垂直T型迷宫选择实验用于节肢动物对气味物质的反应分析

摘要

本文描述了一种用于检测节肢动物行为反应的垂直T型迷宫嗅觉仪。该嗅觉仪可使实验者测量受试对象在两种潜在气味场作用下的选择行为。利用此装置可测定动物对气味物质的趋性及避性反应。

摘要

鉴于昆虫和蛛形纲动物作为农作物害虫、城市环境害虫或植物及人类疾病传播媒介所具有的重要经济影响，目前正开发多种技术作为防控工具。其中一部分工具专注于通过引诱或驱避来改变节肢动物的行为，因此节肢动物常常成为行为学研究的重点。目前已开发出多种用于测量节肢动物行为的工具，包括风洞、飞行转轮、缓释球以及各类嗅觉仪。这些工具的目的是测量昆虫或蛛形纲动物对视觉刺激或更常见的嗅觉刺激的反应。本文所述的垂直T型迷宫嗅觉仪可用于检测昆虫对引诱剂或驱避剂所做出的选择行为。该装置是一种高通量检测设备，利用了多数节肢动物所具有的正趋光性（趋向光线）和负趋地性（倾向于向上行走或飞行）特性。该嗅觉仪由一根30 cm长的玻璃管构成，中间用聚四氟乙烯条分隔形成T型迷宫结构。迷宫的每一半构成嗅觉仪的一个臂，使测试对象能够在涉及引诱剂的实验中选择两种潜在的气味区域。在涉及驱避剂的实验中，还可将测试对象对已知引诱剂正常反应的缺失作为第三个变量进行测量。

引言

节肢动物（包括昆虫和蛛形纲动物）常被视为害虫，因为它们在农业或城市环境中会与人类争夺资源，或传播致病病原体¹。为此，人们投入大量资金研发害虫防控工具。这些工具种类繁多，其中利用行为引诱剂或驱避剂来调控或利用害虫自然行为的生物合理防控手段已取得显著进展^2,3。

节肢动物害虫通常依赖嗅觉信号或线索来寻找配偶和/或寄主⁴。因此，发现有效的害虫引诱剂或驱避剂通常可促进防控工具的开发。这一发现过程包含多个步骤。首先，必须了解测试对象的自然行为。例如，需要确定某一物种的某一性别是否能够吸引异性以实现配偶定位。如果是，则需进一步确定这种吸引是否由化学物质介导，以及该化学物质的产生部位。后续步骤包括确定该化学物质的产生时间及其最终鉴定。在整个过程中，必须测试测试对象（昆虫或螨类）对气味物质的行为反应。最初，将测试测试对象对天然物质的行为反应。例如，可测试雄性蛾对同种雌性个体信息素腺体提取物的反应。或者，可测试植食性害虫对其寄主植物天然气味的反应。尽管这些研究通常以开发管理工具为实际目标^5,6，但也可用于探讨更基础的科学问题，例如物种形成⁷。后续步骤则涉及测试节肢动物对已鉴定天然产物的合成类似物的行为反应。

了解节肢动物对化学物质的反应需要开发适当的工具来测量其行为。此类工具生成的数据取决于研究者在受控环境中测量自然行为的能力。六十多年前，人们开发了持续飞行嗅觉仪和风洞来测量昆虫对气味物质的反应^8,9。嗅觉仪在设计上差异显著，通常根据所研究的特定昆虫或问题进行定制。本文旨在描述一种垂直取向T型迷宫嗅觉仪的设计与使用方法，用于测量昆虫对气味物质的反应（图1）。该嗅觉仪的垂直结构利用了多种昆虫表现出的负向地性（趋向向上移动）特性。在嗅觉仪正上方设置的光源则利用了多种昆虫表现出的正向趋光性（趋向光源移动）特性。该装置特别适用于那些在水平取向嗅觉仪中不易表现出移动行为、且其定向行为受光强显著影响的半翅目昆虫。然而，该设备也可广泛用于多种飞行和爬行昆虫，以及蛛形纲动物。该嗅觉仪可用于评估引诱剂和驱避剂。对于引诱剂，通过在其中一侧释放待测引诱剂，而在另一侧释放洁净空气，形成分叉的气味场（图1）。当从嗅觉仪底部释放的昆虫选择进入两个气味场之一时，即记录为一次选择行为。对于驱避剂，可能存在第三种行为表现：除了向上进入任一气味场外，还可记录昆虫未向上移动的情况，这表明刺激物无反应性，或两个气味场均具有驱避作用。

