通过使用原子力显微镜悬臂上的微米级小球进行压痕实验，测量了内皮糖萼的力学特性。内皮细胞在定制腔室中于生理流动条件下培养，以诱导糖萼表达。采用薄膜模型分析数据，以确定糖萼的厚度和模量。
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本文内容
摘要
摘要
我们对白细胞捕获过程中白细胞与血管壁相互作用的理解，受限于对内皮表面层力学特性的认识尚不完整。已知白细胞上的黏附分子相对于表面形貌呈非均匀分布。 3，这种形貌限制了与其他表面形成粘附键 9，以及生理接触力（≈ 5.0 − 10.0 pN 每微绒毛）的力可将微绒毛压缩至其静息长度的三分之一左右，从而增加分子对对面表面的可及性 3, 7我们将内皮视为一种双层结构，包括相对刚性的细胞体和位于管腔表面的柔软保护性糖被 6研究表明，糖萼可作为屏障，减少白细胞与内皮表面的黏附 4在本报告中，我们开始探讨内皮表面的可变形性，以理解内皮机械刚度如何影响键合形成。在静态培养条件下生长的内皮细胞不表达完整的糖萼结构，而在生理流动条件下培养的细胞则开始接近观察到的糖萼状态 体内 2内皮细胞体的模量已通过原子力显微镜（AFM）测得，约为5至20 kPa 5糖萼的厚度和结构已通过电子显微镜进行研究 8，且糖萼的模量已通过间接方法进行估算，但据我们所知，目前尚无关于活细胞中糖萼模量直接测量的已发表报告。在本研究中，我们采用一种新型原子力显微镜探针，在细胞培养条件下最大化其糖萼表达，开展压痕实验，以直接测量内皮糖萼的模量和厚度。
方案
1. 方法
1.1 细胞流室
如图1所示，构建了一个流体腔室，使细胞可在1.0 Pa（10 dyn/cm2）的剪切力下培养，随后直接转移至Asylum MFP3D原子力显微镜（Santa Barbara, CA）中进行检测。
- 通过以下步骤准备流动腔以进行实验：首先将玻璃载玻片在piranha溶液（3:1 H2SO4:H2O2）中清洗15分钟，然后用蒸馏水冲洗。随后将载玻片烘干，并在真空沉积室中用氨丙基三乙氧基硅烷（APTES）进行包被。
- 使用Silhouette SD切割工具切割硅胶垫圈。这使我们能够精确控制流动腔的尺寸，从而在细胞培养过程中调控流速和剪切应力。通常，从一张0.4 mm厚的硅胶片上切割出一个6.4 mm宽、19 mm长的通道。假设为矩形通道中的层流流动，生成1.0 Pa（10 dyn/cm2）剪切应力所需的流速可通过以下公式计算：
其中 Q 为流速，τ 为剪切应力，μ 为培养基的黏度，此处假设为 1.0 mPa (0.01 dyn*sec/cm2)，h 为流动腔室的高度，w 为流动腔室的宽度。
- 将流室的上部部件与细胞培养皿中的垫圈对齐，并用磁力环固定。组装完成后，用异丙醇（IPA）填充以进行灭菌。
- 完成整个流体系统的组装。将细胞培养皿中的流路接口连接至三通阀，三通阀再连接至开口的30 ml注射器。用异丙醇冲洗整个系统，随后用30 ml含4%胎牛血清（FCS）的McCoy's培养基洗涤系统。然后向系统中加入20 ml Vec Technologies细胞生长培养基。在注射器顶部盖上盖子，收集储液器注射器的盖子上装有针头，用于将培养基回流至供液储液器。在盖子的进气口处安装无菌0.2 μm滤器，以防止系统污染。流室系统此时即可用于细胞接种。
1.2 细胞培养
- 人脐静脉内皮细胞（HUVEC）和培养基购自 Vec Technologies 公司（Rensselaer, NY），并在 T25 培养瓶中培养至融合。
- 从培养瓶中移除培养基，加入 2 ml 2.5% 胰蛋白酶消化，使细胞单层解离。待细胞悬浮后，向培养瓶中加入 10 ml 细胞培养基以终止胰蛋白酶消化。
- 将细胞悬液以 5 分钟离心，弃去上清液。将细胞重悬于 1 ml 含血清的细胞培养基中，用于注入流室。
- 取 0.5 ml 细胞悬液（约含 50,000 个细胞）装入注射器，通过三通阀注入流室。
