用于成像和膜片钳电生理学研究的巨型脂质体的制备

摘要

将功能性膜蛋白重构到特定组分的巨型脂质体中，结合膜片钳电生理技术，是一种强大的研究方法。然而，传统的巨型脂质体制备方法可能不利于蛋白质的稳定性。本文描述了从纯脂质或含有离子通道的小型脂质体制备巨型脂质体的实验方案。

摘要

将离子通道重构到化学成分明确的脂质膜中以进行电生理记录，是一种用于鉴定和研究这些重要蛋白质功能的强大技术。然而，传统的制备方法（如平面双层膜）限制了对重构通道及其膜环境所能进行的操作和实验。而更大、更类似细胞结构的巨脂质体则能够在不牺牲对脂质环境控制的前提下，实现传统的膜片钳实验。

电穿孔法是制备巨型脂质体的有效方法 >直径为10 μm，其原理依赖于在电极表面施加交流电压，作用于一层薄而有序的脂质膜。然而，由于经典方案要求脂质从有机溶剂中沉积，因此不适用于离子通道等结构较脆弱的膜蛋白，必须进行改进。近期已发展出从部分脱水的小型脂质体电形成巨型脂质体的实验方案，我们在实验室中已将其改进并应用于含蛋白质的脂质体。

本文介绍了由小脂质体分散液通过电场形成法制备巨型脂质体的背景知识、仪器设备、技术要点及注意事项。我们首先讲解经典实验方案，建议在掌握此基础方法后再尝试后续更具挑战性的方案。我们将演示利用饱和盐溶液的蒸气平衡对小脂质体进行可控部分脱水的过程。最后，展示电场形成法本身的实施步骤。文中将描述一种结构简单、成本低廉、可自行搭建的实验装置，用于制备高质量脂质体，并介绍在各个制备阶段如何通过显微观察来确保最佳结果。

引言

巨型脂质体（通常称为巨型单层囊泡，或 GUVs）主要被用于研究脂质双分子层的物理及物理化学性质，包括双分子层形变、侧向相共存（“脂筏”）、膜融合等。 等等^1-4它们具有明显的细胞样结构：由膜构成的球形外壳包裹着内部的水相环境，该水相环境可轻易地与周围缓冲液的组成不同。根据定义，其直径约为 ≈1–100 μm，因此可采用多种光学显微镜技术进行成像。通过渗透压梯度或施加机械张力，可使这些囊泡保持紧绷状态，从而在总体柔软的同时具备可调控的物理特性，便于操作。特别是，通过调控脂质体的“刚度”，可简便地形成用于电生理记录的“脂质体附着”或“游离膜片”。过去，离子通道的重构主要在平面脂双层中进行。如今，得益于能够从巨型脂质体上形成膜片，并结合常规电生理技术所发展出的丰富工具集（如荧光显微镜、微管吸吮、快速灌流和温度控制）， 等等。使得巨型脂质体在重建研究中日益具有吸引力^5,6.

人们已采用多种策略制备巨型脂质体。事实上，当干燥的脂质膜被重新水化时，巨型脂质体会通过溶胀过程自发形成^4,7,8。为了更快地制备尺寸更大、更均一的脂质体，研究人员开发了其他方法，其中最主要的是电场诱导成脂法^1,9。该方法同样依赖于对干燥脂质膜的水合作用，但通过在脂质膜两侧施加交变电场来加速成脂过程。电场通过两个电极施加，电极可以是铂丝，也可以是涂有氧化铟锡（ITO）的玻璃载片，两者之间由水或缓冲液隔开，脂质则沉积在电极表面。通过加快脂质体的溶胀速度，可以获得更高产量的大尺寸脂质体。因此，电场诱导成脂法已成为制备巨型脂质体的默认方法⁴。

