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方法文章

血浆视黄醇结合蛋白膜受体介导视黄醇转运的实时分析

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DOI：

10.3791/50169

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2013年1月28日

 ,  , 
1Department of Physiology, Jules Stein Eye Institute and Howard Hughes Medical Institute, University of California, Los Angeles

本文内容

摘要

本文介绍了一种优化的制备高质量维生素A/视黄醇结合蛋白（RBP）复合物的技术，以及两种用于实时监测STRA6（RBP受体）介导的维生素A转运的实时监测技术。

摘要

维生素A对视觉以及几乎所有人体器官的生长和分化都至关重要。血浆视黄醇结合蛋白（RBP）是血液中维生素A的主要且特异性的载体。本文介绍了一种优化的制备和纯化全-视黄醇-RBP（holo-RBP）的技术，以及两种用于实时监测高亲和力RBP受体STRA6介导的维生素A转运过程的技术。第一种技术可大量制备高质量的全-视黄醇-RBP（视黄醇装载率达100%），用于维生素A转运实验。高质量的RBP对功能实验至关重要，因为错误折叠的RBP会轻易释放维生素A，而RBP制备过程中的细菌污染可能引起实验假象。诸如电生理学等实时监测技术已对膜转运研究作出了关键贡献。然而，RBP受体介导的视黄醇转运直到最近才得以实现实时分析。本文所述的第二种技术是对STRA6催化的视黄醇释放或装载过程进行实时分析。第三种技术是对STRA6催化的视黄醇从全-视黄醇-RBP向细胞内视黄醇结合蛋白I（CRBP-I）转运的过程进行实时分析。这些技术在揭示RBP受体介导的维生素A摄取机制方面具有高灵敏度和高分辨率。

引言

维生素A是一种有机分子，对人类生存以及几乎所有人体器官的正常功能至关重要。维生素A的衍生物（视黄醇类）参与多种生物化学和细胞活动，包括视觉中光信号的感知1,2，以及在胚胎发育和成体组织中对基因表达和蛋白质翻译的调控3-6。尽管视黄醇具有在体内系统性扩散的能力，但进化过程中产生了血浆视黄醇结合蛋白（RBP），这是一种在血液中特异性运输维生素A的载体蛋白，以实现高效性、特异性，并避免因随机扩散引起的毒性7-10。早在20世纪70年代，科学家就假设存在一种高亲和力受体，能够结合RBP并摄取维生素A11-13。尽管在随后的三十年中积累了大量支持RBP受体存在的证据14-31，但由于对全型RBP（holo-RBP）的定义错误，该受体假说长期存在争议。全型RBP的正确定义是视黄醇与RBP形成的高亲和力1:1复合物。必须通过有机溶剂反复提取才能获得脱辅基RBP（apo-RBP）。几乎所有研究RBP7,9,32-35或RBP受体14-31,36-42的实验室均采用这一定义。曾被用来否定RBP受体存在的错误定义，是将游离视黄醇与apo-RBP简单混合的体系。由于RBP受体在从holo-RBP中摄取维生素A过程中的功能是将视黄醇从holo-RBP中释放出来，如果视黄醇一开始就是游离状态（如错误定义中的holo-RBP），则RBP受体在视黄醇摄取过程中将不起任何作用。

最近发现RBP受体是一种称为STRA6的多跨膜结构域蛋白，并阐明了其在从全-转铁蛋白（holo-RBP）中摄取维生素A中的功能36-43，这些发现强烈反驳了“RBP无需受体即可递送维生素A”的假说。详细分析表明，STRA6具有9个跨膜结构域，其N端位于细胞外，C端位于细胞内40。在第6和第7个跨膜结构域之间存在一个关键的RBP结合结构域39。STRA6在从全-转铁蛋白摄取维生素A的过程中与LRAT和CRBP-I均存在偶联关系，但LRAT或CRBP-I并非增强STRA6活性所绝对必需41。STRA6催化全-转铁蛋白释放视黄醇的能力是其介导维生素A摄取活性的关键41。通过依赖STRA6释放其携带的视黄醇，RBP能够以高度特异性和高效性将维生素A转运至外周组织中的靶细胞。

