在本实验方案中，我们展示了如何对束缚状态的蜜蜂进行触觉刺激的条件化训练，并介绍了一种二维运动捕捉技术，用于分析触角精细采样模式的运动学特征。
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本文内容
摘要
摘要
蜜蜂（Apis mellifera L.）是真社会性昆虫，以其复杂的劳动分工和联想学习能力而闻名1, 2。工蜂生命的前半段在黑暗的蜂巢内度过，期间它们负责哺育幼虫或建造用于储存食物（例如花粉或花蜜）和培育后代的规则六边形蜂巢3。触角是功能强大的多感官感受器，在多种依赖触觉的任务中发挥关键作用4，包括蜂巢建造5和模式识别6。生命后期，每只蜜蜂会离开蜂巢外出觅食。此时蜜蜂必须学会区分有利的食物来源，记忆其位置，并将信息传递给同巢伙伴7。蜜蜂利用多种花朵信号，如颜色或气味7, 8，以及花瓣表面的触觉线索9，形成对食物来源的多感官记忆。在实验室条件下，可通过趋利性学习范式训练蜜蜂利用触角区分物体的触觉特征，例如边缘或凹槽10, 11, 12, 13。该学习范式与束缚蜜蜂的喙伸展反应（proboscis extension response, PER）经典嗅觉条件反射密切相关14。实验室中触觉学习范式的优势在于可将学习行为实验与多种生理学测量方法相结合，包括对触角运动模式的分析。
方案
1. 蜜蜂的准备
- 在野外捕获采集花蜜或花粉的蜜蜂，可从蔗糖饲喂器处或蜂巢巢门口返回的采集蜂中获取。每只蜜蜂被捕获后立即放入一个玻璃小瓶中，用泡沫塞封口，并迅速带入实验室进行后续处理。
- 在实验室中，将捕获的蜜蜂短暂置于4 °C冰箱中冷却，直至其出现初步的不动状态。
- 将每只被固定不动的蜜蜂用胶带固定于小型金属管内，胶带缠绕于头部与胸部之间以及腹部上方。应注意确保其喙和触角仍可自由活动。
- 用白色涂料（例如 无溶剂修正液Tipp-Ex）涂覆固定蜜蜂的复眼和单眼，以遮蔽其视觉。
- 在蜜蜂头部后方滴加少量熔化的石蜡，将其头部固定于头部与胸部之间的胶带上，以防止记录过程中头部移动。
- 在胶带上为每只蜜蜂标记编号以便识别，并将固定好的蜜蜂连同金属管置于湿润环境中，以防脱水。
- 用注射器向每只蜜蜂提供30%蔗糖溶液液滴，持续喂食5秒，随后让所有蜜蜂恢复30分钟，再开始触觉条件化训练实验。
2. 触觉条件反射
- 训练前，需对每只蜜蜂进行检测，以观察其对施加于触角的30%蔗糖刺激是否产生吻伸反应（PER）。检测时，蜜蜂的吻尖必须越过张开的下颚之间的一条假想线。对蔗糖刺激不产生PER反应的蜜蜂应全部弃用。
- 用于触觉训练时，使用一个黄铜立方体（例如 3 × 5 毫米，表面为光滑或雕刻图案， 例如，形成波长为150 μm的水平或垂直条纹光栅，作为条件刺激（CS）。非条件刺激（US）使用30%蔗糖溶液（家用白糖溶于水配制）。
- 将黄铜立方体（CS）放置在显微操作仪的支架上例如，Märzhäuser MM33）以确保在条件化过程中精确定位。使用装有30%蔗糖溶液的注射器向蜜蜂呈现非条件刺激（US）。
- 条件化程序包括触觉刺激（CS）与蔗糖溶液（US）之间的五次配对，每次试验间隔（ITI）为5分钟。将一只蜜蜂置于装有触觉刺激装置（CS）的显微操作器前方。缓慢移动CS，使触觉刺激物的表面与蜜蜂头部保持平行图1 A 和 B动物与触觉物体之间的距离应处于被测蜜蜂触角工作半径的范围内， 即 蜜蜂应能以舒适的姿势用两根触角扫描触觉刺激。在所示示例中 图1，距离为3 mm。让蜜蜂扫描触觉刺激（CS）5秒。在前3秒结束后，用注射器在喙下呈现一滴30%蔗糖（US）溶液。用注射器尖端轻轻抬起蜜蜂的喙。蔗糖对喙下的刺激将引发非条件性伸吻反应（PER）15让蜜蜂舔食蔗糖奖励。使用带报警信号的秒表，以确保在训练过程中保持精确的时间间隔。
- 条件化的 proboscis 伸展反应（PER）被用作衡量蜜蜂学习效果的指标。在经历首次获得奖励的配对刺激后，蜜蜂开始在条件刺激（CS）呈现时伸展其 proboscis，表明它们预期即将到来的奖励。在触觉刺激呈现的3秒时间窗口内，以及蔗糖呈现之前，只要观察到 proboscis 完全伸展，即记为一次阳性反应；无反应则记为阴性。实验者需记录 PER 是否发生。每次试验中，对呈现 CS 时表现出 PER 的蜜蜂百分比进行统计并绘图。
3. 运动学记录
- 使用配备合适微距镜头的数码摄像机记录一只被束缚的蜜蜂的触角运动例如 Basler A602f-2 配备 TechSpec VZM 200，通过火线连接以 50 fps 运行）。相机位于动物上方，采用俯视视角（图1 A）。在 图1，记录的空间分辨率为 0.02 mm/像素。
- 使用相机物镜从不同角度拍摄一个边长为1 mm、尺寸为10 × 10 mm的棋盘格图案的单张图像，以校准相机。可使用Matlab相机标定工具箱完成标定。16.
