本报告中的发现和结论仅代表作者观点，不一定代表美国疾病控制与预防中心的观点。
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摘要
摘要
气道上皮细胞的顶膜和基底外侧膜对病原体暴露表现出定向反应 体内因此，理想的 体外 用于研究细胞对呼吸道病原体反应的模型具有极化特性，可形成顶膜和基底膜表面。其中一种模型为分化后的正常人支气管上皮细胞（NHBE）。然而，该体系需要肺组织样本，以及从组织中分离和培养上皮细胞的专业技术，并需较长时间建立气液界面培养体系。
Calu-3 细胞源自人支气管腺癌，是研究近端气道上皮细胞对呼吸系统损伤1、药理学化合物2-6以及细菌7-9和病毒病原体（包括流感病毒、鼻病毒和严重急性呼吸综合征相关冠状病毒）10-14反应的替代模型。最近，我们证明了Calu-3细胞对呼吸道合胞病毒（RSV）感染具有易感性，其感染特征与NHBE细胞一致15,16。本文详细描述了Calu-3细胞极化液体覆盖培养（LCC）模型的建立过程，重点介绍Calu-3细胞的培养与生长技术细节、LCC培养状态下细胞的维持方法，并提供了对极化Calu-3细胞进行呼吸道病毒感染实验的操作方法。
为了持续获得极化的 Calu-3 限界细胞培养物（LCC），必须在将 Calu-3 细胞接种于 Transwell 插件前谨慎地进行传代培养。Calu-3 单层培养物的融合度应保持在低于 90%，从冻存株传代次数应少于 10 次，并需定期更换新鲜培养基。一旦接种于 Transwell 中，Calu-3 LCC 必须小心操作。不规律的换液操作，或对细胞层或培养板施加机械或物理性扰动，均会对极化状态造成数小时至数天的负面影响。极化状态通过测定跨上皮电阻（TEER）进行监测，并通过评估荧光素钠在顶端与基底外侧腔室之间的被动平衡来验证17,18。当 TEER 稳定在 1,000 Ω×cm2 或更高时，Calu-3 LCC 即可用于研究呼吸道病原体引发的细胞反应。
方案
1. 在 Transwell 培养系统中培养 Calu-3 细胞
安全措施：在生物安全柜中使用无菌培养技术进行所有操作。
- 从冷冻保存中复苏细胞：
- 准备含有20%热灭活胎牛血清（FBS）、0.1 mM非必需氨基酸、2 mM L-谷氨酰胺和10 mM HEPES（pH 7.4）的Eagle最低必需培养基（EMEM-20%+S）。使用0.2 μm孔径滤器对配制好的培养基进行无菌过滤，并在水浴中预热至37 °C。为了更真实地模拟in situ气道上皮环境，培养基中不添加抗生素或抗真菌剂。
- 在37 °C水浴中快速（< 1分钟）解冻一支冷冻的Calu-3细胞冻存管。
- 将解冻后的细胞转移至一个50 ml无菌锥形管中，加入30 ml预热的EMEM-20%+S。
- 以1,000–1,200 × g离心5分钟，无需制冷，刹车速度调至较低，使细胞沉淀。
- 小心弃去上清液，用移液器轻柔吹打，将细胞重悬于5 ml预热的EMEM-20%+S中。每孔接种2至5 × 106个细胞至6孔组织培养板中，在37 °C、7% CO2的空气环境中培养，直至细胞汇合度达到75%–80%。每日观察，可能需要长达7天。每3–4天吸除培养基，更换新鲜的EMEM-20%+S。
- 细胞传代：
- 将0.05%胰蛋白酶–0.02% EDTA在37 °C水浴中预热。吸除细胞培养基，用预热的0.05%胰蛋白酶–0.02% EDTA洗涤细胞一次，以去除多余的培养基和血清。吸除洗涤液后，每孔加入1 ml预热的胰蛋白酶溶液。
- 在37 °C、7% CO2条件下孵育，每隔5分钟在显微镜下观察，直至至少75%的细胞从组织培养板孔中脱落。此过程可能需要5至30分钟。
