用于研究再狭窄的颈动脉支架植入小鼠模型

摘要

本文描述了一种小鼠颈动脉支架植入模型。与其他类似方法相比，该手术操作极为快速、简便且易于实施，能够方便地研究血管壁对不同药物洗脱支架的反应以及再狭窄的分子机制。

摘要

尽管在过去几十年中支架技术取得了显著进展，心血管疾病仍然是西方国家死亡的主要原因。除了药物洗脱支架发展所带来的益处外，冠状动脉血运重建也伴随着支架内血栓形成和再狭窄等危及生命的风险。由于缺乏研究支架植入和再狭窄过程的适当方法，新型治疗策略的研究受到阻碍。本文描述了一种快速且易于实施的小鼠颈动脉支架植入技术，该方法可便捷地研究血管重塑的分子机制以及不同药物涂层的影响。

引言

由动脉粥样硬化进展引起的心血管疾病是工业化国家的主要死亡原因。动脉粥样硬化是一种局灶性、炎性纤维增生性反应，由血管壁内皮细胞损伤引发¹，导致斑块向血管腔内延伸，影响冠状动脉中的血流。超过75%的心肌梗死是由于炎症性斑块的薄纤维帽破裂所致²。由于这一并发症可能致命，目前临床实践中首选治疗方法为经皮腔内（冠状）血管成形术（PTCA）联合支架植入。该方法可扩张狭窄的冠状动脉，从而恢复血流；但同时也会对内皮和血管壁造成一定程度的损伤³。然而，该疗法的长期效果受限于过度的动脉重构和再狭窄⁴。

通过使用支架，经皮冠状动脉腔内成形术（PTCA）在治疗复杂病变方面变得更加有效，可在急性血管闭塞后实现再血管化⁵。该方法可将支架内再狭窄的发生率降低至10%以下⁶。尽管具有这些优势，这种冠状动脉再血管化的首选疗法仍存在支架内血栓形成和再狭窄等危及生命的风险。

支架内血栓形成是由于血管内皮细胞脱落，继而导致大量血小板和纤维蛋白在损伤部位黏附所致。26%的患者会发生支架内血栓，其中63%死于心肌梗死⁷。再狭窄是指血管壁受到机械性损伤后发生的伤口愈合过程，涉及新生内膜增生（血管平滑肌细胞（VSMC）的迁移与增殖、细胞外基质（ECM）沉积以及血管重塑）。由于支架内血栓形成和再狭窄，常需进行侵入性再干预以扩张严重狭窄的动脉粥样硬化血管。

为预防支架内血栓形成，必须长期使用抗血栓药物治疗⁸。为预防再狭窄，新一代药物洗脱支架通过聚合物涂层在数月内释放抗增殖剂，如免疫抑制剂（例如西罗莫司、依维莫司、佐他莫司）和抗癌药物（例如紫杉醇）^9,10。尽管这些药物可减少新生内膜形成和再狭窄，但其通过抑制内皮再形成，仍维持较高的支架内血栓形成风险。

动脉损伤后，维持内皮细胞室的完整性对于预防血栓性并发症至关重要。在生理条件下，人类内皮细胞的更新率较低¹¹。然而，在病理条件下，内皮完整性受到破坏，需要邻近成熟的内皮细胞和循环中的内皮祖细胞（EPCs）迅速修复^12,13。

在较大型动物^14-16或小鼠主动脉中研究这些复杂的分子机制是一项非常困难的操作，所能获得的数据十分有限^17-19。为了评估新型支架涂层在减少支架内血栓形成和再狭窄方面的有效性，亟需建立新的模型。

镍钛合金由于其高弹性、形状记忆效应以及在患者体内良好的耐受性，成为支架的理想材料平台，已成功作为裸金属支架应用于临床。这种合金使得制造外径为500 μm的微型支架成为可能，该支架可进行涂层处理²⁰，并植入小鼠颈动脉。微型镍钛合金支架在小鼠颈动脉中的开发，使研究支架植入所诱导的精确分子机制成为可能，并为快速高效地测试不同药物涂层在预防再狭窄方面的效果提供了平台。此外，多种基因敲除小鼠品系的存在，为阐明参与新生内膜增生及支架内血栓形成的不同分子的作用提供了巨大优势。

