本文详细且直观地描述了一种在剖宫产术后手术切口部位收集和测定生化炎症及伤害性感受介质的方法。该人体生物测定方法已被用于确定伤口与血清细胞因子浓度之间的相关性，以及药物介导的伤口细胞因子、趋化因子和神经肽变化。
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本文内容
摘要
摘要
我们介绍一种方法，可用于采集并测定手术切口部位的生化性炎症与伤害性感受介质。采集特定部位的生化标志物，对于理解血清与手术切口介质水平之间的关系、确定介质释放与疼痛、镇痛药使用及其他关注结局之间的关联，以及评估全身性和外周药物给药对手术切口生化环境的影响具有重要意义。该方法已应用于接受择期剖宫产并采用脊髓麻醉的健康女性。我们在患者术后48小时内，同步采集伤口渗出液和血清样本，并记录其疼痛评分及镇痛药物消耗情况。利用该方法，我们已检测到多种生化介质，包括神经生长因子（NGF）、前列腺素E2（PG-E2）、P物质、IL-1β、IL-2、IL-4、IL-6、IL-7、IL-8、IL-10、IL-12、IL-13、IL-17、TNFα、INFγ、G-CSF、GM-CSF、MCP-1和MIP-1β。应用此人体手术伤口生物测定方法的研究发现，伤口与血清细胞因子浓度及其时间释放曲线之间无相关性（J Pain. 2008; 9(7):650-7）1。我们还证实了该技术在识别药物介导的伤口细胞因子含量变化方面的实用性（Anesth Analg 2010; 111:1452-9）2。
引言
手术切口后，驻留和迁移的炎性细胞会释放促炎和抗炎细胞因子、前列腺素类、神经肽以及趋化因子，这些物质在启动和维持疼痛过程中起重要作用。3,4 获取特定部位生化标志物的能力，对于确定血清与手术伤口中物质水平之间的关系、理解介质释放与手术疼痛之间的复杂关系，以及评估全身性和外周给药对手术伤口生化环境的影响至关重要。以往研究主要集中于生化介质的全身性测量，而未考虑其在局部的特异性释放。5,6 细胞因子和趋化因子的血清浓度可能无法真实反映手术伤口局部的生化事件，仅能代表机体对创伤的全身性反应。本文提供了该方法详细且独特的可视化描述，该方法最早于2008年在《疼痛杂志》（Journal of Pain）中被引用。1 本 JoVE 文章的目的是提供一种独特且视觉增强的方法学描述。
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方案
1. 研究方案
- 获得机构审查委员会批准及书面知情同意。
- 选择适合的外科手术人群开展研究。该方法目前仅应用于剖宫产切口，但大多数外科手术切口也适用。
- 考虑研究的纳入与排除标准。手术切口感染率较高的患者及手术类型可能不适用。
- 对所有患者标准化麻醉及术后管理，以避免潜在的混杂因素。
2. 痛觉和炎症生化介质的采集
- 在伤口闭合前，将ON-Q PainBuster与ON-Q SilverSoaker（I-Flow，Lake Forest，CA）置入皮下层（也可考虑其他组织层）。ON-Q PainBuster镇痛系统以2 ml/h的速率持续输送生理盐水。该载体可与感兴趣的药物（如局部麻醉药和非甾体抗炎药）联合使用或进行比较。
- 在该系统中加入标准的三通止液夹，以便在指定时间点抽吸伤口渗出液。持续灌注可防止导管堵塞，提高系统获取渗出液样本的可靠性。若渗出液抽吸困难（约5%的病例），可考虑在伤口上方轻柔推压，或调整受试者的体位（例如让患者坐起或平躺，使用0.5–1 ml生理盐水冲管或将导管回撤1–2 cm。
- 根据方案规定的时间点（例如，剖宫产术后1、4、6、24和48小时），吸取并采集1 ml伤口渗出液，转移至含有30 μl蛋白酶抑制剂的聚乙烯杯中。本研究使用了Complete蛋白酶抑制剂（Roche Bioscience，Palo Alto，CA）。
- 按照研究方案规定的时间间隔采集 10 ml 血液。我们使用含锂肝素的采血管；在我机构中，此为绿色管帽的玻璃试管。向血样中额外加入 300 μl 蛋白酶抑制剂。
- 采集后1小时内，将样本置于冰上，并以3,000 rpm离心10分钟。
- 移除血清和伤口上清液，放入标准微量离心管中，于 -20 °C 保存。
3. 检测分析
- 收集并储存所有研究用渗出液和血清样本后，应同时解冻并分析所有样本。
