缺血大鼠肺组织中的血管生成

摘要

肺部由体循环的支气管动脉和肺动脉共同供血。在大多数肺部病理情况下，是较小的体循环血管表现出显著的新生血管形成。肺血流的中断会促进支气管的快速血管生成。我们提供了诱导左肺动脉缺血以促进支气管新生血管形成的手术细节。

摘要

成年肺脏由体循环的支气管动脉以及经肺动脉流经的全部静脉血共同灌注。在大多数肺部病理状态下，通常是较小的体循环血管系统对增强肺灌注的需求作出反应，并表现出显著的新生血管形成。由肺动脉阻塞引起的肺血管缺血，已被证实可在人类及多种动物模型中迅速诱导体循环动脉的血管生成。尽管Weibel¹已对大鼠支气管动脉增殖的时间过程进行了详细的组织学描述，但介导这种新血管有序生长的机制尚不明确。本文提供了在大鼠中诱导左侧肺动脉缺血以导致支气管新生血管形成的具体手术操作细节。由于肺内存在两套血管床，对血管生成程度的定量分析带来了额外挑战。本文还提供了基于标记微球注射来评估功能性血管生成的方法。

引言

肺部的体循环血管生成现象已被广泛认知。在哮喘²、间质性肺纤维化³、癌症⁴以及慢性肺血栓栓塞⁵等疾病状态下，肺内及周围组织的体循环血管增生并侵入肺实质。然而，用于研究体循环而非肺循环特异性激活的动物模型却十分有限。在成年哺乳动物肺部，最可重复的体循环新生血管模型之一是诱导慢性肺动脉缺血后所引发的反应。在人类^5–7、犬⁸、猪⁹、绵羊¹⁰、豚鼠¹¹、大鼠^{1, 12, 13}和小鼠¹⁴中，左肺动脉阻塞后的反应表现为支气管动脉及肋间动脉的迅速增殖。肺缺血后体循环血管新生的机制在很大程度上仍不清楚，且尚未得到广泛研究。Weibel 的组织学研究¹已对大鼠左肺动脉阻塞后支气管血管生成的时间进程进行了详细描述。在此大鼠模型基础上，本实验室进一步聚焦于该过程中关键的生长因子以及新生血管对肺部生理功能的影响。研究结果表明，缺血早期CXC趋化因子CINC-3表达升高，而使用针对CINC-3受体CXCR2的中和抗体处理大鼠，可减轻血管生成¹³。肺缺血发生14天后新形成的支气管血管表现出异常，其蛋白质通透性显著增加¹⁵。左肺功能亦不正常，表现为弥散能力下降和肺容积减小¹⁵。尽管新生血管可能在慢性肺缺血期间有助于维持肺组织存活，但其结构与功能并不正常，可能对肺功能的持续下降产生促进作用。

该模型最引人关注的方面之一可能与其增殖性血管的空间分布有关。尽管由于缺血导致肺实质内释放生长因子，新生血管却起源于相对较粗大的上游支气管动脉。正常的支气管动脉起源于主动脉的一个细小分支，并在隆突处侵入气道树。因此，生长因子诱导动脉生成初始阶段的具体机制尚不明确。我们认为，大鼠的血管解剖结构与人类相似，为研究肺缺血期间体循环血管生成的机制提供了独特的机会。尽管在人类中左肺动脉完全阻塞较为罕见，但无论肺动脉阻塞的部位和大小如何，患者均会出现类似的支气管血管增多现象¹⁶。因此，本文详细描述了在大鼠中结扎左肺动脉的手术方法，并提供了一种量化血管生成程度的方法。

方案

所有在大鼠上进行的实验方案均经约翰斯·霍普金斯大学动物护理与使用委员会批准，并遵循美国国立卫生研究院（NIH）的指导原则。在条件允许的情况下，应于手术区域以外的独立区域对动物进行外科术前准备，以尽量减少手术部位的污染。

1. 麻醉/镇痛

1. 将大鼠（Sprague Dawley 雄性大鼠，125–150 g；Harlan，Indianapolis，IN）放入充满 3% 异氟烷的诱导室中。
2. 将麻醉后的大鼠置于手术板上，连接鼻罩和呼吸机，持续给予 3% 异氟烷麻醉。所有操作均采用无菌技术。用无菌布单覆盖大鼠，确保形成无菌手术区域。

2. 插管

1. 使用手术胶带将四肢固定于仰卧位。
2. 将大鼠从鼻罩中取出，用带垫镊子拉出舌头。
3. 使用14号套管针（内含钝化金属导丝）作为引导，从舌后方滑入气管。
4. 取出金属导丝，保留白色塑料套管在气管内。确保大鼠正常呼吸且气体可通过导管。
5. 将鼻罩更换为与导管直接连接的适配器，将大鼠连接至呼吸机（呼吸频率90次/分钟，潮气量8 ml/kg；Rodent Ventilator Model 683，Harvard Apparatus，Holliston，Massachusetts）。
6. 在眼睛上涂抹Puralube（Butler Schein，Dublin，OH）兽用眼膏。