- 细胞在无流动条件下静置 2 小时，使其沉降并贴附于玻璃基底。随后在 37 °C 培养箱中施加流动条件培养 1 至 5 天，直至形成融合单层。
1.3 悬臂梁制备与细胞压痕
- 将无针尖的原子力显微镜悬臂梁（NanoWorld，瑞士）在硝酸中清洗5分钟，并在蒸气沉积室中用氨丙基三乙氧基硅烷（APTES）进行功能化处理。
- 配制5 mg/ml（质量浓度）的NHS-磺基-LC-生物素溶液于Hank's平衡盐溶液（HBSS）中。将悬臂梁浸入该溶液中15分钟，通过N-羟基琥珀酰亚胺（NHS）化学反应将硅烷偶联。
- 通过将20 ml Vec Technologies细胞培养基（含血清）与200 μl链霉亲和素珠在37 °C孵育12小时制备无生物素培养基；使用磁铁从培养基中去除珠子，并将培养基经0.22 μm无菌滤器过滤。
- 从细胞培养皿中移除流动室，并用37 °C的无生物素培养基洗涤细胞。
- 配制1 μl 2.4 μm链霉亲和素包被微珠溶于1 ml无生物素培养基中的储备液，取100 μl加入细胞培养皿中。
- 通过将悬臂梁落于靠近微珠的玻璃表面，回撤，将悬臂梁顶端定位至微珠上方，然后将悬臂梁压向微珠并静置数秒，从而用悬臂梁拾取链霉亲和素微珠。
- 通过在裸露玻璃区域进行压痕测量悬臂梁的灵敏度，并利用曲线斜率设定悬臂梁偏转与电压之间的关系。
- 随后在MFP3D软件中通过热调校计算悬臂梁的弹簧常数。
- 校准后的悬臂梁用于对样品进行压痕测试，如图2所示。这些2.4 μm微珠可提供更大的与细胞表面接触面积，从而能够检测柔软糖萼层的力学特性。将悬臂梁定位在细胞核附近的细胞上方，采用轻柔的接近方式使悬臂梁高度位于细胞表面约3 μm处。软件设置为以1 μm/sec的速度进行20次重复压痕，最大作用力为7 nN，连续两次接触之间间隔约6秒。可通过不同压痕速率检测糖萼的时间依赖性特性，但在本项初步实验中仅使用单一压痕速率（1 μm/sec）。
2. 压痕理论
使用半径为 R 的球体对弹性半空间进行压痕时，可通过赫兹理论描述，其中压痕力 F 由以下公式给出：
其中 δ 为压痕深度，E* 为被测材料的约化模量（图 3）。当无限刚性的压头压入均匀弹性半空间时，E* 由以下方程给出：
其中 E 为材料的弹性模量，ν 为材料的泊松比。近年来对聚合物薄膜的研究推动了双层模型的发展，用于测定薄膜的模量和厚度1。我们将该模型应用于细胞生物学，将糖萼视为覆盖在细胞体表面的一层均匀且柔软的薄膜。利用该模型，系统的约化模量变为：
其中 EGC 为糖萼的模量，Ecell 为细胞体的模量，P、Q 和 n 为通过聚合物拟合经验确定的常数，z 由以下方程给出：
其中 t 为糖萼层的厚度。图 3 展示了这些参数的示意图。该模型已被证明是测定较硬基底上薄膜模量和厚度的准确方法1。此方程可用于拟合对细胞进行压痕实验所获得的曲线，以确定内皮糖萼的模量和厚度，如图 4所示。
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结果
在典型实验中，从细胞的特定区域（通常为核周区域，靠近细胞核但不在其上，距离约在 2 μm 范围内）获取 20 条力-距离曲线。为消除测量期间样品漂移的影响，对这些曲线进行对齐处理，并通过平均化以去除悬臂梁噪声，如图 4所示。采用为测定薄聚合物膜模量和厚度而开发的双层模型对曲线进行分析和拟合1。通过对 25 个细胞的曲线拟合结果分析，我们确定腔层的模量为 0.7 ± 0.5 kPa，厚度为 380 ± 50 nm，如图 5所示。细胞体的模量为 16 ± 6 kPa。这些数值与先前对细胞体模量及糖萼厚度的测量结果高度一致5, 8。
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讨论
