方法文章

量化的内皮细胞糖复合物的力学性能，用原子力显微镜

DOI：

10.3791/50163

⸱

2013年2月21日

 , 
1Department of Biomedical Engineering, University of Rochester

本文内容

摘要

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内皮糖萼的机械特性测定压痕使用AFM的悬臂上的微米大小的球体。内皮细胞培养在一个自定义的腔室，在生理流动条件下，诱导糖萼表达。使用薄膜的模型，以确定具有糖萼厚度和弹性模量的数据进行了分析。

摘要

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我们理解白细胞捕获期间的白细胞与血管壁的相互作用的限制由内皮表面层的机械性能的一个不完整的理解。它是已知的非均匀分布的白细胞粘附分子相对于表面拓朴图3，该地形限制粘结形成其他的表面9，并且，生理上的接触力（≈5.0 - :10.0，PN每微绒毛）可以为压缩的微绒毛少三分之一其休息的长度，增加分子的可访问性的相对表面3，7。我们认为，血管内皮细胞的两层结构，相对刚性的单元主体，加上糖萼腔表面6上，一个软保护糖衣。它已被证明，糖复合物可以作为阻挡减少白细胞粘附于内皮表面4。在这份报告中，我们着手解决的内皮细胞表面的变形，以了解血管内皮的机械刚度，可能会影响债券的形成。静态培养中生长的血管内皮细胞不表达一个强大的糖复合物，但在生理流动条件下生长的细胞开始观察体内的糖复合物。内皮细胞体的模量，已使用原子力显微镜（AFM）测定的，是大约5到20千帕5。的糖复合物中的厚度和结构进行了研究，使用电子显微镜8，和已糖复合物的模量的近似使用间接的方法，但就我们所知，没有已经发表在活细胞中的蛋白质复合物的弹性模量的直接测量的报告。在这项研究中，我们提出了一个新的原子力显微镜探针对细胞已培养的条件下，最大限度地发挥他们的糖被表达马压痕实验科的直接测量的弹性模量和厚度的内皮糖萼。

方案

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1。方法

1.1细胞流动室

甲流室， 如图1中所示，构建了使细胞可为1.0帕（10达因/厘米2）的剪切下生长，然后直接转移到一个的庇护MFP3D原子力显微镜（圣巴巴拉，加利福尼亚州）。

  1. 流动室，制备实验首先通过清洗载玻片的Piranha溶液（3:1 H 2 SO 4:H 2 O 2）为15分钟，然后用蒸馏水洗涤。然后将它们进行烘烤，以干燥和涂有氨基丙基三乙氧基硅烷（APTES）在真空沉积室中。
  2. 有机硅垫片被切断使用剪影SD刀具的。这使我们能够精细地控制用于控制细胞的生长期间的流动速率和剪切应力的流动腔室的尺寸。通常情况下，一个信道被切断6.4毫米宽了19毫米，长为0.4mm的硅树脂的片材。的流量所需的属特1.0帕（10达因/厘米2）的剪切应力的计算假设层流中的矩形通道与方程:

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结果

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在一个典型的实验中，从一个给定区域的细胞得到的20的力与距离曲线，通常在核周区域，靠近，但不包括在核（〜2μm的范围内）。曲线，考虑到对准测量的持续时间的任何样品漂移，然后取平均值，以除去悬臂噪音，如在图4中示出。曲线进行了分析和合适的被开发用于确定的弹性模量和厚度的薄的聚合物膜1的两个层模型。从拟合的曲线的25个细胞中，我们已经确定，管腔层的弹性模量是0.7±0.5千帕，厚度为380±50nm的，如在图5中示出。细胞体的弹性模量为16±6千帕。这些值是在良好的协议与以前的测量的细胞体的模量和厚度的糖萼5星，8。


图1。我们的细胞培养装置，整个腔室流动靠重力从贮存器驱动的A至C。细胞铺板在封闭的腔室B，用磁铁的一个封闭的细胞培养皿的表面为庇护.......

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讨论

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我们使用从两层模型和Hertz理论建模的循环血液中的白细胞与血管内皮壁的相互作用的计算出的值。我们计算一个微绒毛上与10 PN负载下的直径为50nm的白细胞会缩进约150nm到糖萼，只有一小部分的总厚度。这表明，糖复合物，与如在本实验中测得的性能，是一种显着的细胞 - 细胞相互作用的障碍，并可以是一个大的空间位阻的细胞期间必须克服的白细胞粘附的粘附级联期间。

在这里所使用的模型，我们近似糖萼为各向同性的弹性结构。虽然我们不知道任何机械测量以指示这是没有的情况下，有关的糖复合物的分子结构的什么是已知的建议，这是有可能过于简化。事实上，糖萼是一个复杂和多样结构的表面上的细胞。它由导向的分子结构，缺乏明确定义的外边界，和可能变浓接近细胞表面。因此，虽然这里使用的弹性模型两层提供循环的细胞观察到的糖复合物的相对刚度洞察，今后的研究可以探讨替代机械描述信息，其可能的各向异性和在厚度方向上的变化的密度，可能占。它也有可能是糖萼是不统一的细胞表面的不同区域之间。这将不会是显而易见的，从本数据集，因为所有的数据在这里被在细胞核周围的小区的中央区域。

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披露

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没有利益冲突的声明。

致谢

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笔者想感谢埃琳娜Lomakina，理查德·Bauserman，玛格丽特杨曼，吉Vaknin，杰西卡·斯奈德，克里斯Striemer，纳库尔Nataraj，红栗橱嗯的，TEJAS Khire，和Eric林对他们的援助，这个项目的。该项目是由美国国立卫生研究院PO1 HL 018208。

....

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材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
的试剂/材料名称 公司 目录编号 评论
麦考伊的中 Gibco公司 16600-082
胎牛血清 Hyclone公司 SH30070
血管内皮细胞生长培养基血管内皮细胞技术 MCDB-131
汇集人类脐静脉内皮细胞血管内皮细胞技术 PHUVEC/T-25
硫酸 JT贝克 9681-02
过氧化氢 VWR BDH3742-1
（3 - 氨基丙基）三乙氧基硅烷 Aldrich公司 440140-100ML
异丙醇 VWR BDH8999-4
胰蛋白酶 Cellgro 25-054-C1
汉克的缓冲盐溶液 Gibco公司 14175-095
磺基-NHS-LC-生物素 Thermo Scientific的 21335
Streptavadin珠磁珠 112.06D
MFP-3D原子力显微镜庇护研究
无针尖悬臂纳米世界 ARROW-TL1-50
剪影SD Quickutz 剪影-SD
硅橡胶斯托克韦尔弹性体 SE50-RS
30毫升注射器本顿迪金森 309650
18号针本顿迪金森 305196
拓 Hospira公司 4429-48
4单向阀泰利福 W21372
男/女港口上限史密斯医疗 MX491B
蠕动泵 Watson-Marlow公司 401U / D
蠕动管 Watson-Marlow公司 903.0016.016
无菌过滤器颇尔生命科学 4652

参考文献

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Clifford, C., Seah, M. Nanoindentation measurement of young's modulus for compliant layers on stiffer substrates including the effect of poisson's ratios. Nanotechnology. , (2009).
  2. Gouverneur, M., Spaan, J. A. E., Pannekoek, H., Fontijn, R. D., Vink, H.

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