基质血管细胞的分离与向米色/褐色样细胞的分化

摘要

从小鼠白色脂肪组织中分离得到的原代白色前脂肪细胞可分化为米色/褐色样细胞。本文介绍了一种可靠的细胞模型系统，用于研究白色脂肪“褐变”的分子调控机制。

摘要

棕色脂肪细胞具有解偶联线粒体呼吸链并将化学能以热能形式耗散的能力。在白色脂肪组织中（即所谓的米色或褐脂样细胞）出现表达UCP1的棕色脂肪细胞，可由多种环境刺激强烈诱导，例如长期寒冷暴露或PPARγ激动剂处理，因此这类细胞在肥胖治疗方面具有潜在的治疗靶点价值。尽管大多数永生化的脂肪细胞系无法在体外培养中重现白色脂肪“褐变”的过程，但从皮下白色脂肪组织（WAT）的基质血管组分中分离得到的原代脂肪细胞则为研究米色/褐脂样细胞发育的分子调控机制提供了可靠的细胞系统。本文介绍了一种有效分离原代前体脂肪细胞并在体外诱导其分化为米色/褐脂样细胞的实验方案。可通过检测棕色脂肪特异性标志物（如UCP1）的表达水平来评估褐变效果。

引言

肥胖在全球范围内急剧增加，现已被视为公共卫生最严重的威胁之一¹。该状况与能量摄入与消耗之间的失衡有关，导致多余能量以脂质形式储存在白色脂肪组织（WAT）中。WAT体积增大与体重和体质量增加相关，而棕色脂肪组织则具有将多余能量以热能形式耗散的能力。因此，棕色脂肪组织（BAT）可在抵御寒冷和肥胖方面发挥保护作用^2,3。这一过程通过线粒体中解偶联蛋白1（UCP1）介导的电子传递链解偶联实现。该蛋白被认为是BAT中非颤抖性产热的标志性分子³。近年来多项研究表明，成年人体内存在有功能活性的BAT^4-8，因此，调控人体BAT功能可能成为对抗肥胖及其相关疾病的一种潜在治疗策略。

现有证据表明，啮齿类动物体内存在两种类型的棕色脂肪细胞；“经典型”或“先天性”棕色脂肪在产前阶段发育形成，并在肩胛区及其他外周组织中构成专门的棕色脂肪库。另一方面，“可诱导型”棕色脂肪（即所谓的米色或 beige 细胞）在出生后阶段发育，散在分布于白色脂肪组织中。这两种棕色脂肪细胞还具有不同的发育起源。其中，先天性棕色脂肪细胞起源于类似成肌细胞的前体细胞。 Myf5 前体细胞，WAT中散在的可诱导的米色/褐色细胞来源于非-Myf5 谱系^9,10 此外，该细胞类型的调控通路可能与 Myf5-来源的棕色脂肪细胞 ¹¹. 米色细胞的发育（即 白色脂肪的“褐变”可在成年人中因长期寒冷暴露以及β3-肾上腺素能受体激动剂或PPARγ激动剂而被激活^12-14米色/棕色样细胞可能是调控整体能量平衡的一个有前景的治疗靶点，并有望成为肥胖治疗的一部分；因此，深入了解环境信号调控米色细胞发育的精确分子机制和信号通路具有重要意义。

为了理解白色脂肪褐变的分子调控机制， 体外 实验最适合用于前脂肪细胞的分化研究，因为其分化过程异步进行，难以检测到细胞 原位 ¹⁵尽管迄今为止关于脂肪细胞发育的研究主要使用3T3-L1、3T3-F442A或HIB1等细胞系进行，但这些细胞系似乎缺乏米色脂肪细胞的分子特征。相比之下，从皮下白色脂肪组织（WAT）中分离得到的原代脂肪细胞更有可能以细胞自主的方式重现白色脂肪褐变的过程。本文提供了一种从脂肪组织中有效分离基质血管组分（stromal-vascular fraction）并诱导白色脂肪在PPARγ激动剂作用下发生褐变的实验方案。已有研究表明，罗格列酮（Rosiglitazone）在这些细胞中是尤为有效的褐变诱导剂。如先前研究所提示 ¹⁶该细胞系统可用于构建可靠的细胞体系，以研究米色/褐脂样细胞的发育。