方案

1. 支架准备与植入

1. 支架丝（Fort Wayne Metals，Castlebar，爱尔兰）由德国亚琛工业大学纺织技术与机械工程研究所编织，然后切割至所需尺寸（图1A）。
2. 植入前，需使用镊子将支架转移至一段2 cm长的硅胶管中，并使其前端（即近端）距离管的一端2 mm处放置（图1A）。
3. 近端应斜向切割，以确保植入时具有锐利的尖端。
4. 植入前应充分润湿支架，以确保其顺利滑动。

2. 支架植入术

1. 使用腹腔注射100 mg/kg氯胺酮和10 mg/kg赛拉嗪，对10-12周龄、雄性、体重25-27 g的C57Bl/6野生型小鼠进行麻醉。通过检查反射消失及胡须无运动，确认麻醉效果。为防止麻醉期间眼睛干燥，需在小鼠眼部涂抹一层贝潘廷软膏。
2. 剃除颈部腹侧毛发并彻底消毒后，在体视显微镜下用剪刀做一长约1 cm的正中切口。使用无菌弯头镊分离两侧脂肪组织后，可见左侧颈总动脉随气管搏动。
3. 应游离左侧颈总动脉约1 cm及颈动脉分叉处。使用5/0丝线在左侧颈总动脉上打一个结，使用7/0丝线在左侧颈外动脉上打两个结，另使用一根7/0丝线在左侧颈内动脉上打一个结（图1B）。
4. 通过紧扎颈内动脉和近端颈外动脉上的结，同时牵拉环绕颈总动脉的结，从而阻断血流。血管应固定成使颈总动脉与颈外动脉呈直线排列。
5. 在靠近近端结扎处的颈外动脉上，使用Vannas剪刀做一小切口。将带有支架的硅胶导管前端朝向远端，通过导丝引导插入颈外动脉。当支架到达预定位置后，沿导丝回撤硅胶导管，使支架因形状记忆效应而展开（图1B）。
6. 收紧颈外动脉远端的结以闭合切口，并拆除颈内动脉和颈总动脉上的结，从而恢复血流。
7. 使用3-4个米歇尔缝合夹和米歇尔镊关闭皮肤切口。将小鼠置于红光灯下直至完全苏醒。无需给予镇痛治疗。
8. 可在术后1-3周分析斑块形成情况。若研究再内皮化过程，则需更早的终点（3-4天）。在我们的支架植入模型中观察到，尤其是使用特定涂层对微型支架进行生物功能化后，约30%的样本在手术4周后出现新生血管生成。这会干扰组织重塑和再生过程，涉及不同机制，并构成另一类病理问题。为专注于新生内膜形成、支架内狭窄及支架植入后这些副作用相关机制的分析，选择3周作为实验终点较为适宜，以避免与新生血管生成引发的再生效应相混淆。

3. 斑块形成分析

1. 在终点时间点，通过腹腔注射 100 mg/kg 氯胺酮和 10 mg/kg 赛拉嗪对动物进行麻醉。手术前通过检查反射消失和胡须无运动来确认麻醉效果充分。
2. 动物通过心脏穿刺放血处死。收集血清用于后续分析。
3. 打开胸腔并经心脏穿刺用 PBS 冲洗后，以 4% 多聚甲醛（PFA）溶液进行 5 分钟的全身灌注固定。包含支架的左侧颈总动脉被分离出来，直接放入 4% PFA 溶液中，并在至少 16 小时后包埋于塑料介质中。
4. 使用金刚石带锯对塑料包埋的样本进行 50 μm 厚度的切片。
5. 为测量斑块大小，进行吉姆萨染色（Giemsa staining）。
6. 为分析血管支架植入区域的再内皮化速率，进行血管性血友病因子（von Willebrand factor, vWF）的免疫组织化学染色。