3. 开胸术

1. 将大鼠右侧卧位放置，使用手术胶带固定四肢。
2. 剃除左侧肋骨区域的毛发
3. 使用小型真空吸尘器去除多余毛发。
4. 用酒精擦拭以建立无菌区域，随后使用聚维酮碘棉签（Dynarex Corporation, Orangebur, NY）。重复此过程两次，共进行三次消毒。
5. 在手术区域中央使用无菌解剖剪或无菌手术刀做横向切口。
6. 钝性分离各层组织和脂肪，直至肋骨（最深层为覆盖肋骨的薄层膜状结构）。
7. 数肋骨以确定第3肋^rd 肋间隙
8. 使用无菌45° Graefe镊子，在3之间进行钝性切开^rd 和 4^th 肋
9. 插入肋骨撑开器，轻柔牵拉，充分暴露胸腔并清晰显示肺组织，用胶带固定缝线以保持切口开放。

4. 左肺动脉结扎

1. 用90° Graefe镊子，右手将左肺向后移动。
2. 使用Dumont #5直镊，左手夹住左肺动脉和气道。左肺动脉位于气道上方。确保镊子与操作台面完全垂直。此外，最有效的操作是在最远端位置（最靠近肺实质处）夹起左肺动脉/左主支气管。通过左手操作将正在通气的左肺推开。
3. 使用Dumont #5 45°弯镊，在左肺动脉与左主支气管的自然分界处将其分离。此分界线在两者之间呈现为一条细而白色的线。
4. 直接在血管下方进行分离，不要穿透血管；将合拢的镊尖沿分离线平稳滑动。
5. 持续操作，直至镊尖明显将左肺动脉与左主支气管分开。仅需镊尖一小部分完全穿过即可。若在镊尖上可见血液，则表示尚未完全穿过，不应进行结扎。一旦穿过间隙，左肺动脉将位于镊子的弯曲部上。保持此位置不动。
6. 轻轻松开左手的直钝镊夹持力，用左手夹取一段预先剪好的缝线（约2-3英寸；6-0规格聚丙烯缝线；Myco Medical, Cary, NC）。
7. 打开夹持左肺动脉的弯镊，夹住缝线，沿弯镊弧度方向，轻柔地将缝线向上拉过左肺动脉与左主支气管之间的间隙。
8. 以方结结扎，阻断左肺血流，仔细剪除多余缝线。
9. 使用钝镊夹住肋骨，用带19 mm、3/8圆弧反向切割针（Myco Medical, Cary, NC）的4-0聚丙烯缝线（蓝色单丝）在止血钳中对肋骨缝合两针，注意避免缝合皮肤（仅缝肋骨）。
10. 先打一个松散的方结，充气使肺膨胀，施加呼气末正压（PEEP；2-5 cmH₂O），再次扩张肺后收紧结，并再打一个完整结，然后剪除多余缝线。撤除PEEP，观察30秒，确保肺不塌陷。局部滴加5滴布比卡因（APP Pharmaceuticals, Schaumbur, IL）。
11. 在切口处涂抹组织胶水，用棉签棒的尾端将皮肤对合压紧以闭合皮肤。在切口部位皮下注射布比卡因（2.0 mg/kg），术后每8小时一次，持续24小时，或直至动物恢复正常活动。由于该区域皮下组织极薄，单独缝合较为困难。当使用组织胶并压合皮肤时，皮下层也随之闭合。
12. 关闭异氟烷气体，但继续用空气对大鼠通气1-2分钟，直至出现自主运动。将气管插管从呼吸机上断开，并确认大鼠能够自主呼吸后再将其移除。
13. 用棉签擦拭眼睛上的Puralube，监测动物活动及恢复情况。腹腔注射盐酸丁丙诺啡（0.05 mg/kg，Butler Schein, Dublin OH）。术后每12小时给予镇痛药一次，持续48小时。

