本文介绍了一种优化的制备高质量维生素A/视黄醇结合蛋白（RBP）复合物的技术，以及两种用于实时监测STRA6（RBP受体）介导的维生素A转运的实时监测技术。
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本文内容
摘要
摘要
维生素A对视觉以及几乎所有人体器官的生长和分化都至关重要。血浆视黄醇结合蛋白（RBP）是血液中维生素A的主要且特异性的载体。本文介绍了一种优化的制备和纯化全-视黄醇-RBP（holo-RBP）的技术，以及两种用于实时监测高亲和力RBP受体STRA6介导的维生素A转运过程的技术。第一种技术可大量制备高质量的全-视黄醇-RBP（视黄醇装载率达100%），用于维生素A转运实验。高质量的RBP对功能实验至关重要，因为错误折叠的RBP会轻易释放维生素A，而RBP制备过程中的细菌污染可能引起实验假象。诸如电生理学等实时监测技术已对膜转运研究作出了关键贡献。然而，RBP受体介导的视黄醇转运直到最近才得以实现实时分析。本文所述的第二种技术是对STRA6催化的视黄醇释放或装载过程进行实时分析。第三种技术是对STRA6催化的视黄醇从全-视黄醇-RBP向细胞内视黄醇结合蛋白I（CRBP-I）转运的过程进行实时分析。这些技术在揭示RBP受体介导的维生素A摄取机制方面具有高灵敏度和高分辨率。
引言
维生素A是一种有机分子，对人类生存以及几乎所有人体器官的正常功能至关重要。维生素A的衍生物（视黄醇类）参与多种生物化学和细胞活动，包括视觉中光信号的感知1,2，以及在胚胎发育和成体组织中对基因表达和蛋白质翻译的调控3-6。尽管视黄醇具有在体内系统性扩散的能力，但进化过程中产生了血浆视黄醇结合蛋白（RBP），这是一种在血液中特异性运输维生素A的载体蛋白，以实现高效性、特异性，并避免因随机扩散引起的毒性7-10。早在20世纪70年代，科学家就假设存在一种高亲和力受体，能够结合RBP并摄取维生素A11-13。尽管在随后的三十年中积累了大量支持RBP受体存在的证据14-31，但由于对全型RBP（holo-RBP）的定义错误，该受体假说长期存在争议。全型RBP的正确定义是视黄醇与RBP形成的高亲和力1:1复合物。必须通过有机溶剂反复提取才能获得脱辅基RBP（apo-RBP）。几乎所有研究RBP7,9,32-35或RBP受体14-31,36-42的实验室均采用这一定义。曾被用来否定RBP受体存在的错误定义，是将游离视黄醇与apo-RBP简单混合的体系。由于RBP受体在从holo-RBP中摄取维生素A过程中的功能是将视黄醇从holo-RBP中释放出来，如果视黄醇一开始就是游离状态（如错误定义中的holo-RBP），则RBP受体在视黄醇摄取过程中将不起任何作用。
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方案
1. 全-视黄醇结合蛋白的制备、复性及高效液相色谱纯化
- 将含有N端6x His标签人RBP cDNA的pET3a质粒转化至BL-21细胞中。在含羧苄青霉素的40 ml LB培养基中，于37 °C摇床培养转化后的BL-21细胞，直至600 nm处的O.D.达到0.5。加入IPTG至终浓度1 mM以诱导RBP蛋白表达，继续在37 °C培养5小时。
- 在E.coli中表达的RBP主要存在于不溶性包涵体中。为富集包涵体，于4 °C以10,000 × g离心20分钟收集菌体。随后在含蛋白酶抑制剂的5 ml PBS中冰上超声破碎细胞，并进行两次冻融循环。于4 °C以20,000 × g离心30分钟沉淀包涵体。弃去上清液，将沉淀置于冰上保存。
- 用10 ml 7.5 M盐酸胍在冰上超声溶解包涵体沉淀。加入5 ml（半体积）25 mM Tris缓冲液（pH 9.0）和DTT至终浓度10 mM。在涡旋振荡器上剧烈混合溶液，室温过夜，以充分还原并变性蛋白。
- 将蛋白溶液于4 °C以18,000 × g离心20分钟，去除不溶性物质。离心后，将上清液转移至新离心管中，并将离心管置于冰上。
- 配制四倍体积（60 ml）的复性缓冲液（25 mM Tris，pH 9.0，0.3 mM胱氨酸，3.0 mM半胱氨酸，1 mM EDTA）。对复性缓冲液进行脱气处理。同时在暗红光下配制600 μl含10 mM视黄醇的乙醇溶液，避光置于冰上。复性缓冲液和视黄....
