使用连接介导的 PCR 鉴定实体瘤中 Sleeping Beauty 转座子插入位点

摘要

介绍了一种使用无偏方法识别致癌未知驱动因素的技术。该方法利用 Sleeping Beauty 转座子作为靶向特定组织的随机诱变工具。通过对驱动肿瘤形成的转座子插入位点进行基因组定位，可鉴定出新的癌基因和肿瘤抑制基因

摘要

对人类肿瘤的基因组、蛋白质组、转录组和表观基因组分析表明，与配对的正常组织相比，每种癌症基因组中均存在数千个异常。这些分析结果明确显示，仍有许多尚未发现的癌症遗传驱动因子¹。然而，这些驱动因子隐藏在基因组中数量更为庞大的乘客突变背景之中，这些乘客突变并不直接促进肿瘤的形成。癌症基因组的另一个特征是，在相似的肿瘤类型中存在显著的遗传异质性。每个肿瘤可能携带不同的突变，从而为肿瘤形成提供选择性优势²。在小鼠中进行无偏倚的正向遗传筛选，可提供生成肿瘤并分析其遗传组成的方法，同时减少乘客突变的背景干扰。其中一种方法是使用 Sleeping Beauty（SB）转座子系统³。SB 系统利用可由转座酶催化插入基因组各处的可移动载体（转座子）。通过使用一种由 Cre 重组酶 激活的条件性转座酶等位基因，可将突变限制在特定细胞类型中。目前已存在多种在特定组织中表达 Cre 重组酶 的小鼠品系。通过将其中一种品系与条件性转座酶等位基因（例如 Lox-stop-Lox-SB11）杂交，SB 系统仅在表达 Cre 重组酶 的细胞中被激活。Cre 重组酶 将切除阻断转座酶等位基因表达的终止盒，从而在指定的细胞类型中启动转座子诱变。SB 筛选通过繁育三种转基因小鼠品系启动，使实验小鼠同时携带条件性转座酶等位基因、转座子串联体以及组织特异性 Cre 重组酶 等位基因。让这些小鼠自然衰老直至肿瘤形成并进入濒死状态。随后对小鼠进行解剖，并从肿瘤组织中分离基因组 DNA。接下来，对基因组 DNA 进行连接介导的 PCR（LM-PCR），以扩增包含 SB 转座子的基因组位点。对单个肿瘤进行 LM-PCR 可产生数百个不同的扩增子，代表该肿瘤中数百个含有转座子插入的基因组位点⁴。分析所有肿瘤中的转座子插入位点，并采用适当的统计方法识别共同插入位点（CISs）⁵。位于 CIS 内的基因极有可能是癌基因或肿瘤抑制基因，被视为候选癌症基因。使用 SB 系统识别候选癌症基因的优势包括：1）由于转座子序列已知，可轻松定位其在基因组中的位置；2）转座可靶向几乎任何细胞类型；3）转座子能够诱导功能获得性和功能缺失性突变⁶。以下方案描述了如何设计并实施基于 SB 转座子系统的正向遗传筛选，以鉴定候选癌症基因（图 1）。

方案

1. 转基因动物的繁育与老化

1. 选择适合实验的转基因小鼠品系。典型的实验将使用三个转基因品系：条件性转座酶小鼠、携带串联排列转座子的小鼠，以及在目标癌症起源细胞中表达Cre 重组酶的小鼠。如果所建模的癌症在大部分患者中具有已知的突变，则可在起始阶段引入该突变。此类“易感性”突变的示例包括激活型 Kras、显性失活型Tp53或 floxed Pten等位基因。通过加入易感性突变，模型可能更接近人类癌症的真实情况（见1.3）。多种Sleeping Beauty转座酶和转座子小鼠可从美国国家癌症研究所小鼠资源库获取（http://mouse.ncifcrf.gov/）。
2. 将条件性转座酶小鼠与携带转座子的小鼠杂交，尽可能最终获得对两个等位基因均为纯合的小鼠。再将纯合子后代与表达Cre 重组酶的小鼠杂交，以生成三重转基因实验小鼠（图2）。注意：获得纯合小鼠并不总是可行或理想。例如，p53 显性失活纯合小鼠的繁殖难度远高于杂合小鼠。此外，建议确认后代符合孟德尔遗传规律，以验证杂交方案的成功。
3. 若使用易感性遗传背景，首先将携带转座酶的小鼠与携带易感性等位基因的小鼠杂交。同时，将表达Cre 重组酶的小鼠与携带转座子的小鼠杂交。尽可能分别....

