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从环境中采集、分离与富集天然存在的趋磁细菌

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DOI：

10.3791/50123

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2012年11月15日

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1School of Earth Sciences, The Ohio State University, 2School of Environment & Natural Resources, The Ohio State University, 3Institute of Geology and Geophysics, Chinese Academy of Sciences

本文内容

摘要

我们展示了一种可用于天然水体的趋磁细菌（MTB）收集方法。利用细菌自身的天然磁性，可通过相对简单的装置从沉积物样品中分离并富集趋磁细菌。分离得到的趋磁细菌可进一步通过光学显微镜和电子显微镜进行详细观察。

摘要

趋磁细菌（MTB）是一类水生微生物，最早于1975年从美国马萨诸塞州盐沼沉积物样品中被显著描述1。此后，人们在全球各地分层的水体和沉积物剖面中均发现了MTB2。所有MTB的一个共同特征是含有磁小体，即细胞内由膜包裹的磁铁矿（Fe3O4）和/或硫铁矿（Fe3S4）或两者兼有的磁性纳米晶体3,4。在北半球，MTB通常被条形磁铁的南极吸引，而在南半球则通常被磁铁的北极吸引3,5。在尝试从环境样品中分离MTB时，可利用这一特性。

富集趋磁细菌（MTB）最常用的方法之一是使用透明塑料容器从自然水源（如淡水池塘）中采集沉积物和水样。在北半球，将条形磁铁的南极置于容器外侧，紧靠沉积物-水界面处的沉积物上方。经过一段时间后，可用移液器从容器内靠近磁铁的位置吸取细菌，再通过毛细管竞速法6结合磁铁进一步富集。富集完成后，可采用悬滴法将细菌置于显微镜载玻片上，用光学显微镜观察，或将其沉积到铜网上，利用透射电子显微镜（TEM）进行观察。

利用该方法，可通过显微镜研究分离的趋磁细菌（MTB），以确定其特征，如运动行为、鞭毛类型与数量、细胞形态、磁性晶体形状、每个细胞中磁小体的数量、磁小体链的数量、纳米矿物晶体的组成以及细胞内囊泡的存在情况。

方案

1. 结核分枝杆菌收集

  1. 在选择淡水环境以采集趋磁细菌（MTB）时，通常最好从具有松软泥质沉积层的池塘或缓流溪流开始。在本演示中，我们在俄亥俄州立大学（OSU）校园内的奥伦坦吉河（Olentangy River）边缘采集了样本（美国俄亥俄州哥伦布市）。尽管该地点便于我们的演示，但此处描述的实验方案适用于任何水生环境。本方案中使用的材料见表1。选择水深在10至100 cm之间的地点，使用透明带螺口盖的容器采集最表层的沉积物。将沉积物和水一同舀入容器中，使容器内沉积物占总体积的三分之一至二分之一，其余空间充满水。在容器完全浸没于水中时将其注满，然后立即用螺口盖紧密封。无需搅拌沉积物。用毛巾擦干容器外壁，随后将样本带回实验室。无需急于将样本送回实验室。我们曾将MTB样本置于塑料容器中，在野外存放数天后再带回实验室。只要将样本储存在野外阴凉避光处，MTB可保持活性数周至数月。
  2. 样本送回实验室后，松开瓶盖但仍保留其覆盖在容器上，以减少蒸发。将容器置于室温下的暗室、抽屉中，或用铝箔完全包裹容器以避光。让沉积物和细小颗粒在静置数小时至数天的过程中完全沉降至容器底部。无需搅拌沉积物，因为MTB更倾向于不受干扰的环境。塑料容器的透明壁面可便于观察颗粒是否已完全沉降。根据样本情况，MTB可在样本中存活数月之久。

2. 结核分枝杆菌分离

  1. 当准备分离磁小体细菌（MTB）时，将磁铁放置在塑料容器的两侧，位置大约在沉积物-水界面以上1 cm处（图1A）。注意不要扰动容器底部的沉积物。将一根条形磁铁的南极置于容器的一侧，另一根条形磁铁的北极置于对侧（图1A）。几乎任何类型的磁铁均可使用，例如磁力搅拌子或大型冰箱磁铁。可使用任意物体将磁铁固定在沉积物-水界面上方的合适高度。我们发现将磁铁放置在纸板或塑料盒顶部效果最佳，但也可将磁铁用胶带固定在塑料容器外壁。静置30分钟至数小时，使细菌游向磁铁。
  2. 使用无菌移液管小心地从容器内靠近南极条形磁铁位置处（适用于在北半球采集的样品）吸取水样（图1A）。该水样应含有被南极磁铁吸引的MTB。接下来应使用毛细管富集装置进一步富集MTB。