- 用EMEM-20%+S洗涤细胞以去除过量胰蛋白酶。将消化后的细胞转移至一个50 ml无菌锥形管中。可将一个6孔板中多个孔的细胞合并至同一个50 ml无菌锥形管中。加入30 ml EMEM-20%+S，以1,000–1,200 × g离心，无需制冷，刹车速度调至较低，使细胞沉淀。
- 小心弃去上清液，用移液器轻柔吹打，将细胞重悬于新鲜EMEM-20%+S中。参照上述步骤1.2.1至1.2.3进行胰酶消化，当细胞汇合度达到75%–80%时，继续按步骤1.2.5至1.2.7所述方法传代至组织培养皿中。
- 将一个6孔板中的一孔细胞传代至一个T-25 cm2培养瓶中，终体积为5 ml EMEM-20%+S，接种密度为每瓶0.5至1 × 106个细胞。
- 每T-25 cm2培养瓶使用5 ml预热胰蛋白酶消化细胞，将一个T-25 cm2培养瓶的细胞传代至一个T-75 cm2培养瓶中，终体积为10 ml EMEM-20%+S，接种密度为每瓶1至5 × 106个细胞。
- 每T-75 cm2培养瓶使用8 ml预热胰蛋白酶消化细胞，将一个T-75 cm2培养瓶的细胞传代至2个T-75 cm2培养瓶中。为获得最佳细胞生长状态，不应将细胞传代至大于T-75 cm2的培养瓶，或传代比例超过1个母瓶:3个新瓶。
- 细胞传代后，每2至3天完全更换一次培养基，直至细胞汇合度达到75%–90%。细胞可能需要长达3周时间达到该汇合度。为获得最佳的极化培养效果，应在细胞单层汇合度超过90%之前进行传代。
- 持续传代细胞，直至获得足够数量的细胞用于接种所需数量的Transwell小室。每个Transwell小室需要接种2 × 105个细胞。为获得最佳极化培养性能，应使用传代次数不超过10代的细胞。
2. 培养极化Calu-3液相覆盖培养物（LCC）
安全措施：在生物安全柜中使用无菌培养技术进行所有操作。
- 配制含有10%胎牛血清（FBS）的EMEM培养基（EMEM-10%），并在水浴中预热至37 °C。
- 准备24孔Transwell板用于接种细胞。使用无菌镊子将Transwell小室从板的内侧行移至外侧行，避免接触小室膜。细胞仅应传代至板的外侧行孔中。为防止向基底外侧室引入气泡，将移液枪头倾斜靠在每个室的孔壁上，缓慢释放600 μl EMEM-10%至各孔中。
- 用预热的胰蛋白酶从T-75 cm2培养瓶中消化并解离细胞，并按照步骤1.2所述方法，每2瓶消化后的细胞用30 ml EMEM-20%+S洗涤一次。
- 用5 ml EMEM-10%轻轻吹打，将洗涤后的细胞充分重悬。
- 采用台盼蓝排斥法测定活细胞数和总细胞数。仅当活细胞比例达到80%–90%时，方可继续后续操作。
- 在50 ml无菌锥形离心管中，用EMEM-10%将细胞稀释至浓度为2 × 106个活细胞/ml。
- 将细胞加入各Transwell的顶端室中。向不含细胞的对照孔A1和D1（即空白孔）加入100 μl不含细胞的EMEM-10%。向其余各孔加入100 μl重悬的Calu-3细胞，将移液枪头轻轻靠在小室内壁的导流槽内侧，缓慢释放细胞悬液。切勿使移液枪头接触小室膜。为保持Calu-3细胞悬液的均匀性，在接种过程中应轻柔震荡细胞悬液。
- 将Transwell板置于37 °C、7% CO2的空气环境中孵育。将板放置在震动最小的培养箱内。为提高细胞极化效率，切勿将多块板上下堆叠。
- 为维持培养直至细胞完全极化并可用于实验，请按照下文步骤2.10至2.13所述方法完全更换Transwell中的培养基。细胞传代至Transwell后第三天进行首次完全换液，之后按照“第四天与第三天交替”的周期进行换液，直至细胞完全极化。
- 将EMEM-10%在水浴中预热至37 °C。
- 轻柔地吸除Transwell小室中的培养基。使用连接于低真空抽吸装置的毛细移液管或标准1 ml移液器，先吸除不含细胞的A1和D1孔中的培养基，再吸除接种孔中的培养基，先吸除所有孔的顶端室培养基，再吸除所有孔的基底外侧室培养基。吸液过程中切勿接触小室膜。
