我们开发了一种独立的液体池，可在透射电子显微镜中实现液体环境下的成像。该技术能够以亚纳米分辨率实时揭示纳米颗粒在液体中的动态过程。
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摘要
摘要
原位透射电子显微技术的最新发展使得通过液体进行高空间分辨率成像成为可能，在材料科学、物理学、化学和生物学等研究领域引起了广泛关注。该技术的关键在于液体池。我们通过一系列微加工工艺制备带有薄观察窗的液体池，包括氮化硅薄膜沉积、光刻图形化、晶圆刻蚀、池体键合等步骤。尺寸与常规透射电镜载网相同的液体池可适配于任何标准透射电镜样品 holder。约100纳升反应溶液被加载至储液腔中，并通过毛细作用将约30皮升液体吸入观察窗区域。随后，将液体池密封并装入显微镜中进行原位成像。在透射电镜中，电子束穿过由两层氮化硅膜夹持形成的薄液层。研究人员已以亚纳米分辨率实时观察了液体中纳米颗粒的动态过程，例如纳米晶体的成核与生长、纳米颗粒的扩散与组装等。我们还将此方法应用于其他研究领域，例如，在水中对蛋白质进行成像。液体池透射电镜有望在揭示材料在实际工作环境中的动态行为方面发挥重要作用，同时也可能对生物体系在其天然环境中的生命过程研究产生重大影响。
引言
实时研究液体中的化学反应以及在生物材料的天然环境中对其进行成像，一直是各研究领域的重大关注方向1-5由于透射电子显微镜（TEM）具有高空间分辨率，利用TEM对液体样品成像已受到广泛关注4,5然而，使用透射电子显微镜对液体样品进行成像一直面临巨大挑战，因为传统显微镜需在高真空环境下运行。此外，液体样品必须足够薄，以允许电子束穿透。Williamson 等6 报道指出，使用在透射电子显微镜中运行的电化学液体池，可实现对铜电化学沉积过程的成像，空间分辨率达到5 nm。De Jonge 等1 能够利用扫描透射电子显微镜（STEM）对数微米厚的水层中的生物样品进行成像。由于使用了金纳米颗粒作为成像标记物，生物样品对比度低的问题未被视作障碍。同时，较厚的液体样品也未构成问题，因为采用了STEM成像模式，并实现了纳米级分辨率。我们近期开发了一种自封闭液体池，可实现对液体中胶体纳米颗粒的原位实时透射电子显微镜观察，并达到亚纳米分辨率。5,7这些新开发的液体池可实现更高的分辨率和更快的透射电子显微镜成像（每秒30帧，此速度尚未通过高分辨率扫描透射电子显微成像实现），使得在液体环境中研究胶体纳米颗粒的动力学行为成为可能。这些液体池可适配标准透射电镜样品 holder，能够像常规透射电镜样品一样操作。仅需极少量液体（约30皮升）即可进行检测。 原位 在延长的化学反应条件下。多种成像与分析（即，能谱X射线分析技术）可用于检测。由于观察窗口的总厚度（包括膜和液体层）可控制在100 nm或以下，因此可实现对生物样品的直接成像（即 在无需金纳米颗粒标记的情况下，于液态水中检测蛋白质也已实现 8.
在过去二十年中，胶体纳米晶体的合成与应用取得了显著进展9-11然而，关于纳米颗粒在液体中如何成核、生长以及彼此相互作用的理解在很大程度上仍依赖经验性知识，且主要基于异位分析。11-13我们开发的液体池透射电子显微镜为研究纳米颗粒在液体中的动态过程提供了独特的平台 原位5,7,14,15.