全型RBP的定义与制备之所以至关重要，不仅体现在历史上关于RBP受体是否存在的争论中，也体现在近期三篇基于不同于原始且正确定义的全型RBP概念的研究论文中44-46。第一篇论文使用了曾用于否定RBP受体存在的全型RBP定义来研究RBP受体44。第二和第三篇论文则提出了第三种全型RBP的定义，使得视黄醇与RBP形成正确复合物的研究变得更加困难45,46。这些研究通过将全型RBP（甚至不是脱辅基RBP）与3H-视黄醇混合来制备3H-视黄醇/RBP。由于该实验并未真正形成3H-视黄醇/RBP复合物，也未去除过量的游离3H-视黄醇45,46，因此它并非检测细胞从3H-视黄醇/RBP复合物中摄取3H-视黄醇的实验，而实际上是一种游离3H-视黄醇扩散实验。已有研究表明，STRA6不会通过LRAT38或CRBP-I41增强细胞对游离视黄醇的摄取。几乎所有的视黄醇在血液中都与RBP结合，无法检测到游离视黄醇的存在。RBP受体的主要功能是在细胞从全型RBP摄取视黄醇的过程中催化视黄醇从全型RBP中释放41。如果视黄醇在实验开始前已被人为释放或本就处于游离状态45,46，则无需RBP受体参与。采用游离视黄醇扩散实验所获得的结果与基于正确制备的全型RBP实验所得结果存在显著差异，这充分说明了正确制备RBP对于其功能检测的极端重要性。

RBP 可以从人血清中纯化获得41，但该过程复杂且产率较低。另一种方法是在大肠杆菌（E. coli）中表达 RBP。由于 E. coli 无法正确折叠像 RBP 这样含有多个二硫键对的哺乳动物分泌蛋白，因此必须对 RBP 进行复性，并纯化出正确折叠的蛋白。错误折叠的蛋白不仅在各种检测中表现出与正确折叠 RBP 不同的行为，而且在储存过程中还会导致蛋白聚集。出于同样的原因，脱辅基 RBP（apo-RBP）只能由高质量的全辅基 RBP（holo-RBP）制备。本文描述了一种优化的方案，通过细菌表达、蛋白复性和高效液相色谱（HPLC）纯化，制备完全负载视黄醇的高质量 RBP。HPLC 纯化不仅能去除错误折叠的 RBP，还能显著去除细菌污染物，这些污染物若残留，在信号转导实验中可能导致严重的假象。我们还介绍了两种高灵敏度的实时监测技术，用于研究 STRA6 介导的视黄醇转运。这两种技术均依赖于高质量的 RBP。由于篇幅限制，基于放射性标记类视黄醇和基于 HPLC 的维生素 A 摄取检测等经典技术在此不作描述。