- 向不含细胞的A1和D1孔的顶端室加入200 μl EMEM-10%，然后向接种孔中加入，将移液枪头沿小室内壁引导，使培养基进入顶端室。切勿将培养基直接加在细胞上，也切勿接触小室膜。
- 向基底外侧室加入600 μl EMEM-10%。为防止引入气泡，将移液枪头倾斜靠在每个室的孔壁上，缓慢释放培养基进入孔中。
3. 评估 Calu-3 LCC 耐药性的形成
安全措施：在生物安全柜中使用无菌培养技术进行所有操作。
- 在更换培养基后30分钟评估Calu-3单层细胞培养（LCC）的跨上皮电阻（TEER）；可根据需要在每次更换培养基后进行评估。所有测量均需在无菌条件下进行。首先测量不含细胞的对照孔A1和D1（空白孔），以获得基线读数，随后依次测量每个孔。
- 在无菌条件下，将STX2电极转移至含有70%乙醇（溶于无菌水）的50 ml离心管中，消毒15分钟。
- 根据制造商说明校准并测试伏欧姆表的使用。
- 将电极从乙醇中取出，空气干燥5–10秒，并用无菌EMEM-10%冲洗电极。
- 将伏欧姆表的模式开关设置为“电阻”（RESISTANCE）模式，并打开电源。
- 轻轻将电极插入Transwell培养插件基底外侧室的三个可进入孔之一。放置电极时，使较长的探针轻轻接触外室底部并保持垂直，较短的探针则置于顶腔室的组织培养基中，但不得接触插入膜。
- 按下“Measure R”按钮，等待读数稳定。对每个孔的其余两个孔重复测量，共记录每个孔的三个读数。继续测量所有细胞孔的电阻。
- 通过将电极浸泡于70%乙醇中5–10分钟，再用无菌dH2O冲洗并彻底干燥，以清洁电极。清洁后存放于原装容器中。
- 使用公式1计算每个孔的实际电阻。
Ω 实际 = Ω 样本 - Ω 空白 ，公式1
其中Ω 样本为接种细胞孔的平均测量值，Ω 空白为不含细胞但含有插入膜和培养基的两个对照孔A1和D1的平均测量值。 - 使用公式2计算单位面积电阻。
Ω 实际 × 有效膜面积 = Ω × cm2，公式2
其中24孔Transwell插入膜的有效膜面积为0.33 cm2。
- 通过进行次级检测——测量一至三个Transwell培养体系中顶腔与基底外侧腔之间的被动性荧光素钠扩散，验证细胞极化是否完成。用于荧光素钠检测的孔在检测完成后应立即弃用。
- 配制非荧光缓冲液（118 mM NaCl；4.75 mM KCl；2.53 mM CaCl2·2H2O；2.44 mM MgSO4；1.19 mM KH2PO4；25 mM NaHCO3，溶于无菌水；使用0.45 μm滤器无菌过滤）。将荧光素钠溶于非荧光缓冲液中，配制成1 mg/ml溶液，无菌过滤，铝箔包裹避光，4 °C保存。使用前恢复至室温。
- 完成电阻测量后，小心移除一至三个独立Transwell培养体系中基底外侧和顶腔室的培养基。
- 冲洗Transwell培养体系。向基底外侧室轻柔加入600 μl室温无菌Dulbecco's PBS（D-PBS），向顶腔室加入100 μl室温无菌D-PBS。
- 轻柔移除D-PBS。向基底外侧室加入600 μl无菌非荧光缓冲液，向顶腔室加入100 μl无菌1 mg/ml荧光素钠溶液。
- 将培养板于37 °C孵育1小时。此孵育过程无需CO2环境。
- 在孵育期间，使用非荧光缓冲液稀释荧光素钠，配制浓度范围为20 μg/ml至0 μg/ml的标准曲线。至少配制8种不同浓度的荧光素钠溶液，每种终体积不少于600 μl。标准曲线稀释液需避光保存，直至准备测量吸光度。
- 将每个测试Transwell基底外侧室的非荧光缓冲液样品转移至单独的洁净管中用于分析。取出用于检测被动性荧光素钠扩散的测试Transwell，弃去。将剩余Transwell所在的培养板放回培养箱。