3. 结核分枝杆菌跑道实验

  1. 为了富集样本中的趋磁细菌，需要使用毛细管赛道（图1B和1C）。这些赛道需在从透明塑料容器中分离细胞之前制备。
  2. 使用一支5.75英寸（146 mm）的玻璃巴斯德移液管制作赛道。用金刚石笔或锉刀切去移液管顶部，移液管的长度并非关键，但应能容纳约1–2 mL水。接着，使用本生灯将管尖熔化，使其密封（图1C）。最终的移液管应一端开放，另一端密封。
  3. 制备多个此类赛道，并进行高压灭菌。此外，还需对棉花和数根长金属针进行高压灭菌。
  4. 使用连接无菌滤器注射器的长金属针，将从图1A所示沉积物-水界面附近采集的过滤水样加入已灭菌的赛道中。滤膜孔径应为0.22 mm，以去除水中的碎屑和污染物。必须确保玻璃毛细管内无任何气泡。
  5. 用无菌棉花堵住赛道底部（图1B）。使用金属针将棉花推至赛道的密封端，使其距离密封端0.5–1 cm（图1C）。
  6. 使用无菌移液管，将含趋磁细菌的水样（来自第2.2节）加入已准备好的趋磁细菌赛道的样品储液端（开放端）（图1B）。

4. 结核分枝杆菌富集

  1. 当样品液充满泳道后，将其侧放在水平表面（例如，实验台）上，并将条形磁铁的南极（在北半球）置于泳道封闭端附近（例如，靠近泳道尖端）（图1B和1C）。
  2. 等待5至30分钟，使趋磁细菌（MTB）穿过棉塞。随后应收集泳道尖端附近的液体。等待时间过长可能会引入污染物，例如其他可运动的细菌，进入毛细管尖端。可选地，可使用光学显微镜观察泳道尖端，查看趋磁细菌在泳道尖端的聚集情况。这有助于确定趋磁细菌穿过棉塞所需的时间。
  3. 轻轻使用金刚石刀在棉塞附近划出小刻痕，然后折断泳道的末端。
  4. 使用带有细针头（25或27号）的1 ml注射器从泳道尖端吸取液体。此液体样品中应已富集了趋磁细菌（MTB）。

5. 通过光学显微镜观察结核分枝杆菌

  1. 将富集后的 MTB 样本一滴（10–20 μl）置于盖玻片上。
  2. 迅速将盖玻片翻转，使液滴朝下并悬挂在盖玻片下方。
  3. 将盖玻片放置在位于载玻片上的 O 形圈上。O 形圈的直径应略小于盖玻片（约 1 cm；图 2）。
  4. 将此悬滴置于光学显微镜载物台上，聚焦于液滴的一侧边缘。使用 60 倍干镜效果很好，因为大多数此类物镜具有较高的数值孔径（NA；例如，0.93），且无需使用油镜，而油镜在悬滴法中难以操作（图 2）。
  5. 将条形磁铁的南极靠近悬滴，MTB 将开始向靠近磁铁一侧的液滴边缘迁移（图 3）。数分钟内，大量 MTB 应已聚集在液滴边缘（图 3）。通过反转磁铁的磁极并观察细菌向相反方向游动，可验证这些细菌具有磁性。

6. 透射电子显微镜（TEM）观察结核分枝杆菌

  1. 将一滴富集后的磁小体细菌（约 20 μl）置于铜网上，静置 10 分钟，使细菌沉降。
  2. 用干净的滤纸吸去多余的液体。
  3. 可选步骤：铜网可用 2% 醋酸铀、2% 磷钨酸（pH 7.2）或 2.5% 钼酸钠进行负染色7, 8, 9。具体操作是在铜网与富集的磁小体细菌孵育后，立即将其置于染色液液滴上。染色时间根据所用染色剂的不同而有所变化，随后用干净的滤纸吸去多余液体。
  4. 使用透射电子显微镜（TEM，图 4）观察磁小体细菌。本研究所用样品中，磁小体细菌吸附于 Formvar 稳定并碳镀膜的 200 目铜网（Ted Pella #01800）。将铜网碳面朝下置于细胞悬液液滴上，孵育时间最长为 10 分钟，随后将铜网在水滴上放置 30 秒进行一次清洗。染色时，将铜网置于 2% 醋酸铀液滴（Ted Pella #19481）中 30 秒至 5 分钟，然后用滤纸彻底干燥。使用 FEI Tecnai Spirit（80 kV）或 FEI Tecnai F20（采用 200 kV 高角环形暗场扫描透射电子显微镜模式）进行 TEM 分析。