电致形成机制尚未完全阐明，大多数方案均基于经验开发（例如 ^10,11）。然而，通过理论分析和一些实验结果，我们可以初步了解预期现象。普遍认为，电致形成是通过驱动沉积脂质膜中堆叠的单个脂双层之间缓冲液的电渗流而发生的^10,11。脂双层热涨落与静电耦合可能也参与其中¹²。这些假说定性地预测了可用电场频率和强度的上限^10,12。特别是，高电导率溶液（即 生理盐溶液）会减弱可能启动脂质体电致形成的电液动力作用力¹²。电渗流速率通常随盐浓度增加而降低，并常在某一电场振荡频率处达到峰值（例如 尽管在不同几何结构中，Green et al.¹³）。因此，在一定范围内，对高电导率溶液采用更高的场强和更高的频率是合理的¹⁰。

然而，膜蛋白可能与通常用于电致膨胀实验中将脂质沉积到电极上的方法不兼容，即使用有机溶剂溶解脂质，随后蒸发溶剂留下一层薄脂膜。解决这一难题主要有两种途径：一是在巨型脂质体形成后将蛋白质掺入，二是改进脂质的沉积方式。我们的方法借鉴了前人的研究^5,11，通过将脂质和重组膜蛋白共同从含有小或大“蛋白脂质体”（proteoliposomes）的悬浮液中沉积下来。我们已在其他地方详细描述了由纯化蛋白和脂质制备蛋白脂质体的复杂且耗时的过程（Collins 和 Gordon，正在审稿中）。本文描述的是不含任何蛋白质的实验方案，但该方案在掺入蛋白质时同样适用；我们提供了实验结果，证明含有离子通道 TRPV1 的蛋白脂质体可被转化为 GUVs，并可用于膜片钳电生理学研究。在任何电形成方法中，脂质沉积过程中对脂质样品进行目视检查对于实验成功至关重要。

我们的方法可能不仅适用于离子通道重建这一特定应用。自从我们首次开发该方案至今，已有研究显示，用于电形成（electroformation）的脂质在电极上的沉积方式会影响所形成的大单层囊泡（GUVs）的组分异质性。Baykal-Caglar 等¹⁴ 研究表明，由经过仔细脱水的脂质体形成的GUVs，其相变混合温度的变异程度比从多种磷脂与胆固醇混合物直接形成的GUVs低2.5倍。他们的工作表明，当脂质（尤其是胆固醇）从有机溶剂中沉积时，可能会发生沉淀，导致沉积脂膜在空间上的组分存在显著差异。这一点对于脂质膜相行为的研究尤为重要，也可能对离子通道功能的定量实验至关重要。Baykal-Caglar 等 的实验方案与我们的方案相似但不完全相同，建议读者同时参考其方法。

本方案（参见概述，图1）是可采用的多种方法之一。原则上，电泳成形的成功与否取决于脂质混合物、水合程度、温度、其他溶质（尤其是离子），以及成形过程中所使用的电压和频率。随着对电泳成形机制的理解不断深入，我们预期将进一步优化本方案。

最后，电形成巨型脂质体通常存在较大的学习难度。我们建议先掌握常规实验方案（第1和第4节，如有需要还包括第5节），再学习从脂质体悬浮液中沉积脂质的方法（第2至第5节）。

方案

1. 从有机溶剂中沉积脂质：经典方案

1. 从 -20 °C 或 -80 °C 条件下取出脂质，升温至室温。 注意： 脂质具有极强的吸湿性，且许多脂质对氧气敏感。应以干燥的氩气或氮气覆盖脂质 所有步骤中均应尽量减少暴露于空气.
2. 必要时，将脂质悬浮于氯仿或环己烷中，浓度为1-10 mg/ml；注意，厂家提供的浓度通常仅为标称值。 警告：使用有机溶剂时应佩戴适当的手套及其他个人防护装备。若溶剂溅到防护装备上，应迅速脱除，因为大多数材料对这些溶剂仍具有渗透性，只能提供暂时的保护。
3. 用乙醇清洁两片25 × 37.5 mm的ITO镀膜玻璃载玻片的两侧
4. 按所需摩尔比例混合脂质。每1 cm² 根据需包被脂质的ITO载玻片面积，混合约15–20 μg脂质。例如，若要完全包被两张25 × 37.5 mm的载玻片，通常使用30 μl浓度为10 mg/ml的脂质混合物。 注意： 加入0.1 mol% Texas Red-DPPE用于荧光成像，荧光染料的使用注意事项见下文。
5. 使用欧姆表或万用表测量玻璃载片上ITO涂层一侧的表面电阻，以确认其朝上放置。
6. 将脂质吸入耐溶剂的注射器中。 注意： 除聚四氟乙烯（PTFE）外，不得使用任何胶水或塑料接触有机溶剂。
7. 在注射器针头不完全接触ITO表面的情况下，缓慢挤出脂质，并来回移动针头划过载玻片表面。尽量均匀覆盖整个表面，观察玻璃表面是否出现“彩虹光泽”。
8. 将载玻片迅速置于 < 1 Torr（1 mmHg）真空条件下抽气0.5–1小时，以除去残留溶剂。用惰性气体解除真空。
9. 涂抹一层薄薄的硅脂于硅胶垫圈的两侧，然后将其贴合。在载玻片的一端至少留出5 mm未覆盖的载玻片区域。
10. 继续 立即 至第4节