- 将每种标准溶液各取100 μl，设三个复孔，加入96孔平底板中。
- 将每个基底外侧样品用非荧光缓冲液进行1:2、1:20和1:50三种稀释，每种未稀释样品及其稀释液各取100 μl，设两个复孔，加入96孔平底板中。
- 使用ELISA酶标仪在486 nm或490 nm波长下测量样品吸光度。
- 通过将样品吸光度与荧光素钠标准曲线的吸光度值进行比较，确定基底外侧室中荧光素钠的浓度。
4. 用呼吸道病毒感染极化Calu-3 LCC
安全措施：在与所用病毒相适应的生物安全水平下，于生物安全柜中使用无菌培养技术进行所有操作。
- 用无血清EMEM稀释病毒，使所需接种量为100 μl。
- 用无血清EMEM洗涤细胞。轻柔吸去各孔中的培养基，先移除顶端培养基，再移除基底外侧培养基。使用连接至真空 trap 且处于轻柔真空状态的毛细移液管，或使用标准1 ml移液管，先从无细胞的A1和D1孔中吸出培养基，然后从接种细胞的孔中依次吸出所有孔的顶端培养基，再吸出所有孔的基底外侧培养基。吸液时切勿触碰插入膜。
- 向无细胞的A1和D1孔的顶端室中加入100 μl无血清EMEM，然后向接种细胞的孔中加入，将移液管尖端沿插入膜边缘引导，使液体进入顶端室。切勿直接将培养基加在细胞上，也切勿触碰插入膜。
- 向所有基底外侧室中加入600 μl无血清EMEM。通过将移液管倾斜靠在室壁上，并缓慢释放液体进入孔中，逐个向每个Transwell中添加培养基。
- 轻柔吸去孔中的无血清培养基。
- 从无感染或模拟感染（mock-infected）的孔开始，将适当稀释的病毒液加入Transwell的顶端室。对于无感染孔，向相应Transwell的顶端室加入100 μl无血清EMEM；对于模拟感染孔，向相应Transwell的顶端室加入100 μl用无血清EMEM稀释的无病毒制备液；对于病毒感染组，将病毒用无血清EMEM稀释后，向相应Transwell的顶端室加入100 μl。
- 向所有基底外侧室中加入600 μl无血清EMEM。
- 在37 °C、7% CO2条件下孵育2小时。
- 吸去孔中培养基，先从无感染和模拟感染孔开始，再处理感染孔。先移除顶端上清液，再移除基底外侧上清液。
- 更换培养基：在顶端室中加入200 μl含10%血清的EMEM（EMEM-10%），在基底外侧室中加入600 μl含10%血清的EMEM（EMEM-10%）。
结果
当在Transwell培养系统中以液体覆盖培养（LCC）方式生长时（如图1所示），Calu-3细胞会形成极性，发育出明显的顶膜和基底外侧膜。根据本文所述方法，Calu-3细胞LCC的跨上皮电阻（TEER）在接种后3周内达到或超过1,000 Ω×cm2并进入平台期，示例见图2。极化细胞之间形成的紧密连接可阻止小分子在顶膜和基底外侧腔室之间的被动平衡。因此，采用改良的荧光素钠平衡实验来确认Calu-3 LCC的极化状态15,17,18。随着LCC中Calu-3细胞单层TEER的升高，被动扩散至基底外侧腔室的荧光素量减少。当TEER达到1,000 Ω×cm2时，进入基底外侧腔室的荧光素量≤1%（如图3所示）；因此，当TEER ≥ 1,000 Ω×cm2时，认为Calu-3 LCC已完全极化。不同实验间Calu-3 LCC的峰值TEER可能有所差异。然而，一旦特定实验中的TEER值进入平台期，未感染的完全极化Calu-3 LCC在接种后可稳定维持5至12周。Transwell培养的Calu-3细胞未能形成电阻可能由多种因素引起，详见表1。当Calu-3 LCC的TEER稳定在或高于1,000 Ω×cm2时，该模型即可用于研究气道上皮细胞对呼吸道病原体（包括呼吸道合胞病毒（RSV））的反应。与模拟感染细胞相比，RSV暴露会导致极化培养体系完整性的更快下降（图4）。