我们采用超薄硅晶圆（100 μm）通过一系列微加工工艺制备了一种自包含式液体池。该工艺包括氮化硅薄膜沉积、光刻图形化、晶圆刻蚀、间隔层沉积以及液体池键合等步骤。将约50纳升的反应溶液加载至储液池中，溶液通过毛细作用被吸入液体池内。随后，向另一个储液池中加入50纳升的液体。之后将液体池密封并装入显微镜进行观察 原位 成像。在显微镜内部，夹在两层氮化硅膜之间的液体（总体积约30皮升）可被观察。当电子束穿过薄液层时，可实时监测液体中纳米颗粒的动态过程。在某些情况下，电子束可诱导纳米颗粒的成核与生长。5,7 或由外部热源引发反应14,16当电子束损伤成为关注问题时，应使用较低的电子束电流（剂量）。
由于液体池采用硅基微加工工艺批量制备，各个液体池之间的膜厚或液体层厚度差异可以很小l6任何具备基本微加工技术培训的研究人员均可成功制备液体腔室。液体操作技术及 原位 透射电子显微镜的操作经过练习后也可掌握。需要注意的是，除了使用氮化硅膜作为观察窗口外，其他材料如二氧化硅、硅或碳（包括石墨烯）也可用作窗口膜17-19. 由于我们使用的液体池具有较小的观察窗口， 即，1个50 μm，未观察到膜出现鼓胀现象。此外，液体池操作也具有良好的稳定性， 即 实验过程中，液体池中破裂的窗口比例低于1%。此外，通过改变沉积的铟垫片厚度，可灵活调节液体层的厚度。在样品制备过程中，密封的液体池可保持液体数天不发生泄漏。少量液体可在电子束下稳定观察数小时，从而实现实时研究长时间化学反应过程。
迄今为止，我们已观测到液体中纳米颗粒的多种独特动态过程，例如铂（Pt）纳米颗粒的生长与融合5,15、纳米颗粒在薄层液体中的扩散20,21、铋（Bi）纳米颗粒的生长波动14，以及由纳米颗粒作为构筑单元生长形成的 Pt3Fe 纳米棒7等。此外，我们还将该方法应用于其他领域，例如，在液态水中以 2.7 nm 分辨率对蛋白质进行成像8。总之，我们的液体池透射电子显微镜（TEM）技术已被证实是材料科学、物理学、化学和生物学中诸多基础问题研究的一项极为有价值的进展。我们认为，液体 TEM 技术在未来仍有广阔的技术提升与应用空间，必将对广泛的科学研究产生重大影响。
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方案
1. 液体池的微加工
- 准备硅晶圆（p型掺杂，厚度为100 μm，直径为4英寸），并使用标准晶圆清洗浴程序清洗晶圆。
- 采用低压化学气相沉积（LPCVD）方法在硅晶圆的两侧沉积低应力氮化硅薄膜（厚度为20 nm）。沉积过程中使用自行开发的工艺配方，可生长富硅氮化物（SiNx，x<4/3）。
- 通过一系列标准 fabrication 工艺（包括光刻图形化、使用SF6作为活性气体对SiNx膜进行等离子体刻蚀、对暴露的硅晶圆进行KOH湿法刻蚀等），制备带有观察窗（1 × 50 μm）的底芯片（2.6 × 2.6 mm；直径3 mm）和带有观察窗（1 × 50 μm）及两个储液池（0.6 × 1.2 × 0.1 mm）的顶芯片（2.6 × 2.6 mm；直径3 mm）。我们采用最常见的光刻工艺，例如旋涂光刻胶（正性光刻胶，转速3,000 rpm，持续1分钟；光刻胶厚度约为1 μm）、在液体池铬掩模下进行紫外曝光、使用显影液和定影液（去离子水）进行光刻图形化等。旋涂所用光刻胶和显影所用显影液有多种选择，相应工艺参数也可能有所不同。由于图形特征尺寸较大（数百μm或更大），该工艺易于实现。KOH溶液通过将氢氧化钾粉末按氢氧化钾:水质量比1:2溶解于去离子水中配制而成。刻蚀过程中KOH溶液保持在80 °C，可实现约1 μm/min的刻蚀速率。SiNx膜是KOH刻蚀硅时理想的保护掩模。由于采用刻蚀线设计，在KOH刻蚀后各个芯片通过晶圆上的细线连接。可通过尖头镊子轻松将芯片从晶圆上分离，用于后续操作，无需进行划片处理。
- 在底芯片的平坦侧沉积铟 spacer。首先，按照步骤1.3中的类似工艺对芯片进行光刻图形化。为便于芯片操作，将单个芯片（或若干芯片组成的碎片）用光刻胶粘附在薄玻璃片上，旋涂、紫外曝光等步骤前在空气中干燥5分钟。其次，使用50瓦O2等离子体清洗1分钟对图形化后的芯片进行清洗；第三，使用蒸发仪在芯片上沉积厚度为100 nm的铟薄膜；第四，进行剥离（lift-off）工艺以形成铟 spacer。
- 将底芯片与顶芯片键合在一起。首先在光学显微镜下对齐底芯片和顶芯片的两个氮化硅观察窗，并使用夹具施加约0.1 MPa的压力。精确对齐两个窗口需要一定操作经验。随后，将液体池置于120 °C的真空烘箱中烘烤1小时。最后，收集液体池，并将制备好的液体池存放在真空干燥器中以备后续使用。
整个 fabrication 过程如图1所示。我们所有 fabrication 过程均在美国加州大学伯克利分校的纳米 fabrication 实验室中进行。
2. 反应溶液的制备