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方案

1. 全-视黄醇结合蛋白的制备、复性及高效液相色谱纯化

  1. 将含有N端6x His标签人RBP cDNA的pET3a质粒转化至BL-21细胞中。在含羧苄青霉素的40 ml LB培养基中，于37 °C摇床培养转化后的BL-21细胞，直至600 nm处的O.D.达到0.5。加入IPTG至终浓度1 mM以诱导RBP蛋白表达，继续在37 °C培养5小时。
  2. 在E.coli中表达的RBP主要存在于不溶性包涵体中。为富集包涵体，于4 °C以10,000 × g离心20分钟收集菌体。随后在含蛋白酶抑制剂的5 ml PBS中冰上超声破碎细胞，并进行两次冻融循环。于4 °C以20,000 × g离心30分钟沉淀包涵体。弃去上清液，将沉淀置于冰上保存。
  3. 用10 ml 7.5 M盐酸胍在冰上超声溶解包涵体沉淀。加入5 ml（半体积）25 mM Tris缓冲液（pH 9.0）和DTT至终浓度10 mM。在涡旋振荡器上剧烈混合溶液，室温过夜，以充分还原并变性蛋白。
  4. 将蛋白溶液于4 °C以18,000 × g离心20分钟，去除不溶性物质。离心后，将上清液转移至新离心管中，并将离心管置于冰上。
  5. 配制四倍体积（60 ml）的复性缓冲液（25 mM Tris，pH 9.0，0.3 mM胱氨酸，3.0 mM半胱氨酸，1 mM EDTA）。对复性缓冲液进行脱气处理。同时在暗红光下配制600 μl含10 mM视黄醇的乙醇溶液，避光置于冰上。复性缓冲液和视黄醇溶液均需新鲜配制。
  6. 将蛋白溶液和复性缓冲液均置于冰上预冷至少30分钟。温度过高可能降低复性后RBP的质量。在冰上剧烈搅拌蛋白溶液的同时，逐滴加入1 ml复性缓冲液，随后加入10 μl视黄醇溶液，交替重复此步骤直至所有复性缓冲液和视黄醇溶液加完。在冰上避光持续搅拌反应5小时。
  7. 将复性反应液于4 °C以24,000 × g离心30分钟。复性反应完成后必须立即去除聚集物。
  8. 使用Amicon Ultra 15浓缩管（截留分子量10 K）将上清液浓缩至约10 ml。切勿过度浓缩，否则会导致蛋白聚集，降低正确折叠RBP的最终得率和质量。用预冷的PBS将浓缩样品稀释至100 ml。此步骤的目的是去除复性反应中干扰镍柱纯化的成分。
  9. 将溶液再次于4 °C以24,000 × g离心20分钟，务必去除任何沉淀物。将上清液转移至两个50 ml离心管中，每管加入1 ml已用PBS洗涤过的Ni-NTA悬液。于4 °C旋转孵育1小时。稀释样品孵育1小时可促使错误折叠蛋白沉淀，以便去除。
  10. 于500 × g离心3分钟收集Ni-NTA珠。小心弃去上清液，去除任何漂浮物。每管加入预冷PBS至30 ml，再次离心并弃去上清液。重复此洗涤步骤，直至管中仅剩珠子为止。
  11. 将Ni-NTA树脂转移至空层析柱中。用含10 mM咪唑和500 mM NaCl的PBS缓冲液洗涤树脂20个柱体积。用含100 mM咪唑的PBS缓冲液洗脱5个柱体积以收集His-RBP。此溶液不宜长期保存，冷冻会降低最终得率和质量。为获得最佳结果，应立即进行HPLC纯化。
  12. 将Ni-NTA树脂纯化的His-RBP对25 mM Tris（pH 8.4）、120 mM NaCl缓冲液透析。也可使用浓缩管进行缓冲液置换。每次上样前，于4 °C以16,000 × g离心10分钟，清除HPLC样品中的不溶物。
  13. 使用AX-300离子交换柱，以25 mM Tris（pH 8.4）为流动相，流速1 ml/min，采用NaCl阶梯梯度（220 mM 12分钟，360 mM 15分钟，1,000 mM 15分钟）进行HPLC纯化全型RBP。随着NaCl浓度升高，全型His-RBP被洗脱，而脱辅基RBP和错误折叠RBP仍结合在柱上（图1）。若RBP复性未优化，错误折叠RBP（例如 图1中的错误折叠RBP-I）可能成为主要产物。
  14. 从360 mM NaCl洗脱峰中收集正确折叠的全型RBP。密切监测正确折叠与错误折叠His-RBP的洗脱曲线。在1,000 mM NaCl条件下，大部分错误折叠His-RBP应被洗脱。
  15. 合并含全型RBP的组分，浓缩后于4 °C在PBS中透析过夜。使用分光光度计检测最终得率和质量（330 nm/280 nm比值）。正确折叠产物的330 nm/280 nm比值应略高于1（图1）。
  16. 为制备脱辅基RBP，向纯化的全型RBP中加入等体积庚烷，于4 °C缓慢旋转孵育过夜。于4 °C以16,000 × g离心10分钟，小心转移下层水相至新离心管（避免界面处的沉淀）。重复该过程三次，每次孵育3小时。使用Nanodrop分光光度计检测吸光度，确保330 nm处的峰降至背景水平。

