本文介绍了一种半自动化的微电液芯片方法，可按需诱导Caenorhabditis elegans产生运动。该方法基于线虫在微流控通道内对微弱电场产生反应的神经生理学现象（“电趋性”）。微流控电趋性技术是一种快速、灵敏、低成本且可扩展的方法，可用于筛选影响神经健康的因素。
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摘要
摘要
线虫 Caenorhabditis elegans 因其在疾病相关基因和通路方面与人类的高度保守性以及易于培养的特性，成为生物医学研究中一种多用途的模式生物。已有多种 C. elegans 疾病模型被报道，其中包括帕金森病（PD）等神经退行性疾病模型，该疾病涉及多巴胺能（DA）神经元的退化1。研究人员已利用转基因技术和神经毒性化学物质诱导线虫中 DA 神经元的退化及其导致的运动缺陷，从而可用于探究神经退行性变的机制，并筛选具有神经保护作用的基因和化合物2,3。
在C. elegans等低等真核生物中进行的筛选，为鉴定影响神经信号传导的化合物和基因提供了一种高效且经济的方法。传统的筛选通常依赖人工操作，并通过肉眼观察进行评分，因此耗时较长且容易引入人为误差。此外，大多数筛选主要集中于细胞水平的分析，而忽略了运动行为的评估，而运动行为对于运动障碍类疾病尤为重要。
我们开发了一种新型的微流控筛选系统（图1），该系统通过微通道内的电场刺激来控制并量化C. elegans的运动行为。我们已证明，直流电场（DC）可稳定地诱导线虫按需向阴极方向运动（“电趋性”）4。反转电场极性时，线虫会迅速改变运动方向。我们还发现，多巴胺能及其他感觉神经元的缺陷会影响其游泳反应5。因此，可通过运动行为作为读出指标来检测神经信号传导中的异常。运动反应可通过多种参数进行精确定量，例如游泳速度、身体弯曲频率和转向时间。
我们的研究发现，电趋向性反应随年龄而变化。具体而言，年轻成虫对较低强度的电场有反应，且运动速度比幼虫更快4。这些发现促使我们设计了一种新的微流控装置，用于按年龄和表型被动分选线虫6。
我们还测试了线虫对脉冲直流电和交流电（AC）电场的反应。不同占空比的脉冲直流电场均能有效诱导C. elegans及其近缘种C. briggsae7产生电趋性。在另一项实验中，频率范围为1 Hz至3 kHz的对称交流电场使线虫在通道内 immobilized（固定不动）8。
在微流控环境中施加电场，可实现趋电性实验的快速自动化操作。该方法有望促进针对影响神经元功能和存活率因素的高通量遗传学和化学筛选。
方案
1. 用于母模制造的光刻技术
- 将3英寸硅片浸入丙酮中30秒，然后浸入甲醇中30秒。用dH₂O冲洗。20 水，5 分钟。
- 用氮气吹枪吹干晶圆表面。在加热板上以 140 °C 加热 2 分钟。
- 等离子体处理硅片表面（1 分钟，50 W）。
- 用3 ml SU-8 100光刻胶在晶圆表面旋涂（40秒；1,750 rpm）。
- 将涂覆好的晶圆在热板上于 65 °C 预烘 10 分钟，然后在 2 分钟内将温度升至 95 °C，保持该温度继续烘烤 1 小时。
- 对齐包含所需通道设计的光掩模。将光刻胶暴露于550-600 mJ/cm的光照下。2 紫外光（350–400 nm）的。光掩模可在 AutoCAD 中设计，并通过高分辨率打印输出至透明胶片上。
- 在热板上对晶圆进行后烘烤，先在 65 °C 下烘烤 1 分钟，再在 95 °C 下烘烤 10 分钟，升温程序同前。
- 将晶圆浸入SU-8显影液中10–15分钟。用异丙醇冲洗以检查显影是否完成。若出现白色沉淀，则继续显影。主模具如图所示 图2A.