以制备生长Pt3Fe纳米棒的反应溶液为例。将乙酰丙酮铂(II)（20 mg/ml）和乙酰丙酮铁(II)（20 mg/ml）溶解于十五烷与油胺的混合溶剂（7:3 体积比）中，或溶解于十五烷、油胺和油酸的混合溶剂（6:3:1 体积比）中，用于比较表面活性剂效应。
3. 加载反应溶液
- 使用注射器和聚四氟乙烯纳米管（购自 Cole-Parmer，IL）将约 50 nl 反应溶液加载到液体池的一个储液池中。然后以相同方式填充另一个储液池。
- 约 30 pl 的反应溶液通过毛细作用被吸入池内，在观察窗口处形成夹在两层氮化硅膜之间的液体层（厚度约 100 nm）。
- 随后使用一层薄铜盖（约 50 μm 厚的透射电镜网格，带有一个直径为 0.6 mm 的单槽孔，购自 Ted Pella, Inc.）对液体池进行密封。在盖子的一侧涂抹真空润滑脂，并使用环氧树脂密封液体池的边缘。最终液体池的总厚度约为 250–300 μm。
4. 将液体池装入透射电子显微镜
- 使用一台在300 kV下运行的JEOL 3010透射电子显微镜和一台在200 kV下运行的FEI单色器F20 UT Tecnai进行 原位 成像
- 将液体池作为标准的透射电子显微镜样品装入显微镜中进行成像。
5. 实时透射电子显微镜成像
- 将透射电子显微镜调节至理想的高分辨率成像条件，并在实时成像过程中保持 1–8 × 105 A/m2 的束流密度。
- 对于 PtFe 体系，通过将电子束照射到液层上可引发纳米颗粒的形核与生长。
- 采用 VirtualDub 软件结合 Gatan DigitalMicrograph 软件记录纳米颗粒的动力学过程。
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结果
通过使用液体池透射电子显微镜（liquid cell TEM）方法，我们实现了对Pt3Fe纳米棒从纳米粒子构筑单元在溶液中生长过程的可视化观察。图2展示了在不同溶液条件下Pt3Fe纳米棒生长轨迹的一系列连续图像。采用Photoshop进行伪彩处理以突出显示纳米粒子。
当使用十五烷与油胺的溶剂混合物（7:3 体积比）时，可观察到三个明显的生长阶段（图 2A）。首先，在电子束辐照下，铂和铁前驱体被还原，形成大量小的纳米颗粒；其中一些通过单体附着方式生长，另一些则发生聚结。其次，纳米颗粒之间相互作用，形成较短的纳米颗粒链。第三，这些新形成的短纳米颗粒链作为结构单元，进一步组装成相对较长且呈蜿蜒状的纳米颗粒链。当使用十五烷、油胺和油酸的混合溶剂（6:3:1 体积比）时，首先形成蜿蜒的纳米颗粒链，随后这些纳米颗粒链在短时间内迅速变直，并形成单晶纳米棒（图 2B）。
综上所述，我们展示了单晶纳米...
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讨论
所有制造过程均在洁净室中完成，洁净室是用于制造半导体器件的场所。
在沉积铟之前，必须对芯片进行O2等离子体清洗，以去除表面的有机残留物。这样可以获得高质量的铟隔离层，从而改善上下芯片之间的键合效果，并提高无泄漏液体池的制备成功率。
厚度约为13 nm的氮化硅超薄膜观察窗是实现高空间分辨率的关键。在处理此类液体池时，需格外小心，以避免在制备及实验过程中损坏薄膜。例如，建议使用前端平整的镊子。在薄膜清洗过程中，可采用低功率和低剂量的O2等离子体处理（即，30 W，持续20–30秒）。由于生长动力学可能高度依赖于电子束电流密度，因此在成像过程中保持相同的电子束电流密度至关重要。液体池透射电子显微镜（TEM）方法不仅能够实现实时研究溶液中纳米晶体的生长动力学，还可揭示其他动态过程（即，纳米颗粒在液体中的扩散、液滴动力学等）。此外，该方法为在天然环境中可视化生物过程提供了有前景的途径。
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致谢
Zheng 感谢 A. Paul Alivisatos 教授和 Ulrich Dahmen 博士在 EM 液体池早期开发过程中提供的有益讨论。她对美国能源部科学办公室早期职业研究计划的支持表示感谢。
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 试剂 | |||
| 乙酰丙酮铂(II) | Aldrich | 523038 | |
| 乙酰丙酮铁(II) | Aldrich | 413402 | |
| 十五烷 | Aldrich | P3406 | |
| 油胺 | Aldrich | O7805 | |
| 油酸 | Sigma | O4137 | |
| 设备 | |||
| 透射电子显微镜（TEM） | JEOL | JEOL 3010 | |
| 单色透射电子显微镜（Monochromated TEM） | FEI | F20 UT Tecnai |
参考文献
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