触觉条件化与蜜蜂（Apis mellifera L.）触角采样策略的运动分析

摘要

在本实验方案中，我们展示了如何对束缚状态的蜜蜂进行触觉刺激的条件化训练，并介绍了一种二维运动捕捉技术，用于分析触角精细采样模式的运动学特征。

摘要

蜜蜂（Apis mellifera L.）是真社会性昆虫，以其复杂的劳动分工和联想学习能力而闻名^{1, 2}。工蜂生命的前半段在黑暗的蜂巢内度过，期间它们负责哺育幼虫或建造用于储存食物（例如花粉或花蜜）和培育后代的规则六边形蜂巢³。触角是功能强大的多感官感受器，在多种依赖触觉的任务中发挥关键作用⁴，包括蜂巢建造⁵和模式识别⁶。生命后期，每只蜜蜂会离开蜂巢外出觅食。此时蜜蜂必须学会区分有利的食物来源，记忆其位置，并将信息传递给同巢伙伴⁷。蜜蜂利用多种花朵信号，如颜色或气味^{7, 8}，以及花瓣表面的触觉线索⁹，形成对食物来源的多感官记忆。在实验室条件下，可通过趋利性学习范式训练蜜蜂利用触角区分物体的触觉特征，例如边缘或凹槽^{10, 11, 12, 13}。该学习范式与束缚蜜蜂的喙伸展反应（proboscis extension response, PER）经典嗅觉条件反射密切相关¹⁴。实验室中触觉学习范式的优势在于可将学习行为实验与多种生理学测量方法相结合，包括对触角运动模式的分析。

方案

1. 蜜蜂的准备

1. 在野外捕获采集花蜜或花粉的蜜蜂，可从蔗糖饲喂器处或蜂巢巢门口返回的采集蜂中获取。每只蜜蜂被捕获后立即放入一个玻璃小瓶中，用泡沫塞封口，并迅速带入实验室进行后续处理。
2. 在实验室中，将捕获的蜜蜂短暂置于4 °C冰箱中冷却，直至其出现初步的不动状态。
3. 将每只被固定不动的蜜蜂用胶带固定于小型金属管内，胶带缠绕于头部与胸部之间以及腹部上方。应注意确保其喙和触角仍可自由活动。
4. 用白色涂料（例如 无溶剂修正液Tipp-Ex）涂覆固定蜜蜂的复眼和单眼，以遮蔽其视觉。
5. 在蜜蜂头部后方滴加少量熔化的石蜡，将其头部固定于头部与胸部之间的胶带上，以防止记录过程中头部移动。
6. 在胶带上为每只蜜蜂标记编号以便识别，并将固定好的蜜蜂连同金属管置于湿润环境中，以防脱水。
7. 用注射器向每只蜜蜂提供30%蔗糖溶液液滴，持续喂食5秒，随后让所有蜜蜂恢复30分钟，再开始触觉条件化训练实验。

2. 触觉条件反射

1. 训练前，需对每只蜜蜂进行检测，以观察其对施加于触角的30%蔗糖刺激是否产生吻伸反应（PER）。检测时，蜜蜂的吻尖必须越过张开的下颚之间的一条假想线。对蔗糖刺激不产生PER反应的蜜蜂应全部弃用。
2. 用于触觉训练时，使用一个黄铜立方体（例如 3 × 5 毫米....

结果

在以下实验中，我们研究了触觉学习如何影响蜜蜂的触角采样行为。为此，我们在呈现触觉刺激之前和期间，监测了未经训练的蜜蜂和已训练蜜蜂触角尖端的运动情况。

首先，记录一组花粉采集蜂（N = 42）1分钟内的自发触角运动。随后，其中一半蜜蜂（N = 21）接受条件化训练，将触觉刺激与30%蔗糖奖励配对呈现五次，此为条件化组。触觉刺激为一块黄铜立方体的30 x 50 mm表面，其上刻有水平光栅（λ= 150 μm另一半蜜蜂（N = 21）未进行条件训练，作为 naive 组使用。 图2 显示了蜜蜂条件化组的平均学习曲线。首次奖励后的条件化PER百分比与自发行为存在显著差异（图2，Fisher 精确概率检验，p < 0.001）。学习曲线在第3次后趋于饱和^rd 奖励

随后，在触觉刺激存在的情况下，再次记录训练组和未训练组触角尖端1分钟内的运动情况。图3 A₁ - B₂.......

讨论

蜜蜂的准备：应尽快完成蜜蜂的采集与固定，以保持蜜蜂的应激水平较低。应激会影响蜜蜂的伸吻反应（PER）敏感性，因此可能间接影响蜜蜂的学习表现^{19, 20}。采集后立即将装有蜜蜂的玻璃小瓶直接置于冰上，可快速使其 immobilize（固定不动），从而降低其应激水平。需要注意的是，麻醉时间越长，蜜蜂恢复所需的时间也越长。

视觉对蜜蜂的触觉学习具有负面影响¹⁸。因此，有必要通过涂抹蜜蜂的眼睛来遮蔽其视觉。为了提高视频记录的视觉对比度，建议使用白色涂料（例如，Tipp-Ex）。操作时应注意避免触角接触到涂料。

学习表现： 实验室和野外的早期研究表明，蜜蜂采集蜂对蔗糖的敏感性会影响其联想学习能力^{21, 22}。较高的蔗糖敏感性与更优的触觉学习和辨别能力呈正相关。在一个采蜜季节的大多数周次中，蜂群中的花粉采集蜂平均对蔗糖的反应性高于采蜜蜂²³。它们可通过后腿上的花粉团.......

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
采集花粉的工蜂，Apis mellifera L.			私人蜂箱
玻璃小瓶（22 × 45 mm）	Carl Roth GmbH & Co	X655.1
黄铜管，10 × 30 mm			自制
黄铜立方体，3 × 5 mm			自制
修正液（无溶剂）	Tipp-Ex GmbH & Co KG
蔗糖溶液（30%）			家用糖溶于水
乙醇（70%）	Carl Roth GmbH & Co	9065.3
注射器（1 ml）和针头（0.6 × 25）	Carl Roth GmbH & Co	59.1
秒表	Carl Roth GmbH & Co	L423.1
显微操作仪	Märzhäuser MM33	00-42-101-0000
数字视频相机	Basler A602f-2
相机用宏镜头	TechSpec VZM 200
Matlab R2009b	The MathWorks