2. 微通道制备的软光刻技术
- 将35 ml聚二甲基硅氧烷（PDMS）弹性体基料与3.5 ml PDMS固化剂混合。
- 将制备好的母模（图案面朝上）和一片空白硅片放入铺有铝箔的培养皿中。
- 向母模所在的培养皿中倒入20 ml PDMS预聚物，向另一个培养皿中倒入15 ml。用一次性木质涂布棒轻轻按压硅片，以消除其下方的气泡。
- 盖上两个培养皿，静置一天使其固化。或者，为加快固化过程，先用真空脱泡仪去除PDMS中的气泡，然后将培养皿置于80 °C的加热板上加热2小时。
- 取下铝箔，将PDMS从硅片上剥离下来。
- 使用Harris Uni-Core（2.5 mm）在通道两端打孔作为流体通路接口。将通道部分和空白PDMS切割成尺寸相近的条状。
- 将通道条、空白PDMS条和一片玻璃载片（75×25 mm2）装入等离子氧化仪中（通常位于洁净室），在40 W功率下暴露于氧气等离子体中40秒。
- 将通道部分和玻璃载片分别粘附到空白PDMS条的两侧。静置2小时，以完成键合过程。
- 将组装件置于120 °C加热板上。使用PDMS预聚物将塑料管（内径1/32英寸，外径3/32英寸），每根至少6英寸长，连接至打孔形成的储液池。在一根或两根管上安装流体塑料接头，以便连接注射器，或使用市售的连接配件。
- 让固定管路的PDMS充分固化。在每个储液池中、进样管与通道之间，插入一段3英寸长的22号绝缘铜线，并用PDMS预聚物固定。最终成品如图2B所示。
3. 电趋性实验
- 将微通道置于显微镜载物台（最好是可移动的 XY 载物台）上，显微镜需配备连接至显示器的摄像头（图1）。
- 将电源或放大器的输出导线连接至微通道的电极。若仅需直流信号，使用简单的直流电源即可；但若需施加脉冲直流或交流信号，则需将放大器连接至信号发生器。
- 将微通道的出口管连接至一次性注射器。将入口管的管口浸入M9生理缓冲液中，并通过在注射器内施加负压（手动或使用注射泵）轻柔地将液体吸入通道。当入口和出口管均充满M9缓冲液后，将注射器从管路断开。将两根管路调节至相同高度，以防止静水压驱动的流动。
- 向通道施加直流电压，并确保电阻（R = V/I）约为0.6 MΩ（适用于长度为50 mm、宽度为0.3 mm、深度约为0.1 mm的微通道）。
- 若确认通道完好无损，可按照上述步骤将稀释悬浮液中的线虫加载至通道中。
- 断开注射器，并通过调节两根管路的相对高度以静水压方式控制流体流动。利用此方法将一条线虫移至通道中央，随后将两根管路平放至同一高度。
- 将电源调至适当电压：L3期线虫为4–12 V/cm，L4期为4–10 V/cm，青年成虫为2–4 V/cm。启动电场信号，并给予线虫1分钟的预暴露时间以适应电场。线虫应开始向阴极方向移动。1分钟后，使用摄像头开始录像。
- 对于交流电和脉冲直流电实验，可采用上述最大响应电场强度，并根据需要调节信号的频率和占空比7, 8。
- 实验结束后，将通道内的所有液体（及线虫）清除，用dH2O冲洗，并将装置置于125 °C的加热板上烘干。
- 使用NIH ImageJ（http://rsbweb.nih.gov/ij/）或基于MATLAB的自定义线虫追踪软件，从录制的视频中手动提取运动数据。
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结果
在补充视频1和图3中展示了野生型年轻成年线虫趋电性行为的代表性视频，以及虫体追踪软件输出的位置和速度数据。运动分析软件本身无法识别电场极性的方向及极性反转的时间；这些信息必须从原始视频中获取。可通过视频中的音频或视觉提示，或记录实验条件与操作过程来实现。
一组野生型（N2）和转基因动物（NL5901）的电趋性速度数据如图4所示。NL5901动物在unc-54（肌球蛋白重链基因）启动子的调控下携带人类α-突触核蛋白基因。该基因在体壁肌中表达的α-突触核蛋白会发生聚集9，我们的结果表明这会导致电趋性反应异常。NL5901线虫的运动速度显著慢于野生型。为绘制该图，我们计算了每条线虫的运动速度，并使用Minitab统计软件（http://www.minitab.com）以箱形图形式呈现结果。除...
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讨论
利用 Gabel 及其同事首次描述的行为现象，并基于 Chuang 及其同事的介电泳操控研究11,12，我们开发了一种基于微流控的电趋性检测方法，该方法以运动作为输出指标，可简便、稳健且灵敏地探测线虫中的神经活动。通过对运动参数的分析，可实现不同基因型之间的定量比较。微通道制造与电场施加的精确性共同提供了一个可控的环境，以及一种与线虫通信以控制其运动的手段。不同的电信号波形在线虫中表现出不同的行为响应，已被用于刺激和抑制运动。
本微流控装置的单通道设计要求每次只能对一条线虫进行评分。因此，在将线虫加载到通道中之前，必须用M9缓冲液充分稀释线虫溶液。需要特别指出的是，气泡或其他影响静水压的异常情况可能会使通道操作变得复杂。可通过用M9缓冲液冲洗通道并调节进样管和出样管的高度来消除此类问题。
本文所述的检测方法可进一步改进。多通道微流控芯片可加快线虫筛选速度，但需要整合其他控制机制，如线虫加载、定位和追踪。趋电性实验方案的进一步自动化，特别是计算机控制的流体管理，将提高实验效率。这些改进目前正在本实验室开...
