Method Article

基于微流体Electrotaxis的，为按需定量分析线虫'LOCOMOTION的

DOI:

10.3791/50226

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May 2nd, 2013

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1Department of Biology, McMaster University , 2Department of Mechanical Engineering, McMaster University

In This Article

Summary

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一个半自动化的微型电流体的方法诱导点播运动线虫进行说明。此方法是基于响应微流体通道内的温和的电场（"electrotaxis）蠕虫的神经生理现象。微流控electrotaxis供​​应快速，灵敏，低成本，可扩展的技术因素，影响神经细胞的健康屏幕。

Abstract

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线虫是一种多用途的生物医学研究的模式生物，因为其养护与疾病相关的基因和途径以及其易于栽培。几个C.线虫病模型已被报道，包括神经退行性疾病，如帕金森氏病（PD），这涉及多巴胺能（DA）神经元的变性。两种转基因和神经毒性的化学物质已被用于诱导DA神经退行性疾病和随之而来的运动在蠕虫的缺陷，允许调查的基础的神经退行性疾病和神经保护作用的基因和化合物2,3的屏幕。

在低等真核生物如C屏幕线虫提供高效和经济的手段来影响神经信号化合物的鉴定和基因。传统的屏幕通常手动进行，并取得通过目测，因此，它们是时间的利弊uming和容易出现人为错误。此外，大多数细胞水平分析的焦点，而忽略运动，这是一个特别重要的参数为运动障碍。

我们已经开发了一种新的微流体筛选系统（ 图1），控制和量化C.使用微通道内的电场刺激线虫的运动。我们已经表明，一个直流（DC）字段鲁棒可以诱导按需向阴极运动（"electrotaxis"）4。倒车领域的极性，导致蠕虫迅速扭转方向。我们还表明，多巴胺和其他感觉神经元中的缺陷，改变游泳响应5。因此，在神经元的信号的异常可以使用作为一个读出的运动来确定。采用了一系列的参数，如游泳速度快，身体弯曲次数及拨回时间可以精确量化的运动响应。

4。这些发现使我们能够设计一个新的微流体装置，被动蠕虫排序按年龄和表型6。

我们还测试蠕虫脉冲直流和交流电（AC）的电场响应。各种占空比的脉冲直流领域的有效生成两个C. electrotaxis 线虫和其表弟C. briggsae 7。在另一项实验中，对称的AC字段从1 Hz到3千赫的频率范围固定的通道8内的蠕虫。

执行的微流体环境中的电场使快速和自动地执行的electrotaxis检测。这种方法有望促进高通量遗传因素和化学屏幕影响神经细胞的功能和活力。

Protocol

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1。主模具制造的光刻

  1. 沐浴3英寸硅晶片，在丙酮中30秒，然后用甲醇，持续30秒。 DH 2 0水冲洗5分钟。
  2. 用氮气吹尘枪，晶圆表面干燥。晶片在140℃的热板上加热2分钟。
  3. 等离子氧化在硅晶片的表面上（1分钟，50瓦）。
  4. 旋涂晶圆的表面有3毫升SU-8 40秒100的光致抗蚀剂（1750转）。
  5. 的热板上预烘焙涂布的晶片在65℃下进行10分钟，然后坡道温度95℃2分钟。保持此设置为1小时。
  6. 将含有所需的信道设计的光掩模。揭露抵抗550-600兆焦耳/厘米2的紫外光（350-400纳米）。光掩膜的设计可以在AutoCAD上的透明度和打印用的高分辨率印刷。
  7. 晶片的热板上烘烤后，在65℃1分钟，95℃下10分钟，升温吨他前的温度。
  8. 晶圆浸泡在SU-8显影液10-15分钟。开发完成后用异丙醇冲洗检查。如果出现白色沉淀物，继续发展。 图2A所示的母模。

2。软光刻技术微通道的制备

  1. PDMS固化剂用3.5毫升，混合35毫升的聚二甲基硅氧烷（PDMS）弹性体基地。
  2. 将制作母模（图案朝上）和一个空白硅片到培养皿内衬铝箔。
  3. 进入到第二盘的模具师傅菜和15毫升，倒入20毫升PDMS预聚物。用一次性木制涂药轻轻....

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Results

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有代表性的野生型的年轻成年线虫的的electrotaxis和它的位置和速度输出蠕虫跟踪软件视频补充视频1和图3所示。运动分析软件本身不识别方向的场极性和极性反转的时间，而是必须获得这个信息从源视频。这可以通过使用在视频或音频或视频提示，写下的实验条件和操作。

从野生型（N2）和转基因动物中的一组（NL5901）electrotaxis高速数据将显示在图4。 NL5901动物进行人α-突触核蛋白基因UNC-54（肌球蛋白重链基因）启动子的控制之下。表达α-突触核蛋白体壁肌肉总量9，我们的结果表明，它会导致异常电trotactic响应。 NL5901蠕虫的速度明显慢于野生型。要绘制图形，我们计算了个别蠕虫速度和使用Minitab统计软件（ http://www.minitab.com ）在.......

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Discussion

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趁着加贝尔和他的同事和建设的介电电泳操纵工作的庄和他的同事11,12首次描述的行为现象，我们基于微electrotaxis检测提供了一个简单，强大而灵敏的方法来探测蠕虫使用运动神经元活动一个输出端。运动参数的分析，可以定量比较不同基因型之间。微通道制造和施加电场的精确度提供一个可控的环境和沟通的途径与蜗杆的运动控制。不同的电信号波形具有不同的行为在蜗轮的反射，并已被用于刺激和抑制运动。

本微流体装置的单声道的设计要求在一个时间只有一个单一的蠕虫进行评分。对于这一点，必须充分稀释蠕虫溶液与M9前缓冲试图加载蠕虫进入通道。重要的是要指出的是，可以是复杂的信道操作的存在气泡和其他影响的静水压力的凹凸。这可能被淘汰，冲洗通道M9和操作的入口和出口管的标高。

这里所描述的测定法可进一步提高。多通道微流控芯片可以加快蠕虫病毒筛查，虽然会需要集成其他控制机制，如蠕虫料，定位和跟踪。进一步自动化的electrotaxis协议，尤其是计算机控制的流程管理，提高工作效率。这些增强功能是在我们的实验室目前正在开发。

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Disclosures

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微electrotaxis检测技术已申请专利，在美国的美国和加拿大。

Acknowledgements

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笔者想感谢自然科学和工程研究理事会，加拿大，加拿大研究主席，加拿大卫生研究院，安大略省研究与创新部通过他们的早期研究者奖计划提供财政支持。

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Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
丙酮CALEDON Labs1200-1-30
甲醇CALEDON Labs6700-1-30
异丙醇CALEDON Labs8600-1-40
SU-8Microchem Corp.Y131273SU-8 100
SU-8 开发商Microchem Corp.
92x16mm 培养皿Sarstedt82.1473.001
Sylgard 184 有机硅弹性体套件康宁包含弹性体基底和固化剂
函数发生器Tektronix Inc.型号 AFG3022B
放大器Trek Inc.型号 2210-CE
注射泵哈佛仪器70-4506型号 11 ELITE
HotplateFisher Scientific11675916Q型号 HP131725Q
Y020100 道

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Kuwahara, T., Koyama, A., et al. Familial Parkinson mutant α-synuclein causes dopamine neuron dysfunction in transgenic Caenorhabditis elegans. J. Biol. Chem. 281 (1), 334-340 (2006).
  2. Kuwahara, T., Koyama, A., et al.

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