方案

1. 如 Mann 等¹⁰ 之前所述，一种定制设计的双端口分体式 T 形嗅觉仪的组装如图1所示。该嗅觉仪由一根30 cm长的玻璃管组成，通过聚四氟乙烯（Teflon）条将其分成两个独立的端口，形成T形迷宫。每一半相当于一个双选择式嗅觉仪的臂，使测试对象可在两个潜在的气味区域之间进行选择。
   1. 组装及后续试验应在温度可控的房间或环境培养箱中进行。
   2. 如图1所示，将玻璃T形迷宫嗅觉仪垂直安装，并置于900勒克斯（lux）荧光灯下。
   3. 为实现最佳的光线扩散，应将装置安装在一个1.0 × 0.6 × 0.6 m的不透明容器内，以最大化均匀的光线分布。
   4. 通过聚四氟乙烯-玻璃管连接件，将嗅觉仪的两个臂连接至气味源，气味源置于固相微萃取保持/气味源室（SPMEC）（ARS, Inc., Gainesville, FL）中。每个SPMEC由一根直玻璃管（长17.5 cm，宽3.5 cm）构成，并配有进气和出气阀门，用于输入和输出气流（图1）。
   5. 将供气系统连接至外部加湿且经碳净化的气源，并保持恒定压力（若无外部气源，供气系统内部配有碳过滤器用于空气纯化，以及气泡加湿器用于加湿）。
   6. 将所需化学样品溶解于适当的稀释剂（溶剂）中，并用移液器滴加至缓释基质（如棉芯）上（Petty John Packaging, Inc., Concord, NC）。对照处理应使用仅含溶剂的棉芯。
   7. 为防止玻璃器皿严重污染，用实验室纸巾（Kimwipes, Kimberly-Clark, Roswell, GA）包裹处理组和对照组的棉芯，并将其放入两个SPMEC臂中（ARS, Inc., Gainesville, FL）。若使用活体植物样品，可将 Guillotine 挥发物收集室连接至嗅觉仪，替代SPMEC（图1）。
   8. 通过连接至供气系统的两个泵，将纯化并加湿的空气输送至SPMEC（或Guillotine挥发物室）（图1）。保持通过嗅觉仪两个臂的气流速率为0.1 L/min。
2. 利用嗅觉仪测试节肢动物对潜在驱避剂的反应。在本描述中，以半翅目昆虫——亚洲柑橘木虱（Diaphorina citri）作为测试节肢动物。测试其对柑橘挥发物单独或与驱避剂（二甲基二硫）组合，以及洁净空气作为气味源的反应。
   1. 所有实验均应在标准化的温度和相对湿度条件下进行。
   2. 在所有测试前，先在T形迷宫嗅觉仪中测试对象对洁净空气 vs 洁净空气，或溶剂 vs 洁净空气的反应，以确认无位置偏好，或溶剂对测试对象行为无影响。
   3. 在每次生物测定开始时，随机将某一气味源分配至嗅觉仪的一个臂中。每完成至少10个测试对象后，交换该位置，以消除位置偏好的可能。
   4. 每种处理组合至少测试30个（最多120个）测试对象。
   5. 根据先前确定的行为反应（潜伏期）时间间隔，允许测试对象在100–300秒内表现出行为反应。
   6. 记录测试对象是进入处理臂、对照臂，还是停留在释放口或T形迷宫分叉下方。
   7. 当测试对象穿过T形迷宫的分界线并进入任一嗅觉仪臂时，记为选择处理臂或对照臂。
   8. 当测试对象停留在释放口或T形迷宫分叉下方时，记为选择释放臂。
   9. 在不同气味处理使用之间，用2%肥皂溶液彻底清洗嗅觉仪及连接管，并将玻璃部件在200 °F下烘烤。
   10. 在T形迷宫嗅觉仪中测试潜在驱避剂处理（单独或与化学处理组合）与洁净空气的实验中，采用单因素方差分析（ANOVA）比较各处理间停留在释放点且未进入嗅觉仪的测试对象数量，随后进行Tukey HSD检验（α < 0.05）。对于离开释放臂的测试对象，采用卡方（χ²）分析比较选择对照臂与处理臂的数量，显著性水平α < 0.05。

结果

亚洲柑橘木虱（Diaphorina citri）成虫对寄主植物挥发物（柑橘）气味的趋性如图2A所示。与空白对照（洁净空气）相比，显著更多成虫（α < 0.05）选择通入活体柑橘植株气味的T型迷宫臂。

排斥作用的一个示例如图2B所示。在此实验中，昆虫被暴露于T型迷宫的一个臂中，该臂通入柑橘挥发物，而另一臂则通入经已知驱避剂二甲基二硫化物处理过的柑橘植株所释放的挥发物¹¹。在此情况下，观察到三种类型的行为。在释放臂处停留且无反应的木虱数量，与进入仅接收来自普通柑橘植株气味臂的木虱数量相比，统计学上无显著差异（图2B）。然而，当寄主植物挥发物与驱避剂共同存在时，没有木虱进入含有该混合气味的臂（图2B）。