我们利用双层模型和赫兹理论计算得到的数值，模拟了在血液中循环的白细胞与内皮壁之间的相互作用。计算结果表明，在10 pN载荷下，直径为50 nm的白细胞微绒毛会陷入糖萼约150 nm，仅为糖萼总厚度的一小部分。这表明，根据本实验测得的特性，糖萼是细胞间相互作用的重要屏障，在白细胞黏附级联过程中可构成显著的空间位阻，细胞必须克服这一障碍才能完成黏附过程。
在本研究采用的模型中，我们将糖萼近似为各向同性的弹性结构。尽管目前尚无任何力学测量结果表明这一假设不成立，但关于糖萼分子结构的已知信息提示，这种简化可能过于粗略。事实上，糖萼是细胞表面一种复杂且具有异质性的结构。它包含具有取向性的分子结构，缺乏明确界定的外边界，并且在靠近细胞表面处的密度可能更高。因此，尽管本研究中使用的双层弹性模型有助于理解循环细胞所观测到的糖萼相对刚度，未来的研究可进一步探索其他力学描述方法，以考虑其可能存在的各向异性以及厚度方向上密度的变化。此外，糖萼在细胞表面不同区域的分布也可能并不均匀。这一点在当前数据集中未能体现，因为本文所有数据均采集自细胞中央核周区域。
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披露
未声明任何利益冲突。
致谢
作者感谢Elena Lomakina、Richard Bauserman、Margaret Youngman、Shay Vaknin、Jessica Snyder、Chris Striemer、Nakul Nataraj、Hung Li Chung、Tejas Khire和Eric Lam在本项目中的协助。本项目由美国国立卫生研究院（NIH）资助，项目编号#PO1 HL 018208。
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| McCoy培养基 | Gibco | 16600-082 | |
| 胎牛血清 | Hyclone | SH30070 | |
| 内皮细胞生长培养基 | Vec Technologies | MCDB-131 | |
| 混合人脐静脉内皮细胞 | Vec Technologies | PHUVEC/T-25 | |
| 硫酸 | JT Baker | 9681-02 | |
| 过氧化氢 | VWR | BDH3742-1 | |
| (3-氨基丙基)三乙氧基硅烷 | Aldrich | 440140-100ML | |
| 异丙醇 | VWR | BDH8999-4 | |
| 胰蛋白酶 | Cellgro | 25-054-C1 | |
| Hank's平衡盐溶液 | Gibco | 14175-095 | |
| 磺基-NHS-LC-生物素 | Thermo Scientific | 21335 | |
| 链霉亲和素磁珠 | Dynabeads | 112.06D | |
| MFP-3D原子力显微镜 | Asylum Research | ||
| 无针尖悬臂梁 | Nanoworld | ARROW-TL1-50 | |
| Silhouette SD切割仪 | Quickutz | Silhouette-SD | |
| 硅橡胶 | Stockwell Elastomerics | SE50-RS | |
| 30 ml注射器 | Benton Dickinson | 309650 | |
| 18号针头 | Benton Dickinson | 305196 | |
| 延长管组 | Hospira | 4429-48 | |
| 四通阀 | Teleflex | W21372 | |
| 公/母端帽 | Smith’s Medical | MX491B | |
| 蠕动泵 | Watson-Marlow | 401U/D | |
| 蠕动泵管 | Watson-Marlow | 903.0016.016 | |
| 无菌滤器 | Pall Life Science | 4652 |
参考文献
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