）的果蝇数 = 25
PI2 = (75-25)/(75+25)
= 0.5
本实验的 PI = (0.6 + 0.5) / 2 = 0.55

表1. 使用示例数据计算性能指数的代表性示例。 可通过比较不同实验的性能指数来阐明记忆效应。这种比较如图3所示，其中包含了使用Canton S野生型成年果蝇（WT）和dunce学习缺陷突变型成年果蝇1进行的一系列实验的结果。图中提供了10个性能指数（PI）的平均值，误差线表示平均值的标准误（SEM）。这些结果表明，与野生型果蝇相比，dunce果蝇的学习能力有所下降。

操作性条件反射过程示意图；训练、休息、测试阶段；行为心理学实验。
图1. 成年果蝇实验装置。 果蝇在T型迷宫中接受训练和测试。训练阶段包括将气味A与电击配对呈现，随后呈现无电击的气味B。经过中间腔室的休息期后，同时向果蝇呈现两种气味。果蝇被分别困在两个收集管中，随后进行收集和计数，以获得学习/记忆评分。

经典条件反射示意图：CS+与US的训练；CS-的测试；时间进程可视化。
图2. 成年果蝇训练流程。 果蝇的训练分为两个步骤。第一步中，果蝇接受一种气味（CS+）与电击（US）配对刺激，持续60秒；在下一步中，果蝇接受第二种气味（CS-），不伴随电击。随后让果蝇休息90秒，之后测试其对CS+与CS-之间的选择偏好。

Bar graph comparing learning performance index in dnc vs. WT flies; experiment shows WT higher.
图3. 代表性图表显示 笨蛋 以及成年野生型学习 果蝇 野生型和 笨蛋 果蝇在经历一次训练后进行测试。 笨蛋 与野生型相比，果蝇的学习能力下降（n = 10）。

讨论

本文介绍的Drosophila成年果蝇嗅觉电击学习实验可用于分析记忆不同阶段（包括长期记忆15-17）背后的分子机制，同时可用于确定昼夜节律18、睡眠19、饮食20,21、衰老11-13、神经退行性疾病5以及药物处理5,6,19对记忆的影响。

近年来，已开发出多种强大的方法，用于对介导果蝇嗅觉记忆的神经回路进行功能成像3,4,7,11,16,27。这些光遗传学技术利用了黑腹果蝇（Drosophila）中丰富的各类启动子资源14,16，通过这些启动子在记忆神经元中表达基因编码的钙离子和cAMP报告分子16,27，以研究特定基因突变对记忆痕迹的影响。

在成体中使用条件性启动子和突变可研究基因产物在记忆中的发育后功能3,4,6,7,13,14。成像和行为学方法可与光激活或热激活通道相结合，用于刺激或抑制记忆环路中的不同神经元11,14,16,22-24，从而进一步阐明其功能。此外，蘑菇体记忆神经元可进行全细胞膜片钳记录28，并且目前正采用数学与计算技术对果蝇（Drosophila）嗅觉记忆进行建模29。

这些实验进展，结合本文介绍的多种联想记忆范式，使得果蝇（Drosophila）可用于模拟在奖赏、惩罚、动机、成瘾、衰老和疾病条件下联想记忆所发生的分子和神经环路水平的变化5,6,11-13,16,30-31。

披露

作者无任何利益冲突需要披露。

致谢

我们感谢布卢明顿果蝇品系中心提供的果蝇品系。本研究得到了英国生物技术和生物科学研究生理事会（BBSRC）研究基金（BB/G008973/1）的支持。

材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
3-辛醇Sigma218405
4-甲基环己醇Sigma15309-5
苯甲醛Sigma418099
矿物油FlukaBP2629-1
乙酸己酯Sigma108154
果糖SigmaF0127
琼脂糖BiolineBIO-41025

参考文献

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