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披露
微流控电趋性分析技术已在美国和加拿大申请专利。
致谢
作者感谢加拿大自然科学与工程研究理事会、加拿大研究主席计划、加拿大卫生研究院以及安大略省研究与创新部通过其早期研究人员奖计划提供的经费支持。
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 丙酮 | CALEDON Labs | 1200-1-30 | |
| 甲醇 | CALEDON Labs | 6700-1-30 | |
| 异丙醇 | CALEDON Labs | 8600-1-40 | |
| SU-8 | Microchem Corp. | Y131273 | SU-8 100 |
| SU-8 显影液 | Microchem Corp. | Y020100 | |
| 92×16 mm 培养皿 | Sarstedt | 82.1473.001 | |
| Sylgard 184 硅橡胶弹性体试剂盒 | Dow Corning | 包含弹性体基础剂和固化剂 | |
| 函数发生器 | Tektronix Inc. | 型号 AFG3022B | |
| 放大器 | Trek Inc. | 型号 2210-CE | |
| 注射泵 | Harvard Apparatus | 70-4506 | 型号 11 ELITE |
| 加热板 | Fisher Scientific | 11675916Q | 型号 HP131725Q |
参考文献
- Kuwahara, T., Koyama, A., et al. Familial Parkinson mutant α-synuclein causes dopamine neuron dysfunction in transgenic Caenorhabditis elegans. J. Biol. Chem. 281 (1), 334-340 (2006).
- Kuwahara, T., Koyama, A., et al. A systematic RNAi screen reveals involvement of endocytic pathway in neuronal dysfunction in a-synuclein transgenic. 17 (19), 2997-3009 (2008).
- Su, L. J., Auluck, P. K., et al. Compounds from an unbiased chemical screen reverse both ER-to-Golgi trafficking defects and mitochondrial dysfunction in Parkinson's disease models. Dis. Model Mech. 3 (3-4), 194-208 (2010).
- Rezai, P., Siddiqui, A., Selvaganapathy, P. R., Gupta, B. P. Electrotaxis of Caenorhabditis elegans in a microfluidic environment. Lab Chip. 10 (2), 220-226 (2010).
- Salam, S., Ansari, A., et al. A microfluidics set up to study neuronal degeneration and identification of neuroprotective compounds in C. elegans. , Submitted (2013).
- Rezai, P., Salam, S., Selvaganapathy, P. R., Gupta, B. P. Electrical sorting of Caenorhabditis elegans. Lab Chip. 12 (10), 1831-1840 (2012).
- Rezai, P., Salam, S., Selvaganapathy, P. R., Gupta, B. P. Effect of pulse direct current signals on electrotactic movement of nematodes Caenorhabditis elegans and Caenorhabditis briggsae. Biomicrofluidics. 5 (4), 044116(2011).
- Rezai, P., Siddiqui, A., Selvaganapathy, P. R., Gupta, B. P. Behavior of Caenorhabditis elegans in alternating electric field and its application to their localization and control. Appl. Phys. Lett. 96 (15), 153702(2010).
- van Ham, T. J., Thijssen, K. L., Breitling, R., Hofstra, R. M., Plasterk, R. H., Nollen, E. A. C. elegans model identifies genetic modifiers of alpha-synuclein inclusion formation during aging. PLoS Genet. 4, e1000027(2008).
- Brenner, S. The genetics of Caenorhabditis elegans. Genetics. 77 (1), 71-94 (1974).
- Gabel, C. V., Gabel, H., Pavlichin, D., Kao, A., Clark, D. A., Samuel, A. D. Neural circuits mediate electrosensory behavior in Caenorhabditis elegans. J. Neurosci. 27 (28), 7586-7596 (2007).
- Chuang, H. -S., Raizen, D. M., Lamb, A., Dabbish, N., Bau, H. H. Dielectrophoresis of Caenorhabditis elegans. Lab Chip. 11 (4), 599-604 (2011).
- Cronin, C. J., Mendel, J. E., Mukhtar, S., Kim, Y. -M., Stirbl, R. C., Bruck, J., Sternberg, P. W. An automated system for measuring parameters of nematode sinusoidal movement. BMC Genet. 6, 5(2005).
- Manière, X., Lebois, F., Matic, I., Ladoux, B., Meglio, J. -M. D. i, Hersen, P. Running worms: C. elegans self-sorting by electrotaxis. PLoS One. 6 (2), e16637(2011).
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