2. 用于可控脱水的小型脂质体的制备

1. 按照步骤 1.1 至 1.4 制备脂质混合物。
2. 在直径为 10–15 mm 的培养管中，使用氩气或氮气气流干燥脂质。对于少量脂质（≤0.5 mg），在真空条件下放置 0.5–1 小时以去除残留溶剂后，所得脂膜可直接进行水合；继续进行步骤 2.5。较大剂量的脂质容易在较厚的凝胶中包裹有机溶剂，即使在真空条件下也难以完全去除，因此更适合通过冷冻干燥制备；参见步骤 2.3–2.4。
3. 将干燥的脂质膜悬浮于环己烷中，通入氩气后用塞子密封，将试管置于冷块中，并在 -80 °C 下冷冻至少 1 小时。
4. 将冷块和脂质样品放入可达到 100 mTorr 真空度的真空系统中。开始抽真空，随着溶剂升华，真空度会“停滞”在约 1 Torr。待溶剂完全去除后（约 1 小时），真空度将降至该值以下。随后用惰性气体释放真空，并密封试管或立即进行水合。
5. 在脂质处于真空状态的同时，使用真空和鼓泡法对水合缓冲液进行脱气处理^15–17。
6. 使用脱气后的缓冲液以终浓度 1–10 mg/ml 对脂质进行水合。让脂质缓慢水合。30 分钟至 1 小时后，涡旋振荡以打碎残留的团块。再静置 0.5–1 小时，确保水合完全。在后续步骤中可使用渗透压调节剂（如山梨醇或蔗糖，浓度不超过 200 mM），以防止脂质完全脱水。
7. 通过挤出法制备直径为 100–200 nm 的脂质体。具体操作详见制造商提供的挤出方案。注意：若缓冲液离子强度超过约 25 mM，则在第 4 节中需采用特殊的电形成电压方案。

3. 通过小脂质体的受控脱水沉积脂质

1. 注意：本方案要求将脂质置于饱和盐溶液的蒸气平衡环境中数小时。我们强烈建议在惰性气体氛围中进行该方案，可使用手套箱或类似密闭装置。
2. 注意：若制备含蛋白质的样品，应避免完全脱水。可在密闭容器内放置盛有温水的烧杯或使用超声波加湿器，以维持环境湿度。使用湿度计确保相对湿度至少达到30%。作为额外预防措施，可在小体积脂质体缓冲液中加入山梨醇或蔗糖，以防止完全脱水。
3. 配制适当相对湿度的饱和盐溶液。目标湿度取决于囊泡制备物的渗透压。对于生理渗透压的样品，应使用30–45% RH；而对于低渗透压的囊泡制备物，可在75–90% RH条件下充分脱水（另见表1）。
4. 将饱和盐溶液与过量盐一同放入可严密封闭的容器中，容器内需设有内层搁板。市售的酸奶或麦片食品容器效果良好。加液后重新放回搁板，并确保液面低于搁板5–10 mm。
5. 按第1节所述方法清洗ITO镀膜载玻片。使用万用表确定导电面，并在非导电面标记样品名称。
6. 用少量润滑脂轻轻涂抹硅胶（USP VI级）垫圈的两面，垫圈上有一个或多个孔。
7. 将载玻片导电面朝上放置于实验台，将硅胶垫圈贴附在需涂布脂质的每片载玻片上，确保一端至少露出5 mm载玻片，以便连接电泳形成装置。压平垫圈以确保密封良好。
8. 用低盐等渗缓冲液将囊泡制备物稀释至约1–2 mg/ml。我们发现浓度过高会导致结果不佳。
9. 以1–10 μl的液滴形式将脂质涂布于载玻片上。通常较小的液滴效果更佳。
10. 将载玻片置于盛有饱和盐溶液的容器内搁板上，严密封闭容器。室温下静置3小时或过夜。容器也可置于4 °C环境中，但需注意某些盐类的相对湿度对温度高度敏感，且低温会延长平衡时间。
11. 所得脂膜可能呈现轻微彩虹光泽，但总体应接近完全干燥状态。高渗透压的起始溶液可能无法完全干燥成脂膜；但这不会对实验结果产生不利影响。