结果

建立繁殖方案后，饲养者应每隔19-21天生产一窝幼崽。每窝幼崽数量为5至12只，具体数量取决于种鼠的年龄和遗传背景。此外，需确保子代的基因型符合孟德尔遗传规律，以验证繁殖方案的正确性和成功性。

为了确保实验成功，实验组动物的肿瘤发生率应显著高于对照组动物。如果实验中未引入“易感”突变，则对照组动物中应出现极少甚至没有肿瘤。如果实验中包含了“易感”突变，则这些动物的肿瘤发生率应远低于同时携带该突变和SB活性的动物。

LM-PCR 应能在单个肿瘤中扩增出数百个转座子插入片段。将二次 PCR 产物的一半在 1% 琼脂糖凝胶上电泳后，应出现代表此类扩增的 DNA “涂布”条带（图 3）。如果仅出现一或两条条带，则表明睡美人转座子（SB）在肿瘤中未发挥作用，或实验操作过程中存在错误（图 4）。

在Illumina GAIIx平台的一个通道中对一至两百个肿瘤样本进行测序，应可产生超过3000万条长度为100 bp的.......

讨论

利用 Sleeping Beauty 转座子系统进行正向遗传筛选，可提供一种识别致癌突变的方法。通过选择适当的启动子以调控 Cre 重组酶，并结合任何易感突变，SB 筛选能够鉴定已知及新的候选癌症基因。

SB 筛选的成功在很大程度上取决于用于构建筛选体系的小鼠品系。对于转座子，我们建议使用两种不同的小鼠品系，其基因组中分别在不同染色体上携带致癌转座子的串联重复序列⁷。在选择可激活 SB 转座酶的组织特异性 Cre 重组酶 时，应谨慎考虑。必须有证据表明 Cre 酶在所研究癌症的疑似起源细胞类型中具有活性。成功的实例包括 Villin-Cre（胃肠道癌症）、Albumin-Cre（肝细胞癌）和 Aid-Cre（淋巴瘤）^8–10。

成功进行筛选所需的小鼠数量取决于肿瘤外显率。通常，肿瘤数量越多，小鼠数量越多，筛选结果就越可靠。为了检测到癌症发生潜伏期的2倍差异，对照组和实验组中均应至少包含60只动物。¹¹

.......

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
Sure-Seal 诱导室	Brain Tree Scientific	EZ-177
冻存管	Bioexpress	C-3355-2
10% 缓冲福尔马林	Sigma Aldrich	HT501128-4L
蛋白质沉淀溶液	Qiagen	158910
细胞裂解缓冲液	Qiagen	158906
蛋白酶K	Qiagen	158920
RNase A	Qiagen	158924
TE 缓冲液	Promega	V6232
BfaI	New England Biolabs	R0568S
NlaIII	New England Biolabs	R0125S
MinElute 96 孔板	Qiagen	28051
QIAvac 96 真空抽滤装置	Qiagen	19504
Multi-MicroPlate Genie，120V	Scientific Industries, Inc.	SI-4000
T4 DNA 连接酶（含 5× 连接缓冲液）	Invitrogen	15224-041
BamHI	New England Biolabs	R0136S
25 mM dNTPs	Bioexpress	C-5014-200
Platinum Taq	Invitrogen	10966-034
FastStart Taq DNA 聚合酶	Roche	12032929001
琼脂糖	Promega	V3121
TAE 缓冲液	Promega	V4271
TE 缓冲液	Promega	V6232
溴化乙锭	Promega	H5041