2. STRA6 催化视黄醇释放与视黄醇加载的实时监测

  1. 使用 200 μl 封闭剂酪蛋白（Pierce）在 4 °C 下对黑色 96 孔 Microfluor-2 板（Thermo Scientific）封闭过夜，以防止全-视黄醇结合蛋白（holo-RBP）非特异性地粘附到塑料表面。在我们测试的所有封闭液中，封闭剂酪蛋白具有最佳的封闭效果。
  2. 将从表达 STRA6 或对照细胞的新鲜制备的膜用 PBS 洗涤，并通过 Hamilton 注射器（Gastight #1710）反复推注 6 次，以在 PBS 中形成均匀的悬浮液。通常每反应使用来自 100 mm 培养皿上培养的细胞的 1/100 至 1/20 所得的膜。
  3. 用 200 μl PBS 对 Microfluor-2 板的包被孔进行一次洗涤。在加入膜悬浮液（每孔 50 μl）前，将板置于冰上冷却。
  4. 使用 POLARstar Omega（BMG Labtech）的荧光光学系统，设置激发滤光片为 320ex，发射滤光片为 460-10，实时监测视黄醇荧光。程序设定为终点读数模式。如果时间间隔固定，也可使用板模式测量时间进程。每个时间点的信号为 10 次测量的平均值（轨道平均，直径 2 mm），增益设定为 1,800。每次测量前，使用双轨道振荡以 500 rpm 振荡 10 秒。
  5. 启动视黄醇释放实验时，先在 0 分钟前使用终点读数模式读取一次各孔信号，然后加入全-视黄醇结合蛋白（通常终浓度为 1 μM）。一旦加入全-视黄醇结合蛋白，即每隔 5–10 分钟连续监测反应 1–3 小时。启动视黄醇加载实验时，在暗红光下向各孔加入全反式视黄醇（通常终浓度为 1 μM）。在 0 分钟前读取一次板信号，然后加入无配体视黄醇结合蛋白（apo-RBP）。一旦加入 apo-RBP，即每隔 5–10 分钟连续监测反应 1–3 小时。
  6. 所有测量完成后，从 Omega 数据分析软件（BMG Labtech）下载原始数据（示例见图 2）至 Microsoft Excel 进行数据分析。每个时间点生成一个包含所有实验条件读数的文件。例如，若有 20 个时间点，则将 20 个文件整合为一个 Excel 文件用于数据分析。
  7. 数据分析时，将 0 分钟加入视黄醇或全-视黄醇结合蛋白前的荧光信号视为背景信号，并从所有时间点的最终荧光信号中扣除。尽管背景信号相较于全-视黄醇结合蛋白中的视黄醇荧光较低，但扣除背景可消除膜光散射带来的非特异性影响，从而能够专注于分析在 0 分钟加入的全-视黄醇结合蛋白或视黄醇所产生的视黄醇荧光。

3. 实时监测STRA6催化全反视黄醇结合蛋白（Holo-RBP）向细胞内视黄醇结合蛋白I（CRBP-I）转运视黄醇的过程

  1. 视黄醇-EGFP 是一种新近建立的荧光共振能量转移（FRET）探针对 41通过测量视黄醇-EGFP荧光共振能量转移（FRET），实时监测STRA6催化的视黄醇从全反式视黄醇结合蛋白（holo-RBP）向EGFP-CRBP-I的转运过程。实验所用带6×His标签的EGFP-CRBP-I融合蛋白（EGFP-CRBP-I）在哺乳动物细胞中表达，并在实验前经Ni-NTA树脂纯化。EGFP-CRBP-I可在含蛋白酶抑制剂的PBS缓冲液中短期保存于4 °C； alternatively，可将融合蛋白分装后于-80 °C冷冻保存。
  2. 在反应前，按上述方法准备封闭的 Microfluor-2 板和膜。在加入膜悬液（每孔 50 μl）之前，先用 200 μl PBS 洗涤 Microfluor-2 板的包被孔一次。
  3. 使用POLARstar Omega仪器，通过320ex激发滤光片以及460-10和510-10发射滤光片，结合同时双发射荧光光路系统，实时检测视黄醇-EGFP FRET信号。程序设置为终点读数模式。若时间间隔固定，也可使用板模式测量时间进程。每个时间点的信号为10次测量的平均值（轨道平均，直径2 mm），增益设置为每通道1,800。每次测量前，采用双轨道振荡模式以500 rpm振荡10秒。
  4. 开始反应时，向各孔中加入EGFP-CRBP-I（通常终浓度为1 μM）。在加入全型RBP前（0分钟），使用终点读数模式对酶标板进行一次读数。一旦加入全型RBP，立即开始连续监测反应，每5-10分钟测量一次，持续1-2小时。
  5. 所有测量完成后，下载原始数据（示例见于 图3) 从 Omega 数据分析软件导出至 Microsoft Excel 进行数据分析，具体步骤如上所述。
  6. 视黄醇-EGFP FRET 通过受体/供体发射峰比值的动态变化来计算47方程41 计算该比值的方法是[(510t-510b)/(460t-460b)，其中510t, 510b, 460t和 460b 分别表示反应开始后（t=时间点）510 nm 处的发射信号、添加视黄醇或全反式视黄醇结合蛋白（holo-RBP）前 510 nm 处的背景信号（b=背景）、反应开始后（t=时间点）460 nm 处的发射信号，以及添加视黄醇或全反式视黄醇结合蛋白（holo-RBP）前 460 nm 处的背景信号（b=背景）。