- 我们采用多重免疫分析法检测细胞因子和趋化因子。多重免疫分析技术可从小体积（50 μl）样本中同时检测多种分析物，其结果与 ELISA 获得的结果具有可比性。我们使用了 17-plex Bio-Plex™ 系统（BioRad，Hercules，CA）进行分析。该检测可测定肿瘤坏死因子 α（TNFα）、干扰素 α（INFα）、白细胞介素 1β（IL-1β）、白细胞介素 2（IL-2）、白细胞介素 4（IL-4）、白细胞介素 5（IL-5）、白细胞介素 6（IL-6）、白细胞介素 7（IL-7）、白细胞介素 8（IL-8）、白细胞介素 10（IL-10）、白细胞介素 12（IL-12）、白细胞介素 13（IL-13）、白细胞介素 17（IL-17）、粒细胞集落刺激因子（G-CSF）、粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子（GM-CSF）、单核细胞趋化蛋白 1（MCP-1）和巨噬细胞炎症蛋白 1β（MIP-1β）。神经生长因子（NGF）使用 NGF DY256 抗体，通过 Bio-Plex 胺偶联试剂盒添加至 17-plex 板中进行检测。
- 为确保分析质量，每项检测应设复孔。每种分析物的标准曲线通过制造商提供的参考物质建立（浓度分别为 0.20、0.78、3.13、12.5、50、200、800、3,200 pg/ml，另设生理盐水零标准品）。每次实验均需包含标准曲线，并使用 Bio-Plex Manager 软件计算样本浓度。
- 采用高灵敏度 ELISA 试剂盒检测 P 物质（Substance P）和前列腺素 E2（prostaglandin E2）。本分析使用 Assay Designs, Inc.（Ann Arbor, Michigan）的试剂盒，按照制造商说明书进行双复孔检测。
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结果
采用该方法，我们能够检测到上述所有生化介质，但伤口渗出液和血浆中的IL-5除外1,2。一些额外的细胞因子在血浆中未被检测到（IL-4、IL-17、TNFα、INFγ、GM-CSF）1。已报道研究中所测定的细胞因子和趋化因子的时间进程具有一致性，在最初数小时内即达到平台期，并在整个24小时观察期内维持该水平1,2。然而，NGF在24小时收集期间持续稳定升高，而PGE2则在1小时内达到峰值，随后逐渐下降1。特别值得注意的是，用局部麻醉药布比卡因灌注的伤口中，IL-10水平显著降低，P物质水平显著升高，提示该药物具有整体促炎效应（图1）2。在另一项研究中，我们证实剖宫产术后镇痛药物消耗量与伤口渗出液中IL-6、IL-1β和G-CSF浓度呈负相关（图2）1
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讨论
上述方法已被证实具有足够的灵敏度，可用于检测伤口渗出液中的生化炎症和伤害性介质。在不同时间点进行取样，还使我们能够观察到这些介质随时间的变化过程1,2。据我们所知，目前尚无其他针对人体外科伤口的检测方法能够连续测定手术伤口渗出液中炎症和伤害性介质的释放谱。我们从手术切口部位收集伤口渗出液的方法所得结果，与利用髋关节引流液的研究7,8存在差异，这表明皮下伤口介质的释放可能不同于关节腔或其他体腔内生化介质的释放。此外，引流液中获得的结果可能受到血液流入伤口的干扰，因此可能无法准确反映局部生化介质的释放情况。
伤口局部与血清水平之间的相关性较差，表明在研究手术伤口时，确定特定部位的释放情况具有重要意义。由于多种因素的影响，局部变化可能不会在全身系统中得到反映，这些因素包括对手术创伤和应激反应所导致的全身与局部产生的差异。尽管我们选择检测剖宫产伤口渗出液中特定的一组促炎和抗炎细胞因子、趋化因子，以及NGF、SP和PG-E21,2，但该方法也可应用于其他手术模型以及多种其他生物化学介质的研究。
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致谢
Carvalho 博士的工作得到了美国国立卫生研究院妇女健康研究办公室和儿童健康与人类发展国家研究所的研究资助（5K12 HD043452）。Angst 博士从 I-Flow 公司（加利福尼亚州湖林）获得了实验用品（On-Q PainBuster 术后镇痛系统）和资金（用于生化检测）。
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参考文献
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重印与许可