结果

1. 将微型镍钛合金支架植入小鼠左侧颈总动脉的手术耗时25–30分钟，手术死亡率约为10%，主要原因为术中血管损伤。在支架植入时体重超过25 g的小鼠中，术后存活率更高（死亡率为5%）。因此，我们选择体重在25–27 g之间的小鼠进行支架植入手术。术后，小鼠在2–5分钟内即可从麻醉中恢复，且未观察到任何身体功能障碍，例如 例如 瘫痪等症状被观察到。支架植入一周后进行的微型计算机断层扫描（Micro-CT）成像显示，支架未因血流而发生移位（图1C）。遗憾的是，由于金属衍生的伪影，无法对这些图像中的新生内膜形成进行分析（图1D，1E).
2. 我们未观察到支架下方血管未支架区域的任何血管或内皮损伤，通过组织学检查（图2A) 以及内皮特异性染色（图2B，抗小鼠CD31抗体）。为了获得更清晰的整体视图，使用双光子激光扫描显微镜对切片进行扫描（图2B，2C).
3. 在支架植入的血管中，可检测到15%的永久性扩张（支架：动脉比值为1.15:1），该数据来自体重为25–27 g的小鼠。新生内膜形成和血栓形成可通过经典组织学染色进行分析例如 苏木精-伊红、吉姆萨、莫瓦特、甲苯胺蓝、马松-三色-戈德纳 图3A、3B）。由于外层和内层弹力膜已不可见，斑块面积计算为外弹力膜面积与管腔面积之差（平均斑块面积：234566 ± 3315 μm²，管腔平均面积：12036 ± 2662 μm²）。外部周长也进行了测量（平均值：1799 ± 14 μm）。为分析细胞组成，需对切片进行脱塑处理，并用特异性标记物染色。对于再内皮化，我们使用了Cy3标记的抗CD31抗体，对于平滑肌细胞增殖则使用了FITC标记的抗SMA抗体（图3C再内皮化率计算为支架植入一周后管腔表面CD31阳性染色区域占总管腔表面积的百分比（平均值：23.07 ± 3.14%）。

当然，可以进行无限多种特异性染色，具体取决于各实验室的经验。可根据研究目的，对肌球蛋白重链进行分析，以更好地表征平滑肌细胞，也可对浸润的细胞（如单核细胞、淋巴细胞）或不同炎症性细胞因子进行染色分析。

图1. 手术过程的示意图 (A)。通过牢固结扎颈内动脉和近端颈外动脉上的结，并牵拉环绕颈总动脉的结，从而阻断血流。通过颈外动脉上的小切口，将含有支架的硅胶管插入颈外动脉。当支架到达目标位置后，将硅胶管沿导丝回撤，使支架发生形状记忆性扩张。显微CT图像显示术后一周支架的位置 (B)。由于材料引起的伪影，无法对新生内膜的生长进行分析 (C,D)。

图 2. 血管未置入支架的区域未受手术操作影响，甲苯胺蓝染色 (A) 及内皮细胞特异性 CD31 染色 (B, C) 结果显示如此。

图 3. 可通过经典组织学染色（例如 Masson-Trichrom-Goldner）对斑块进行分析 (A)。通过新生内膜内黑色染色的纤维蛋白沉积可检测到结构化的血栓，在某些情况下可观察到血管完全闭塞 (B)。通过使用特异性标记物的双重免疫荧光染色检测再内皮化（Cy3，红色）或平滑肌细胞增殖（FITC，绿色）。复染使用4',6-二脒基-2-苯基吲哚（DAPI，蓝色）(C)。我们注意到支架支柱处再内皮化已完成（左侧，双箭头），而管腔侧再内皮化尚未完成（右侧，单箭头）。