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结果
本文展示了通过高效液相色谱法（HPLC）生产与纯化全-视黄醇结合蛋白（holo-RBP）的代表性结果（图1），STRA6 催化下全-视黄醇结合蛋白释放视黄醇以及无辅基视黄醇结合蛋白（apo-RBP）加载视黄醇的实时分析结果（图2），以及 STRA6 催化下全-视黄醇结合蛋白向 EGFP-CRBP-I 转运视黄醇的实时分析结果（图3）。
不进行复性时，细菌表达的RBP由于存在大量错误的二硫键，几乎完全错误折叠。因此，在配体视黄醇存在下进行复性，对于获得正确折叠的RBP至关重要。我们发现，如果复性反应操作不当，将产生错误折叠的RBP种类（例如 错误折叠的 RBP-I 图1) 可能会在整个制备过程中占主导地位，经 HPLC 纯化后，高质量全型 RBP 的得率可能非常低。因此，HPLC 无法解决复性效果差的问题。如图所示 图1即使在正确的复性反应条件下，RBP 仍包含多种蛋白形态，包括脱辅基 RBP、部分.......
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讨论
我们在此分享一种优化的RBP生产方案，因为RBP的生产与纯化过程对于获得正确折叠的RBP至关重要。鉴于可能存在错误折叠的RBP形式，以及即使经过高效液相色谱（HPLC）纯化的细菌来源RBP中仍可能含有微量细菌蛋白，因此使用血清来源的天然RBP来验证与RBP相关的结论具有重要意义。 commercially available的尿液RBP是一种复杂的混合物，包含多种RBP形式，如脱辅基RBP（apo-RBP）和全辅基RBP（holo-RBP）48,49。
本文所述的实时监测技术基于视黄醇的内在荧光特性。我们最初开发这些检测方法的动力源于经典放射性检测和基于高效液相色谱（HPLC）的检测所能提供的信息存在局限性。例如，我们在维生素A摄取实验中发现，STRA6自身几乎没有维生素A摄取活性，但我们难以在没有LRAT或CRBP-I41的情况下轻易解释STRA6在维生素A摄取中活性低的原因。在基于视黄酯的检测中，很容易理解STRA6自身不能生成视黄酯，因为STRA6并非具有LRAT活性的酶。然而，即使在基于视黄醇的检测中，STRA6自身仍然表现出很.......
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致谢
由美国国立卫生研究院资助项目 R01EY018144 支持。
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 盐酸胍 | EMD | 5010 | |
| 胱氨酸 | Sigma | C8755 | |
| 半胱氨酸 | Sigma | C7352 | |
| EDTA | Fisher | BP118-500 | |
| Tris | Fisher | 7786-1 | |
| DTT | EMD | 3860 | |
| 视黄醇 | Sigma | R7632 | |
| 羧苄青霉素 | Fisher | BP2648-5 | |
| IPTG | EMD | 5810 | |
| PBS | EMD | 6508 | |
| NaCl | Fisher | BP358-10 | |
| Ni-NTA | Qiagen | 1018244 | |
| 咪唑 | EMD | 5720 | |
| 庚烷 | EMD | HX0295-1 | |
| 封闭剂酪蛋白 | Pierce | 37528 | |
| Amicon Ultra 15 浓缩管（截留分子量 10 K） | Millipore | UFC901024 | |
| Microfluor-2 板 | Fisher | 14-245-177 | |
| Hamilton 耐压注射器 #1710 | Fisher | 14-824-655 |
参考文献
- Crouch, R. K., Chader, G. J., Wiggert, B., Pepperberg, D. R. Retinoids and the visual process. Photochem. Photobiol. 64, 613-621 (1996).
- Travis, G. H., Golczak, M., Moise, A. R., Palczewski, K. Diseases caused by defects in the visual cycle: retinoids as potential ther....
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重印与许可