方案

1. 准备消化液

每5只小鼠每种组织制备5 ml（约每1 g脂肪组织1 ml）。

1. 称取消化酶：
   - 胶原酶 D：1.5 u/ml（1108874103，1 g，Roche，70334223）
   - 中性蛋白酶 II：2.4 u/ml（04942078001，0.980 mg/lyo，Roche，11466200）
2. 加入 25 ml PBS，充分混匀以溶解
3. 在组织消化前立即加入 CaCl₂，终浓度为 10 mM

2. 从小鼠中解剖脂肪组织

1. 解剖操作应小心进行，并在小鼠（6-8周龄）处死后立即开展。打开小鼠前，先用乙醇喷洒其体表毛发以确保无菌操作。将组织直接放入洁净的PBS中，分离肩胛间棕色脂肪组织（BAT）和腹股沟皮下白色脂肪组织（WAT）。
2. 对于肩胛间BAT：将小鼠背部朝上放置，沿背部切开至颈部。棕色脂肪组织位于肩部之间皮肤下方浅层，肉眼可见两个叶状、形似蝴蝶的结构。应小心去除覆盖在BAT表面的一层薄薄的白色脂肪。
3. 对于皮下WAT（腹股沟WAT）：去除皮肤后，可在身体两侧皮肤下方发现腹股沟WAT，其位置自近背部起始，沿大腿内侧延伸，向下接近睾丸区域。

3. 切割并消化脂肪组织

1. 迅速清除组织切片上的所有污染物，如毛发、骨骼肌和结缔组织。
2. 用纸快速吸干组织，避免PBS稀释解剖液，并将组织置于干燥的培养皿上。
3. 加入消化液（消化前已添加CaCl₂），并将组织切成小块。使用5 ml移液器反复吹打，充分混匀。将切碎的组织连同剩余消化液转移至50 ml离心管中，继续通过反复吹打进一步混匀。
4. 在37 °C、150 rpm持续振荡条件下消化40–50分钟。每10–15分钟检查一次，确保消化进展正常，并防止过度消化。

注意：正确的消化液和消化时间非常重要。组织需要充分消化，但过度消化可能会损伤细胞。

4. 过滤细胞悬液

1. 加入 5 ml 完全培养基（含 10% FPS 和 P/S 的 DMEM/F12）以终止消化。此时细胞应几乎完全均一。用移液器充分混匀。
2. 以 700 × g 离心 10 分钟。
3. 此时可见管底有棕褐色沉淀，即基质血管组分（SVF）。吸除上层油状成熟脂肪细胞层及大部分液体层，保留沉淀，并将其溶解于 10 ml 完全培养基中。充分混匀。
4. 将细胞滤网（50–70 μm 直径）置于新的 50 ml 管上，过滤细胞悬液。

5. 铺板细胞

1. 将细胞悬液转移至15 ml离心管中，在700 × g条件下离心10分钟。
2. 吸除上清液，用10 ml完全培养基重悬沉淀，用移液器吹打混匀。
3. 估算所需培养皿数量，该数量可能因沉淀体积而异。一般经验为：每5只小鼠的腹股沟白色脂肪组织可接种2个10 cm培养皿，棕色脂肪组织可接种1个10 cm培养皿。
4. 在胶原蛋白包被的培养皿（R&D）中，用完全培养基接种细胞。
5. 接种细胞后1–2小时，吸除培养基，用PBS洗涤两次，然后加入新鲜培养基。此步骤至关重要，可去除红细胞、免疫细胞及其他污染物。

6. 细胞分化

1. 制备维持培养基和诱导培养基。

维持培养基

添加成分后的完全培养基：

胰岛素，终浓度 5 μg/ml（5 mg/ml 储存液，***将 100 μl 乙酸加入 10 ml H₂O 中配制 pH 2.5 的酸化水。将胰岛素溶解于酸化水中。储存液保存于 -20 °C）

3,3',5-三碘-L-甲状腺原氨酸（T3），终浓度 1 nM（10 μM 储存液，***将 T3 溶于 1N NaOH 中，再加入培养基配制成 10 μM 储存液。Sigma 货号 T-2877）