4. 巨型脂质体的电形成

1. 脂质膜，尤其是由脱水脂质体形成的脂质膜，容易脱落。小心地通过将27 G针头置于垫圈边缘并缓慢地加入缓冲液来水合每个孔。缓冲液可包括水、≤200 mM蔗糖、≤1 M山梨醇和≤5 mM HEPES。盐浓度超过10 mM的溶液可能需要采用不同的电致形成电压方案。每个垫圈孔应多加约10%的液体以确保过量填充。
2. 注意：一旦脂质被水合，应迅速进行后续步骤，因为脂质膜会立即开始脱层。若立即开始电致形成过程，可使产率和囊泡尺寸最大化。
3. 以一个流畅的动作，将第二片ITO载玻片（导电面朝内）放置在垫圈顶部。确保在垫圈区域外侧至少有5 mm的悬垂部分，并与第一片的悬垂方向相对。轻轻按压以确保良好的密封。
4. 使用乙醇清洁两个悬垂部分，并用万用表确认面向垫圈的表面具有导电性。
5. 如有需要，可用Parafilm封口膜或轻张力弹簧夹进一步固定反应室。
6. 通过将铝条或铜条、“EMI屏蔽垫泡沫”或导电胶带固定在两片载玻片的导电表面上，将电致形成室连接至电压源。我们使用EMI屏蔽垫泡沫。夹具和夹子的设计如图5所示。
7. 使用万用表检查两个电极之间是否存在短路，并确认电极与ITO表面之间连接良好。
8. 将反应室加热至高于任一脂质组分最高相变温度10 °C；例如，对于DPPC，应至少加热至52 °C，即高于其脂肪酸链熔点温度42 °C的10 °C。
9. 对于低盐缓冲液，施加频率为10 Hz、每毫米两ITO涂层间距约0.7 V_rms的正弦波电压，持续60–90分钟。对于高盐缓冲液，应使用其他电压方案（参见参考文献）。

5. 成像与故障排除

1. 使用配备罗丹明或德克萨斯红染料滤光片的倒置显微镜观察脂质体。脂质体应呈球形，肉眼观察主要为单层结构，且无“丝状物”等从脂质体延伸出的缺陷。
2. 若脂质体过小，可减少脂质用量。
3. 若存在大量缺陷或脂质体数量较少，可能是由于凝胶相脂质所致。可考虑提高电形成温度。
4. 若由脱水的小脂质体几乎未形成或完全未形成巨型脂质体，可降低脂质体缓冲液的渗透压，或提高电形成缓冲液的渗透压。缓冲液涌入浓缩的间隙缓冲液溶液可能导致沉积的脂质膜发生剥离。
5. 若囊泡的产率、质量或尺寸不佳，且在电形成或脂质体缓冲液中添加了盐类或pH缓冲剂，可考虑采用其他电形成电压方案。例如，Pott et al.¹¹ 推荐一种三步法方案：使用500 Hz正弦波，电压在30分钟内从50 Vpp/m升至1,300 Vpp/m，保持90分钟，然后在30–60分钟内将频率降至50 Hz。此情况下可能需要使用铂或钛电极，但这不会显著改变实验方案。

结果

在我们的示例中，我们使用约55 mol% POPC（1-棕榈酰-2-油酰-sn-甘油-磷胆碱），15 mol% POPS（1-棕榈酰-2-油酰-sn-甘油-磷脂酰丝氨酸，30 mol% 胆固醇，以及 0.1 mol% 德州红标记的 1,2-二棕榈酰-sn-磷脂酰乙醇胺（TxR-DPPE）。该组分的选择旨在大致代表背根神经节脂质的组成¹⁸我们注意到，15 mol%的带电脂质（此处为POPS）已接近电穿孔法成脂质体时可使用的上限例如 Walde 等⁴).