- 将一只固定的蜜蜂置于相机镜头下方。将固定在显微操作器上的触觉刺激物呈现给蜜蜂。按照触觉训练所述方法进行操作，并记录蜜蜂在扫描物体时的触角运动。确保能够清晰观察到触角的全部工作范围和触觉刺激物。所测试的刺激模式及试验次数根据实验设计而定。
4. 数据分析
- 图像背景的计算在 Matlab 中完成。首先，需要计算每个像素随时间变化的灰度中值。静态物体，例如蜜蜂固定的头部和触觉刺激装置，将构成图像背景；而运动物体，例如两条触角，则不会被包含在背景中。
- 录制视频的每一帧必须依次加载，并计算当前帧与图像背景之间的差异。这种减法运算的结果会突出显示图像中逐帧移动的部分。理想情况下，只有蜜蜂的触角区域具有非零值。图1C).
- 为进一步处理，假定具有非零像素值的两个最大区域为触角。针对每根触角，需生成一个二值掩膜，其中每个像素若属于触角则赋值为1，否则为0。该掩膜将作为后续定位触角尖端的基础。为获得整幅图像的初步掩膜，需将差分图像中每个像素的灰度值与预设阈值进行比较。由于噪声将在后续步骤中处理，因此该阈值设定得较低。初步掩膜仍包含两类误差：第一，由于图像噪声的存在，一些微小区域仍被保留在掩膜中；第二，属于触角的区域可能并非完全连通。后者主要出现在背景亮度与触角亮度相近的情况下。为消除这些伪影，需应用标准的图像处理形态学操作。 即 结合图像腐蚀与膨胀操作，依赖于标准的 Matlab 函数 imerode 和 imdilate 分别（参见17 第158-205页有进一步解释）。去噪处理后，触角假说仍包含在相同的掩膜内。因此，下一步使用标准Matlab函数对二值掩膜进行聚类，以分离出不相交的区域 bwlabel （参见17 有关图像分割算法的更多细节，请参见第40–48页。
- 统计每个簇的像素数量，并选择两个最大的簇。通过计算重心来区分左触角和右触角图1D).
- 每根触角的触角尖端可定义为在近端到远端方向上像素值最高的像素点（参见 图1D).
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结果
在以下实验中，我们研究了触觉学习如何影响蜜蜂的触角采样行为。为此，我们在呈现触觉刺激之前和期间，监测了未经训练的蜜蜂和已训练蜜蜂触角尖端的运动情况。
首先，记录一组花粉采集蜂（N = 42）1分钟内的自发触角运动。随后，其中一半蜜蜂（N = 21）接受条件化训练，将触觉刺激与30%蔗糖奖励配对呈现五次，此为条件化组。触觉刺激为一块黄铜立方体的30 x 50 mm表面，其上刻有水平光栅（λ= 150 μm另一半蜜蜂（N = 21）未进行条件训练，作为 naive 组使用。 图2 显示了蜜蜂条件化组的平均学习曲线。首次奖励后的条件化PER百分比与自发行为存在显著差异（图2，Fisher 精确概率检验，p < 0.001）。学习曲线在第3次后趋于饱和rd 奖励
随后，在触觉刺激存在的情况下，再次记录训练组和未训练组触角尖端1分钟内的运动情况。图3 A1 - B2...
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讨论
蜜蜂的准备：应尽快完成蜜蜂的采集与固定，以保持蜜蜂的应激水平较低。应激会影响蜜蜂的伸吻反应（PER）敏感性，因此可能间接影响蜜蜂的学习表现19, 20。采集后立即将装有蜜蜂的玻璃小瓶直接置于冰上，可快速使其 immobilize（固定不动），从而降低其应激水平。需要注意的是，麻醉时间越长，蜜蜂恢复所需的时间也越长。
视觉对蜜蜂的触觉学习具有负面影响18。因此，有必要通过涂抹蜜蜂的眼睛来遮蔽其视觉。为了提高视频记录的视觉对比度，建议使用白色涂料（例如，Tipp-Ex）。操作时应注意避免触角接触到涂料。
学习表现： 实验室和野外的早期研究表明，蜜蜂采集蜂对蔗糖的敏感性会影响其联想学习能力21, 22。较高的蔗糖敏感性与更优的触觉学习和辨别能力呈正相关。在一个采蜜季节的大多数周次中，蜂群中的花粉采集蜂平均对蔗糖的反应性高于采蜜蜂23。它们可通过后腿上的花粉团...
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披露
未声明任何利益冲突。
致谢
我们感谢 Joachim Erber 向我们介绍了蜜蜂的触觉学习范式。本工作由德国卓越计划框架内资助的卓越集群 277 CITEC 支持。
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 采集花粉的工蜂，Apis mellifera L. | 私人蜂箱 | ||
| 玻璃小瓶（22 × 45 mm） | Carl Roth GmbH & Co | X655.1 | |
| 黄铜管，10 × 30 mm | 自制 | ||
| 黄铜立方体，3 × 5 mm | 自制 | ||
| 修正液（无溶剂） | Tipp-Ex GmbH & Co KG | ||
| 蔗糖溶液（30%） | 家用糖溶于水 | ||
| 乙醇（70%） | Carl Roth GmbH & Co | 9065.3 | |
| 注射器（1 ml）和针头（0.6 × 25） | Carl Roth GmbH & Co | 59.1 | |
| 秒表 | Carl Roth GmbH & Co | L423.1 | |
| 显微操作仪 | Märzhäuser MM33 | 00-42-101-0000 | |
| 数字视频相机 | Basler A602f-2 | ||
| 相机用宏镜头 | TechSpec VZM 200 | ||
| Matlab R2009b | The MathWorks |
参考文献
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