图1. 垂直取向T型迷宫嗅觉仪与空气输送系统及气味处理释放装置连接的示意图。 本图改编自 Mann et al.¹⁰ 中的 图1。将单个测试对象放入两通道分隔式T型嗅觉仪的释放室中。测试对象通过一个闸阀向上移动进入嗅觉仪，该闸阀可控制其向上运动，并防止昆虫爬回释放区域。在闸阀后10 cm处，管道分为两支。当昆虫进入分叉的某一侧0.5 cm时，即记录为对该气味的正向反应。可使用剪刀式挥发物收集室替代固相微萃取持留/气味源室（SPMEC）作为气味源。

图 2. 亚洲柑橘木虱（Diaphorina citri）成虫在垂直T型迷宫嗅觉仪中对柑橘寄主植物挥发物与洁净空气对照（A），或柑橘挥发物与同时释放的驱避剂（二甲基二硫醚）混合物之间的反应（B）。图 2A：采用单因素方差分析（ANOVA）结合Tukey HSD检验（α < 0.05）比较木虱在两个通道之间做出选择的数量（2种处理，n = 120）。不同字母标记的柱子之间差异显著（α < 0.05）。图 2B：采用单因素方差分析（ANOVA）结合Tukey HSD检验（α < 0.05）比较木虱在两个通道之间做出选择或停留在释放点的数量（3种处理，n = 120）。不同字母标记的柱子之间差异显著（α < 0.05）。

讨论

本文描述了一种用于检测小型节肢动物（昆虫纲：半翅目：木虱科）对气味物质反应的检测装置及实验方案。该方法采用选择试验，在评估潜在引诱剂时，允许昆虫在两个气味区域之间进行选择。此外，在驱避性试验中，测试对象可能表现出三种行为：离开释放臂并进入两个潜在气味区域中的其中一个，或停留在释放臂内。该嗅觉仪可实现高通量数据采集，其原理是利用了多种节肢动物固有的负向趋地性（趋向向上移动）和正向趋光性（趋向光源移动）行为反应。尽管本演示以木虱昆虫作为测试示例，但该检测方法可广泛适用于主要依靠飞行或爬行进行移动的各类节肢动物。

用于测量昆虫反应的嗅觉仪最初在几十年前开发，已在阐明昆虫引诱剂和驱避剂方面发挥了重要作用¹²。这类嗅觉仪的具体设计差异很大；然而，本文所述双选择实验的一般模式及其类似的Y型管实验，常被用于测量节肢动物对化学物质的反应。可引发昆虫持续飞行的较大型飞行隧道⁹，也获得了突破性数据，揭示了昆虫飞行及对信息化学物质定向行为的基本机制，并为害虫防治工具的实际应用提供了数据支持。

通常需要根据特定节肢动物测试对象的生物学特性，定制化设计嗅觉仪及相关仪器设备。能够适用于较广泛昆虫类群的嗅觉仪，比仅适用于少数种类的仪器更具通用性；然而，有时由于某些昆虫类群具有重要的经济意义，仍需开发高度特异性的嗅觉仪及相应的检测技术。本文所描述的设计基于已有的节肢动物实验技术，相较于Y型管生物测定法（其试验区域或选择测试装置呈Y形玻璃结构⁷），该设计可实现更为标准的双选择实验。通常情况下，Y型管的一臂通入处理过的气味物质，另一臂则保持无气味对照¹³。此类嗅觉仪的变体设计可能包括增加多个辐射状分支臂¹⁴，甚至加入土壤介质，以检测生物在土壤中移动时的行为反应¹⁵。在开发此类嗅觉仪及相关生物测定方法时，必须考虑实验条件在多大程度上模拟了自然环境，从而评估所观察到的行为反应对于测试对象生物学的实际相关性。在很大程度上，所获得数据的有效性取决于该行为生物测定方法与目标生物行为生态学之间的相关程度¹⁶。

目前所描述的嗅觉仪及行为生物测定方法专为一种倾向于以短距离“跳跃”方式启动飞行的半翅目昆虫而设计¹⁶。该嗅觉仪采用垂直结构并配合光源布置，有助于激发昆虫运动，从而可高效、高通量地检测其后续的化学介导定向行为。这种行为测定装置可能适用于多种飞行或爬行的节肢动物类群，也可轻松改造以满足非节肢动物生物的研究需求。

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
双端口分体式T型嗅觉仪	Analytical Research Systems (ARS), Inc. Gainesville, FL	无（定制）	若无法从ARS获取，目前南方科学公司（Southern Scientific，Gainesville, FL）也制造并销售此类设备。
固相微萃取支架/气味源室，配有聚四氟乙烯-玻璃管连接件	Analytical Research Systems (ARS), Inc. Gainesville, FL	RV-R3	参见上述说明
气流输送系统	Analytical Research Systems (ARS), Inc. Gainesville, FL	HADS-2AFM2C.4	参见上述说明
断头台式实验舱	Analytical Research Systems (ARS), Inc. Gainesville, FL	L3GP3	参见上述说明