图 1. Transwell 培养细胞的横截面示意图。 细胞生长于小室膜的顶端表面。
图 2. Calu-3 细胞在 Transwell 小室中接种后跨上皮电阻（TEER）的发展及细胞极化情况。 每个时间点的 TEER 数据来自一次代表性实验中的 32 个独立孔，以中位数 Ω × cm2 ± 标准误（SEM）表示。
图 3. 钠荧光素向 Calu-3 细胞单层基底外侧区室的被动平衡过程在细胞极化后受到抑制。 数据来自四项独立实验的累积结果。每个数据点代表一次独立测量。
图 4. RSV 感染极化 Calu-3 长寿命细胞加速单层完整性下降。 极化 Calu-3 细胞在第 0 天以 MOI=1 感染 RSV-A2，感染后连续监测极性达 8 周。图中显示一次代表性实验结果。数据表示为每次感染每时间点 8 个独立孔的中位电阻值 ± 标准误（SEM）。*经 Student t 检验确定，模拟感染组与 RSV-A2 感染组之间 p<0.05。
| 问题 | 解决方案 |
| 无法测量电阻 |
|
| 电阻能够发育，但未达到完全极化状态（≥1,000 Ω×cm2） |
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| 细胞已完全极化，但每次测量的电阻值不一致 |
|
表1. 在Transwell中培养Calu-3细胞时可能出现的问题及解决方案。多种因素会影响Calu-3细胞在液体覆盖培养条件下的完全极化，本表重点列出了其中最可能的原因。
讨论
在建立Transwell小室中的Calu-3长期培养模型（LCC）时，细胞可能完全无法极化，或未能充分极化，其标准为跨上皮电阻（TEER）≥ 1,000 Ω×cm2，且顶腔与基底外侧腔室间的荧光素钠染料平衡率 ≤ 1%。此外，Calu-3细胞在LCC中可能实现完全极化，但TEER在不同测量之间可能出现不一致。尽管Calu-3 LCC的TEER值在日常测量中存在波动属于正常现象，但在细胞完全极化后，TEER不应出现剧烈波动，直至培养物因自然老化而功能衰退，这种衰退可能最早在接种后5周出现，最晚可持续至12周。
Calu-3 长链细胞（LCC）极化的能力在一定程度上取决于其在用于Transwell系统前的培养和传代方式。在传代过程中，若细胞单层生长超过90%汇合度、自冻存株传代超过10次，或未定期更换新鲜培养基，则细胞完全极化的可能性降低，且即使发生极化，也往往迅速衰退。极化不完全或完全缺失也可能与所用Transwell小室的材质和孔径大小差异有关，即使组成和孔径相似的Transwell小室，不同批次之间也可能存在影响极化效果的变异。较大的孔径可能允许Calu-3细胞穿过Transwell膜进入基底外侧室，从而阻碍细胞极化。缺乏极化还可能由细菌污染引起，表现为培养基浑浊，进而导致Calu-3细胞间紧密连接的继发性破坏。
Calu-3 限细胞培养模型（LCC）的跨上皮电阻（TEER）测量值出现波动，可能由 Calu-3 LCC 单层细胞、插件或培养板本身的机械性破坏引起。换液和 TEER 测量过程中，应避免移液器吸头或电极导线接触细胞。操作时需注意防止向顶腔和基底外侧腔室中引入气泡，否则会影响伏特欧姆计对电阻的检测。即使细胞培养模型实际已形成极化，伏特欧姆计检测电阻的能力也可能因电极导线表面蛋白沉积而受限。此类沉积可通过轻柔打磨去除，或通过更换电极予以纠正。
