测量 Na,K-ATPase 和 H,K-ATPase 介导的阳离子转运 非洲爪蟾 通过原子吸收分光光度法检测卵母细胞：放射性同位素测定的替代方法

摘要

我们描述了一种通过在Xenopus卵母细胞中异源表达K⁺逆向转运P型ATP酶，并利用原子吸收分光光度法测定单个细胞对Rb⁺或Li⁺的摄取，从而定量该酶活性的方法。该方法是一种灵敏且安全的替代方案，可用于替代放射性同位素通量实验，有助于开展复杂的动力学研究。

摘要

而由生电性膜转运蛋白 Na⁺，K⁺-ATPase 可通过电生理学方法测定，该方法适用于电中性运作的胃 H⁺，K⁺-ATPase 的研究较为困难。许多转运实验利用放射性同位素以获得足够的信噪比，然而必要的安全措施对人员暴露和实验设计施加了严格限制。此外，跨细胞膜的离子转运受到膜电位的显著影响，而在细胞培养或蛋白脂质体体系中，膜电位的精确控制并不容易实现。本文中，我们利用原子吸收分光光度法（AAS）对化学元素痕量物质的高灵敏度，检测 Rb⁺ 或 Li⁺ Na+ 转运⁺，K⁺- 或胃H⁺，K⁺单细胞中的-ATPase。使用 非洲爪蟾 以卵母细胞作为表达系统，我们测定Rb的含量⁺ (Li⁺通过使用配备横向加热石墨原子化器（THGA）炉的原子吸收光谱仪（AAS）测定单个卵母细胞裂解液样品，来检测Rb被细胞摄取的情况，其中样品由自动进样器导入。由于非特异性Rb的背景⁺ 在对照卵母细胞中的摄取量或在应用ATP酶特异性抑制剂期间的摄取量均非常小，因此可以实施复杂的动力学检测方案，同时涉及大量实验条件，或高精度地比较位点特异性突变转运蛋白的转运能力和动力学特征。此外，由于阳离子摄取是在单个细胞水平上测定的，因此通量实验可与双电极电压钳（TEVC）技术联用，以精确控制膜电位和电流。这使得 例如 定量测定3Na⁺/2K⁺ Na的转运化学计量比⁺，K⁺-ATP酶，并首次实现了对电中性运作的胃H⁺/K⁺-ATP酶阳离子转运电压依赖性的研究⁺，K⁺-ATPase。原则上，该检测不仅限于K⁺-转运膜蛋白，但也可同样有效地用于研究重金属或过渡金属转运蛋白的活性，或通过内吞过程对化学元素的摄取。

引言

我们希望开发一种灵敏、安全且低成本的替代方法，以替代放射性示踪实验，用于研究离子跨膜转运蛋白的特异性转运活性，从而规避同位素实验室准入限制、安全要求，或因使用昂贵放射性同位素（如锂，因其衰变时间极短甚至无法获得）所带来的问题。我们尤其关注测定电中性运作的胃H⁺，K⁺-ATP酶，因为该酶不产生电流，因此其活性无法通过电生理方法进行检测。由于Na⁺，K⁺- 和 H⁺，K⁺-ATPase 转运 Rb⁺ 与 K 一样高效⁺ （和 Li⁺ 此外，原子吸收光谱法对铷或锂具有高灵敏度，有助于灵敏地检测转运活性。原子吸收分光光度计是化学实验室中常见的分析仪器，广泛分布于各类实验室，可供大量科研人员使用。此外，我们希望利用这一优势 非洲爪蟾 卵母细胞表达系统利用较大的单个细胞（直径约1.0–1.5 mm），可在同一批次中实现蛋白表达水平极低的细胞间变异度。一个简单的计算可证明原子吸收光谱法（AAS）检测的可行性：采用石墨炉原子吸收光谱法（THGA-AAS）检测铷的检出限（特征质量）为10 pg或1.2·10^-13 mol（Rb：85.47 g/mol），对于锂为5.5 pg或7.9·10^-13 mol（Li：6.94 g/mol）。在异源表达 Na⁺

方案

1. cDNA 构建及在 Xenopus 卵母细胞中的蛋白表达

目的膜蛋白的 cDNA 应克隆至适用于 Xenopus laevis 卵母细胞表达的载体中，例如 pTLN⁹ 或 pcDNA3.1X¹⁰。此类优化载体包含 Xenopus laevis β-珠蛋白基因的 5' 和 3' 非翻译区（UTR），两侧环绕多克隆位点（MCS）；在 5' UTR 前游位置含有 RNA 聚合酶启动子序列（pTLN：SP6，pcDNA3.1X：T7）；在 MCS 的 3' 方向含有一段多聚腺苷酸（poly-A）序列，以确保 cRNA 在细胞内的稳定性；此外，在更下游区域还含有另一段单一限制性内切酶识别位点序列，用于质粒线性化，从而作为 in vitro cRNA 转录的模板。