5. 左颈总动脉插管

为了在左肺动脉结扎后于预定时间点评估缺血左肺支气管灌注的程度，通过左颈总动脉向主动脉弓内注射标记的微球。大鼠的准备步骤同上1-2。

1. 沿颈部正中线剪开，钝性分离以暴露气管和左侧颈总动脉（微球注射部位）。
2. 插入充满肝素化生理盐水的导管，将PE20导管（Becton Dickinson，Sparks MD）的钝端插入血管，并连接至25 g针头、四通阀和1 ml注射器。
3. 将微球试剂瓶（15 μm 红色荧光聚苯乙烯微球，1 × 10⁶ 个微球/ml；Invitrogen，Eugene, OR）放入水浴超声仪中处理30秒。
4. 取出试剂瓶，涡旋混匀后通过20 g针头将0.5 ml（500,000个微球）吸入1 ml Hamilton玻璃注射器（Hamilton Company，Reno, NV）中。
5. 将Hamilton注射器连接至四通阀，并使用注射泵（流速：500 μl/min；Genie Plus，Kent Scientific，Torrington, CT）注入微球。
6. 取下Hamilton注射器，以500 μl/min流速用1 ml肝素化生理盐水冲洗装置。
7. 行全胸廓切开术，通过切断下腔静脉放血处死大鼠。
8. 取出左侧肺脏及其他目标组织。
9. 为从组织中提取微球，在放血后取完整的大鼠左侧肺组织，置于2M KOH溶液（4–6 ml）中。放入55 °C水浴中过夜以消化组织。加入Tween 80（0.25%）洗涤微球，涡旋振荡（10秒）后离心（2,000 rpm；20 °C，10分钟）。弃去上清液，加入2-乙氧基乙酸乙酯（1 ml），涡旋混匀后静置1小时。再次涡旋悬浮液并离心（2,000 rpm；20 °C，10分钟）。收集含有荧光物质的2-乙氧基乙酸乙酯水相，转移至比色皿中，使用Hitachi F-2500荧光分光光度计（激发波长612/发射波长618；Digilab，Holliston, MA）进行测定。

结果

血管铸型：大鼠左肺动脉缺血效应的结果如图1所示。图中显示的是支气管血管系统以及在左肺动脉结扎（LPAL）后28天左气道树广泛的血管网络的甲基丙烯酸甲酯铸型。为制备该铸型，通过降主动脉逆行灌注甲基丙烯酸甲酯混合物（红色），同时插管气管并灌注白色硅基材料。该血管铸型清晰地展示了肺内支气管血管新生的现象。尤为显著的是左肺大而扭曲的上游支气管血管。尽管本图未显示，右支气管基本无 крупных血管，仅存正常单一的右支气管动脉。

组织学：左肺组织切片中显示的气道血管化变化如图2所示。图中展示了LPAL术后3天和14天观察到的支气管血管。图2A为LPAL术后3天左肺的气道切片，可见位于气道壁内的显著支气管血管。插图为2A的连续切片，经PCNA（增殖细胞核抗原）染色，可见支气管血管内衬的PCNA阳性内皮细胞。图2B显示LPAL术后14天大鼠左肺切片，可见此时支气管血管体积增大，同时肺动脉萎缩。

功能性血管生...

讨论

在所有测试物种中，左肺动脉结扎可导致缺血肺组织发生显著的系统性新生血管化。我们介绍了在大鼠模型中实施该手术的详细操作步骤。通过血管铸型、组织病理学及 体内 标记结果显示支气管动脉增生并灌注肺实质。因此，可在与人类慢性肺血栓栓塞症相似的动物模型中研究支气管血管生成的机制。此外，这一具有临床相关性的小型动物模型为研究新生血管形成与功能提供了机会，而此类研究在人体实验中难以实施。

所列出的手术操作步骤已提供充分的细节，具备外科手术经验的动物技术人员应能迅速掌握这些技术。尽管我们的观察主要基于Sprague Dawley雄性大鼠（75-100 g），其他品系同样适用于此类研究。我们尚未系统评估支气管血管生成程度的年龄依赖性。本文还提供了左颈动脉插管操作的详细说明。我们采用将荧光微球逆行注入左颈动脉的方法，微球进入主动脉混合后最终滞留在左肺，以此作为缺血肺组织体循环灌注的标记，从而反映功能性血管生成情况。我们承认，该测量结果可能因注射期间心输出量的变化而存在变异性。然而，在测量前后持续监测大鼠的全身血压，结果表明其心血管状态并未发生改变。此外，图3

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
盐酸丁丙诺啡，Puralube	Butler Schein
布比卡因	APP Pharmaceuticals
聚维酮碘消毒棒	Dynarex Corporation
6-0 规格聚丙烯缝合线，3/8 圆弧反向切割针	Myco Medical
PE20 导管	Becton Dickinson
15 μm 深红色聚苯乙烯荧光微球	Invitrogen
1 ml Hamilton 玻璃注射器	Hamilton Company
仪器：
Genie Plus 注射泵	Kent Scientific
荧光分光光度计	Digilab
啮齿类动物呼吸机 Model 683	Harvard Apparatus
表 1. 特定试剂与仪器列表。