一旦Calu-3 LCC完全极化且TEER值不再上升，Calu-3 LCC即可用于实验 体外 用于表征宿主肺上皮细胞对呼吸道感染反应的模型。该系统相较于传统用于研究呼吸道病原体（如 A549 和 HEp-2 细胞）的单层培养肺细胞系，能够更准确地表征细胞对病原体的极性反应。此外，Calu-3 肺癌细胞系（LCC）相较于原代极化分化的正常人支气管上皮细胞（NHBE）具有更短的建模时间、更易获取且制备成本更低的优势。与 NHBE 相似，极化的 Calu-3 细胞可形成紧密连接并产生黏蛋白。然而，与 NHBE 不同的是，极化的 Calu-3 细胞不会分化为基底细胞层和纤毛柱状上皮细胞层，且仅有少数极化的 Calu-3 细胞发育出类似纤毛的突起。19因此，尽管极性化的Calu-3肺上皮细胞系（LCC）可用于研究呼吸道上皮细胞对呼吸系统损伤的极性反应，但其并非研究呼吸道损伤或伤害后气道发育或重塑的理想模型。培养细胞的黏液分泌 体外 可能影响细胞感染性以及感染性病毒的释放和在极化模型中的病毒传播，而极化Calu-3 LCC与极化分化的NHBE之间黏液生成的直接比较尚未见报道。A549和HEp-2细胞相较于Calu-3细胞更易于培养，然而与Calu-3 LCC不同，它们在Transwell插入物上培养时无法形成极化结构，因此并非研究这些过程的理想模型 体外 极化上皮细胞对呼吸道病毒感染的反应
致谢
作者谨此感谢Elisabeth Blanchard提供的技术协助。本报告中的研究结果与结论由作者负责，不一定代表美国疾病控制与预防中心的观点。
材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 试剂 | |||
| Calu-3 | ATCC | HTB-55 | |
| 0.05% 胰蛋白酶 - 0.02% EDTA | Gibco/Invitrogen | 25300 | |
| 伊格尔最低必需培养基（EMEM） | Gibco/Invitrogen | 07-00100DK | |
| 胎牛血清（FBS） | HyClone | SH30070.03 | 56 °C 热灭活，30 分钟 |
| 非必需氨基酸 100X（10 mM） | Gibco/Invitrogen | 11140 | 避光，4 °C 保存 |
| L-谷氨酰胺 | Gibco/Invitrogen | 25030 | |
| HEPES | Gibco/Invitrogen | 15630 | |
| EMEM-10% FBS（EMEM-10%） | 向 EMEM 中添加热灭活 FBS 至终浓度为 10% 血清，无菌过滤 | ||
| EMEM-20% FBS + 补充物（EMEM-20%+S） | 将 EMEM 补充至以下终浓度：热灭活 FBS 20%；1X 氨基酸；2 mM L-谷氨酰胺；10 mM HEPES；无菌过滤 | ||
| 24 孔 Transwell 培养板 | Corning Costar | 3472 | 3 μm 孔径，聚酯材质 |
| 台盼蓝 | Gibco/Invitrogen | 15250 | |
| 乙醇 | Sigma | E7023 | 用无菌 dH2O 配制成 70% |
| 杜尔贝科磷酸盐缓冲液（D-PBS） | Invitrogen | 14040 | |
| 非荧光缓冲液 | 118 mM NaCl；4.75 mM KCl；2.53 mM CaCl2×H2O；2.44 mM MgSO4；1.19 mM KH2PO4；25 mM NaHCO3，溶于无菌水；无菌过滤 | ||
| 荧光素钠 | Sigma | 6377 | 1 mg/ml 溶于无菌非荧光缓冲液，无菌过滤，避光保存；4 °C 可保存长达 6 个月 |
| 设备 | |||
| 伏特欧姆计 | World Precision Instruments | ||
| STX2 电极 | World Precision Instruments | ||
| ELISA 酶标仪 | 可检测 A486 或 A490 |
参考文献
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