为了区分过表达的人源 Na⁺/K⁺-ATPase（α₂ 亚基 + β₁ 亚基）与卵母细胞内源性 Na⁺/K⁺-ATPase 的活性，引入了 Q116R 和 N127D 突变，以获得对乌本苷具有抗性的蛋白，其 IC50 处于毫摩尔浓度范围¹¹。对于 H⁺/K⁺-A....

结果

Rb 的定量分析⁺ K的摄取⁺-（或 Rb⁺)-交换性P型ATP酶通过AAS检测 非洲爪蟾 卵母细胞表达系统可实现酶动力学参数的可靠测定。

确定 Na⁺/K⁺-ATP 酶的转运化学计量比

对于生电性 Na⁺/K⁺-ATP 酶，可通过双电极电压钳实验测定 Rb⁺ 流量，以分析净电荷转运（泵电流的时间积分）与 Rb⁺ 转运之间的相关性。图1A 显示了用含 1 mM Rb⁺ 的溶液灌注表达 Na⁺,K⁺-ATP 酶的卵母细胞所诱导的泵电流记录（稳态电流幅值约为 40 nA）。对电流信号进行积分（电流轨迹下方的灰色阴影区域）得到总转运电荷量为 7839 nC（相当于 0.0822 nmol 电荷）。当同一只卵母细胞随后接受原子吸收.......

讨论

本方法用于测定表达 Na⁺,K⁺-ATP 酶或 H⁺,K⁺-ATP 酶的单个Xenopus卵母细胞对 Rb⁺（或 Li⁺）的摄取量，已被证实是一种多功能、灵活且准确的技术，可用于确定阳离子反向转运 P 型 ATP 酶的转运动力学或热力学参数^1,4,5,7,8。该方法是放射性示踪剂通量测定的安全可靠替代方案，能够在较短时间内回答广泛的实验问题。因此，使用放射性示踪剂获得的数据极为有限^24-27。原子吸收光谱法（AAS）尤其适用于 H⁺,K⁺-ATP 酶的研究，因为该酶具有电中性转运活性，无法通过标准电生理学方法进行分析。然而，本实验方案中展示的示例数据表明，将通量测定与电压钳技术结合，甚至可以解析电中性转运蛋白的电压依赖性。根据我们的经验，Na⁺,K⁺-ATP 酶的通量测定时间采用 3 分钟，H⁺,K⁺-ATP 酶采用.......

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
4.0 Ethicon Vicryl 缝合材料	Johnson & Johnson	V633H
来自Clostridium hystolyticum的 I 型胶原酶	Sigma Aldrich	C9891
High-Pure PCR 产物纯化试剂盒	Roche 应用科学	11732676001
无核酸酶水	Ambion	AM9937
mMessage mMachine SP6/T7 试剂盒	Ambion	1340, 1344
乌本苷八水合物	Sigma Aldrich	O3125
三卡因（3-氨基苯甲酸乙酯甲磺酸盐）	Sigma Aldrich	A5040
鸡蛋清来源的胰蛋白酶抑制剂 III-O 型	Sigma Aldrich	T2011
SCH28080	Sigma Aldrich	S4443
Analyst 800	Perkin Elmer	0993-5256
WinLab32TM	Perkin Elmer
BioPhotometer	Eppendorf	6131 000.012
硼硅酸盐毛细管	Science Products	GB150F-8P
血细胞比容管 3.5"	Drummond Scientific	3 000-203-G/X
空心阴极灯 锂	Photron	P929LL
空心阴极灯 铷	Photron	P945
微量移液器拉制仪	Narishige	PC-10 型
卵母细胞记录室 RC-10	Warner Instr.	W4 64-0306
Nanoject II 注射泵	Drummond Scientific	3-000-204
pCLAMP 软件	Molecular Devices
聚丙烯样品杯 (1.2 ml)	Perkin Elmer	B0510397
Speedvac - 浓缩仪 5301 型	Eppendorf	5301 000.210
THGA 管	Perkin Elmer	B3000641
Turbo TEC-10CX 放大器	NPI Electronics	TEC-10CX