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结果

磁铁是一种有效的工具，可用于分离环境样品中含有的趋磁细菌（MTB）（图1A）。毛细管环道（图1B）利用趋磁细菌的磁性，使其穿过棉塞被富集，从而与环境样品中其他非趋磁微生物分离开来。

磁分离过程示意图：使用条形磁铁进行沉积物与水的分离；实验装置。
图 1. 一个透明塑料瓶，内含从美国俄亥俄州哥伦布市奥伦坦吉河（Olentangy River）采集的沉积物和水样。瓶中约一半为沉积物，一半为水。将条形磁铁的南极置于沉积物上方约1 cm处，持续数小时（A）。从容器内靠近磁铁的一侧移除部分液体后，将其放入毛细管环道中，趋磁细菌（MTB）通过棉塞（箭头）向条形磁铁的南极游动（B）。毛细管环道的放大图，...

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讨论

趋磁细菌并非在所有水生环境中都必然存在8，但当其存在时，其浓度通常约为每毫升100至1,000个细胞2。为了通过光学显微镜观察趋磁细菌，样品中至少需要约50个细菌/毫升8。如果样品中没有或仅有极少量的趋磁细菌，则需要选择新的环境采样点采集样品，或者尝试下一部分中讨论的一种或多种富集技术。

首先，应尝试使用一个大型塑料桶从环境中采集更多的沉积物8。如果需要大量不可培养的MTB，则此方法尤为有用。根据环境样本的不同，在采集样本后可能无法立即获得浓度为50个细菌/ml的MTB样本。因此，当将环境样本带回实验室后，建议在使用条形磁铁分离MTB之前，先让样本适应实验室条件一段时间。这一适应期有助于细菌群落成熟并重新增殖，从而提高MTB的浓度。另一种常可获得更高浓度MTB样本的简单技术是将条形磁铁放置在样本容器的侧壁图1A）更长的时间（例如，数天）。这将使分枝杆菌有更充足的时间迁移至磁铁处。另一种可能有效的最终技术是使用多个环形培养皿（图...

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披露

未声明任何利益冲突。

致谢

本工作获得了美国国家科学基金会（EAR-0920299 和 EAR-0745808）的资助；美国国家科学基金会东亚及太平洋暑期研究所项目；美国地质学会研究资助计划；以及俄亥俄州立大学校友研究生研究与奖学金项目的支持。我们感谢编辑和两位匿名审稿人提出的富有见地的评论。

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材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
载玻片Fisher ScientificS95933
玻璃巴斯德吸管Fisher Scientific13-678-6A
O型圈五金店
盖玻片Fisher Scientific12-542B
条形磁铁Fisher ScientificS95957
容器任意任何可密封且容积不少于0.5 L的塑料或玻璃容器
棉花任意
配备60倍干镜的显微镜Zeiss60倍干镜并非绝对必要，但可在不使用浸油的情况下获得较高的数值孔径（NA）
金刚石刻划笔Fisher Scientific08-675
0.22 mm 滤膜Fisher Scientific09-719C
1 ml 注射器Fisher ScientificNC9788564
微量离心管Fisher Scientific02-681-320
Formvar/碳支持膜，200目铜网Ted Pella Inc.01800
醋酸铀酰Ted Pella Inc.19481
Tecnai Spirit 透射电子显微镜FEI
Tecnai F20 扫描/透射电子显微镜FEI

参考文献

  1. Blakemore, R. Magnetotactic bacteria. Science. 190, 377-379 (1975).
  2. Blakemore, R. P. Magnetotactic bacteria. Annual Reviews in Microbiology. 36, 217-238 (1982).
  3. Bazylinski, D. A., Frankel, R. B. Controlled Biomineralization of Magnetite (Fe3O4) and Greigite (Fe3S4) in a Magnetotactic Bacterium. Applied and Environmental Microbiology. 61, 3232-3239 (1995).
  4. Lefevre, C. T., Menguy, N., et al. A Cultured Greigite-Producing Magnetotactic Bacterium in a Novel Group of Sulfate-Reducing Bacteria. Science. 334, 1720-1723 (2011).
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