4 °C 下保存，可稳定一周

诱导培养基

含有以下成分的维持培养基：

吲哚美辛，终浓度 125 μM（乙醇中 0.125 M 储存液，Sigma 货号 I-7378）。吲哚美辛需加热至 60 °C 方可溶解。

地塞米松，终浓度 2 μg/ml（乙醇中 2 mg/ml 储存液，Sigma 货号 D-1756）
3-异丁基-1-甲基黄嘌呤（IBMX），终浓度 0.5 mM（DMSO 中 0.25 M 储存液，Sigma 货号 I-5879）
罗格列酮，终浓度 0.5 μM（DMSO 中 10 mM 储存液，Sigma 货号 R-2408）

注意：每次均需新鲜配制诱导培养基。

2. 在完全培养基中培养原代脂肪细胞，直至细胞融合度达到95-97%（融合但不过于密集）
3. 将常规完全培养基更换为诱导培养基（第0天）
4. 48小时后（第2天），更换为含罗格列酮（0.5 μM）的维持培养基
5. 再过48小时后（第4天），更换为新鲜的含罗格列酮（1 μM）的维持培养基，继续培养2-3天。加入诱导培养基后6-7天，细胞完全分化为成熟的脂肪细胞，并充满脂滴。脂滴通常在诱导后3-4天开始出现

注意：每2-3天更换一次培养基，直至细胞完全分化。

现在可以收集细胞，并通过qRT-PCR检测Ucp1及其他棕色脂肪细胞特异性基因的mRNA表达水平。蛋白质检测将采用蛋白质印迹法（Western blot）进行。

结果

通过qRT-PCR检测Ucp1及其他棕色脂肪特异性或选择性基因的mRNA表达水平，可评估原代脂肪细胞的米色化程度。图1展示了来自腹股沟白色脂肪组织（WAT）的原代脂肪细胞的基因表达数据。细胞在两种不同浓度的罗格列酮（分别为50 nM和500 nM）存在下被诱导分化。部分细胞在收获前用10 μM的佛司可林处理4小时。该处理可诱导细胞内环磷酸腺苷（cAMP）水平升高，进而激活包括Ucp1表达在内的产热基因程序。

如图所示 图1A，罗格列酮显著诱导 Ucp1 mRNA表达。Forskolin处理（cAMP）进一步增强了罗格列酮诱导的UCP1表达。另一种棕色脂肪选择性基因， Cidea 表达也以剂量依赖性方式被罗格列酮强烈诱导（图1B). Fabp4 是 PPAR 的直接靶点γ 以及棕色脂肪和白色脂肪的脂肪生成标志物。如图所示 图1C, Fabp4...

讨论

在此，我们介绍一种可靠的细胞体系，用于研究小鼠原代培养脂肪细胞中米色/棕色样（beige/brite）细胞的发育。与目前已有的多种永生化细胞系相比，该体系可能更贴近白色脂肪组织褐变的生理过程 体内.

尽管对这些原代脂肪细胞的研究具有一些优势，但也存在一些重要的局限性和需要注意的问题。首先，该体系高度依赖于细胞的分化潜能。例如，棕色脂肪特异性基因 Ucp1 和 Cidea 的表达尤其依赖于分化程度。以 PPARγ 激动剂和 BMP7 为例，它们也能促进脂肪生成，因此必须在分化程度相近的细胞中合理评估其“棕色化”效应。或者，如 图 1D 和 E 所示，将棕色脂肪特异性基因的表达水平与脂肪生成标志基因（如 Fabp4）的表达进行归一化处理，可能是一种有效的分析方法。其次，小鼠的年龄至关重要。尽管使用体型较大的小鼠可能有助于获得更多数量的细胞，但由于分化能力随年龄增长而下降，因此这种做法并不理想。利用该培养体系，研究冷暴露、肥胖、胰岛素抵抗或衰老等内外...

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
<强>试剂
胶原酶D	罗氏	11088874103
Dispase II	罗氏	04942078001
CaCl2
DMEM 培养基	Fisher	10017-CV	含 2,5 g/l 葡萄糖 &以及不含丙酮酸钠的L-谷氨酰胺
胰岛素
T3（3,3',5-三碘-L-甲状腺原氨酸）	Sigma	T-2877
吲哚美辛	Sigma	I-7378
地塞米松	Sigma	D-1756
IBMX	Sigma	I-5879
罗格列酮	Sigma	R-2408
<强>仪器设备
胶原蛋白包被培养皿	BD	354450	10 cm 培养皿
70 μm 滤膜	BD Falcon	352350	细胞滤网，70 μm 尼龙 1/个