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结果

本文展示了通过高效液相色谱法（HPLC）生产与纯化全-视黄醇结合蛋白（holo-RBP）的代表性结果（图1），STRA6 催化下全-视黄醇结合蛋白释放视黄醇以及无辅基视黄醇结合蛋白（apo-RBP）加载视黄醇的实时分析结果（图2），以及 STRA6 催化下全-视黄醇结合蛋白向 EGFP-CRBP-I 转运视黄醇的实时分析结果（图3）。

不进行复性时，细菌表达的RBP由于存在大量错误的二硫键，几乎完全错误折叠。因此，在配体视黄醇存在下进行复性，对于获得正确折叠的RBP至关重要。我们发现，如果复性反应操作不当，将产生错误折叠的RBP种类（例如 错误折叠的 RBP-I 图1) 可能会在整个制备过程中占主导地位，经 HPLC 纯化后，高质量全型 RBP 的得率可能非常低。因此，HPLC 无法解决复性效果差的问题。如图所示 图1即使在正确的复性反应条件下，RBP 仍包含多种蛋白形态，包括脱辅基 RBP、部分...

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讨论

我们在此分享一种优化的RBP生产方案，因为RBP的生产与纯化过程对于获得正确折叠的RBP至关重要。鉴于可能存在错误折叠的RBP形式，以及即使经过高效液相色谱（HPLC）纯化的细菌来源RBP中仍可能含有微量细菌蛋白，因此使用血清来源的天然RBP来验证与RBP相关的结论具有重要意义。 commercially available的尿液RBP是一种复杂的混合物，包含多种RBP形式，如脱辅基RBP（apo-RBP）和全辅基RBP（holo-RBP）48,49。

本文所述的实时监测技术基于视黄醇的内在荧光特性。我们最初开发这些检测方法的动力源于经典放射性检测和基于高效液相色谱（HPLC）的检测所能提供的信息存在局限性。例如，我们在维生素A摄取实验中发现，STRA6自身几乎没有维生素A摄取活性，但我们难以在没有LRAT或CRBP-I41的情况下轻易解释STRA6在维生素A摄取中活性低的原因。在基于视黄酯的检测中，很容易理解STRA6自身不能生成视黄酯，因为STRA6并非具有LRAT活性的酶。然而，即使在基于视黄醇的检测中，STRA6自身仍然表现出很...

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致谢

由美国国立卫生研究院资助项目 R01EY018144 支持。

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材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
盐酸胍EMD5010
胱氨酸SigmaC8755
半胱氨酸SigmaC7352
EDTAFisherBP118-500
TrisFisher7786-1
DTTEMD3860
视黄醇SigmaR7632
羧苄青霉素FisherBP2648-5
IPTGEMD5810
PBSEMD6508
NaClFisherBP358-10
Ni-NTAQiagen1018244
咪唑EMD5720
庚烷EMDHX0295-1
封闭剂酪蛋白Pierce37528
Amicon Ultra 15 浓缩管（截留分子量 10 K）MilliporeUFC901024
Microfluor-2 板Fisher14-245-177
Hamilton 耐压注射器 #1710Fisher14-824-655

参考文献

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