讨论

为了降低支架内血栓形成和再狭窄的风险，并持续推动用于药物洗脱支架的新涂层的研发，亟需一种在动物模型中简便易行且可及性高的支架植入方法。小鼠是研究支架植入后动脉重塑复杂机制以及相关药物疗效的理想体系。目前已有的一些小鼠支架内再狭窄模型操作困难，需要高超的外科技术，并伴随较高的并发症风险，如出血或瘫痪^17-19。例如，在一种将支架植入供体小鼠胸主动脉（经球囊扩张后）并将其带支架的血管段移植至受体小鼠颈动脉的模型中¹⁷，病理机制的研究不仅受到受体对供体材料反应的影响，还受到血管滋养血管和外膜严重损伤的干扰。在球囊扩张后将不锈钢支架直接植入腹主动脉的模型¹⁹，术后死亡率较高（达35%），主要原因是动脉切开部位发生腹主动脉血栓或出血，导致后肢瘫痪。经股动脉途径将螺旋形自膨胀式镍钛合金支架植入腹主动脉的模型¹⁸则需要极高的手术技巧，主要是由于需在盲穿条件下将支架沿股动脉至主动脉的分叉处推进，以确保支架准确定位。该操作过程易损伤股神经，从而导致后肢瘫痪。与上述方法相比，我们建立的小鼠支架植入模型无需高难度的外科操作技能。

我们的模型提供了一种简单、便捷且高效的方法，用于分析不同药物涂层对动脉重塑的影响。支架的放置在直视下完成，因此不存在损伤神经或其他结构的风险。在小鼠颈动脉支架植入模型中，复杂的分子机制更容易被研究，这不仅得益于血管的直接可及性，还得益于存在多种不同的基因敲除小鼠品系。

作为一个局限性，与临床操作相比，我们的模型使用的是健康小鼠/动脉，并未在已存在的斑块上进行支架置入（因此不是支架内再狭窄，而是支架内狭窄）。此外，我们在支架植入前也未进行球囊扩张。然而，由于两种模型中血管壁均受到严重损伤，其修复过程是相似的。遗憾的是，由于金属引起的伪影， 体内 现有的成像方法（如超声或计算机断层扫描）无法对新生内膜的生长进行监测。另一个限制因素是金属基支架的薄切片处理，这需要具备一定的金属加工专业技术。

利用该方法，我们能够证明，用LL-37涂层的功能化微型镍钛诺支架可指导中性粒细胞行为，减少支架内再狭窄，为介入治疗后促进血管愈合提供了一种新概念²¹。

尽管存在这些局限性，但迄今为止，该模型似乎是研究支架新型药物涂层及其对动脉重塑过程中分子事件影响的最合适系统，因而能够节约经费和时间。此外，该模型可轻松应用于与人类更为相似的仓鼠，从而可在将治疗假设应用于大型动物或人体之前进行验证，以避免出现不良或意外效应。

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
镍钛合金支架（由镍钛合金杆自制成）	Fort Wayne Metals，爱尔兰卡斯尔巴，NiTi#1，超弹性，直丝退火，轻氧化层，直径 500 μm	定制产品	纺织技术与机械工程研究所
硅胶管	IFK Isofluor，德国	定制产品	直径 500 μm，管壁厚度 100 μm，聚四氟乙烯导管
体视显微镜	Olympus	SZ/X9
镊子	FST，德国	91197-00	标准尖端，弯曲，0.17 mm
10% 氯胺酮	CEVA，德国
2% 赛拉嗪	Medistar，德国
贝潘胺	Bayer，德国
剪刀	FST，德国	91460-11	直头
万纳斯剪刀	Aesculap，德国	OC 498 R
5/0 丝线	Seraflex	IC 108000
7/0 丝线	Seraflex	IC 1005171Z
导丝	Abbott Vascular	1001782-HC	0.014 英寸血管成形术导丝
米歇尔缝合夹	Aesculap，德国	BN507R	7.5 × 1.75 mm
米歇尔镊	Aesculap，德国	BN730R