通过水解和过氧化作用导致的脂质降解对许多脂质混合物以及许多敏感性实验而言是一个尤为重要的问题（见讨论部分）。仅为了视频演示的清晰起见，本实验未使用惰性气体环境。从下图可以明显看出，这并不会显著影响脂质体的质量；但在进行敏感性研究或使用高度不饱和脂质时，防止脂质降解至关重要。

由于电形成过程中的主要难点是在氧化铟锡（ITO）基底上形成良好的脂质膜，因...

讨论

巨噬脂质体的电形成技术已发展为一种灵活的方法，可兼容多种脂质、制备方式和缓冲液体系。脂质沉积过程的精确控制是实验成功最关键的环节。我们已提供了一些简单工具，使得从小规模脂质体制备中实现可控的脂质沉积变得简便易行。相对湿度对于初始脂质体的充分脱水至关重要，而最佳湿度值将随脂质体悬液中初始溶质浓度的不同而变化。浓度较高的样品需要更低的相对湿度才能充分脱水至适当程度。

精确的水合方案以及用于电场成形的电场参数仍是当前讨论的焦点^{1,4,7,10,11,22}。在尝试于高盐浓度、带电脂质或高相变温度脂质的高浓度条件下进行脂质体电场成形之前，应首先掌握最基础的实验方案。一旦掌握这些基本技能，更高级的方案通常将电场成形过程分为三个阶段：初始溶胀、生长和脱离。初始溶胀阶段似乎更有利于在缓慢增加外加电场强度的条件下进行¹¹。第二个可选阶段是在固定电场强度下进行，有助于调控脂质体的最终尺寸。最后，降低交变电场的频率可能有助于脂质体从ITO表面脱离。在生理盐浓度条件下进行脂质体电场成形需要更高的频率¹¹，但脂质体可在极宽范围的电场频率和振...

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
数字万用表	Agilent Technologies, www.agilent.com	U1232A 或类似型号	任何万用表均可使用，但应避免使用老式模拟欧姆表，因其会对被测电阻施加过大的电流。
	Fluke	117 或 177	任何万用表均可使用，但应避免使用老式模拟欧姆表，因其会对被测电阻施加过大的电流。
函数发生器	Agilent Technologies, www.agilent.com	33210A 或类似型号	大多数函数发生器适用于简单实验方案。该可编程型号适用于高级电致形成实验方案。请确保发生器能够在 50 Ω 负载下输出 10 V 峰峰值电压。
氧化铟锡（ITO）镀膜玻璃载片	Delta Technologies, Loveland, CO www.delta-technologies.com	CB-90IN-S107 或类似型号	将这些载片对半掰断，制成两个尺寸为 25 mm × 37 mm 的载片。
温度控制器	Omega Engineering Stamford, CT www.omega.com	CNi3233 或类似型号
湿度计	Extech, Nashua, NH, www.extech.com	445815
硅橡胶片	McMaster-Carr Elmhurst, IL www.mcmaster.com	87315K64	使用 USP VI 级硅胶，因其具有高纯度。
电磁干扰（EMI）密封垫	Laird Technologies www.lairdtech.com	4202-PA-51H-01800 或类似型号	由 Mouser 分销 www.mouser.com
TxR-DHPE	Life Technologies, Carlsbad, CA www.lifetechnologies.com	T1395MP	其他荧光标记脂质也可获得，但 TxR-DHPE 是其中最亮且光稳定性最好的之一。
POPC	Avanti Polar Lipids, Alabaster, AL www.avantilipids.com	850457P 或 850457C	脂质可订购粉末形式（P）或氯仿溶液形式（C）
POPS	Avanti Polar Lipids	840034P/C
胆固醇	Sigma-Aldrich	C8667