Drosophila 幼虫中研究先天性和昼夜节律调控光行为的光偏好实验

摘要

本文介绍了一种果蝇幼虫的明暗偏好实验。该检测方法可提供有关光感知及光行为的先天性与昼夜节律调控的信息。

摘要

光作为一种环境信号，在多个层面上调控动物的行为。Drosophila 幼虫神经系统被用作独特模型，以回答有关光信息如何在快速行为与昼夜节律行为之间被处理和共享的基本科学问题。当暴露于光照时，Drosophila 幼虫表现出典型的避光行为。为了比较性地研究光依赖性行为，可采用相对简单的明暗偏好测试。在脊椎动物和节肢动物中，参与感知和处理视觉输入的神经通路，与处理光周期性昼夜节律信息的通路存在部分重叠。光感受系统与昼夜节律系统如何相互作用以维持行为输出的协调性，这一引人入胜的问题在很大程度上仍未被探索。Drosophila 是研究这些问题的重要生物学模型，因其脑内神经元数量较少，且具备可用于神经元操控的丰富遗传工具。本文所展示的明暗偏好实验可用于研究多种视觉行为，包括光趋性行为的昼夜节律调控。

引言

本文介绍一种基于幼虫对黑暗（或光亮）偏好的行为检测方法。在觅食阶段（L1 至早期 L3），幼虫会表现出强烈且刻板的负趋光反应¹。该行为检测旨在评估幼虫的畏光行为，通过比较一组幼虫在涂有琼脂的培养皿中自由移动时对光照或黑暗区域的选择偏好。该行为检测不仅能够提供关于视觉系统敏感性、信号整合能力及时间可塑性的信息，还可揭示光敏感性及其信号处理过程如何受到昼夜节律系统的调控。

Drosophila 幼虫的眼（也称为 Bowlig 器官，BO）是感知光线的主要器官。每只眼由 12 个感光细胞（PR）组成，其中 8 个感光细胞表达对绿光敏感的视紫红质6（rhodopsin6, rh6），另外 4 个感光细胞表达对蓝光敏感的视紫红质5（rhodopsin5, rh5）^2,3。除了感光细胞外，覆盖幼虫体壁的 IV 类多树突神经元也被发现能够响应有害强度的光照^4,5。此外，已知位于幼虫中枢脑部的生物钟起搏神经元表达光敏蛋白隐花色素（Cryptochrome, Cry），该蛋白在脑内作为内在的蓝光感受器发挥作用^6,7。引人注意的是，在昼夜不同时间点进行本实验检测时，野生型动物的避光行为表现出明显的昼夜节律特征。在觅食的三龄幼虫中，测试其明暗偏好时发现，黎明时避光性更强，而黄昏时避光性较弱⁷。有趣的是，只有 Rh5-PRs 参与介导避....

方案

1. 幼虫饲养

1. 在配备光照和定时器的果蝇培养箱中，将果蝇品系或遗传杂交在25 °C、12小时光照-12小时黑暗循环条件下，置于玉米粉培养基上进行大规模培养。
2. 将酿酒酵母用蒸馏水稀释成流体状糊剂（10 g 酿酒酵母加入 3–4 ml 蒸馏 H₂O）。在玉米粉培养基表面加入少量酵母糊剂液滴，并盖好试管。静置干燥至少一小时，以避免成年果蝇粘附在酵母糊剂上。在培养基表面添加少量用水稀释的酵母液滴可促进产卵。替代方法可使用酿酒酵母糊剂或20%乙酸（AcOH）（Sigma Aldrich，瑞士 A6283-100ML）。操作时，将棉签尖端浸入溶液中，然后在玉米粉培养基表面涂抹。
3. 将成年果蝇（至少四天大，但不超过十天）放入盛有玉米粉培养基的试管中。每管放入足够数量的成年果蝇，以获得充足的幼虫用于多次重复偏好测试，并实现统计学比较。对于遗传杂交，通常每管使用至少20只雌蝇和5–10只雄蝇，但某些品系需要更多雌蝇以获得足够的幼虫后代。
4. 让成年果蝇产卵12小时后转移至新的试管中。成年果蝇可在早晨或傍晚转移。通常我们连续转移成年果蝇7至10天，必要时更换新的成年果蝇。
5. 将每12小时收集一次的卵置于培养箱中，在25 °C、12小时光照-12小时黑暗循环、60%湿度条件下培养幼虫。若需检测视觉行为的昼夜节律成分，则在收集卵后48小时（相当于经历两个光-暗循环）将幼虫转移至持续黑暗（DD）环境中。为此，使用一个无光照的独立培....

结果

根据上述方案，我们在两个不同的昼夜节律时间点（CT0 和 CT12），检测了野生型 Canton-S 果蝇在早期三龄幼虫阶段的明暗偏好。成虫在 12 小时光照-12 小时黑暗的条件下培养，并允许其产卵 12 小时。幼虫在前两天继续生长于相同的光暗周期条件下。由于我们希望在恒定条件下（即昼夜节律钟自由运行状态）检测昼夜节律的调节作用，因此在接下来的三天中，将幼虫转移至持续黑暗环境中，直至进行实验测试（图 3A）。

此处，我们使用了350 lux，因为已有研究表明，该光照强度是检测光反应差异的最佳条件 果蝇 在昼夜节律周期中，与其他光照强度（70 和 600 勒克斯）相比的幼虫表现⁷比较CT0与CT12时，可观察到光敏感性的差异，因而光反应也存在差异。 果蝇，CT0 对应黎明时刻，CT0 至 CT12 的半周期被视为主观日，CT12 至 CT24 则被视为主观夜¹²光照敏感性在从黑暗转为光照后的短时间内较高，此时约有77%的幼虫偏好黑暗，相比之下，在主观夜晚早期偏好黑暗的幼.......

讨论

本文所述的光偏好实验利用了幼虫天生的趋光行为。该检测方法易于建立，可在低成本下进行多次重复实验，并提供有关光感知与信息处理的宝贵数据。该实验范式能够相对快速地量化偏好光照或黑暗的个体数量。此类偏好可用粗略百分比表示，也可用偏好指数（PREF）表示。PREF的计算方法为：偏好光照的动物数减去偏好黑暗的动物数，再除以动物总数。

光照偏好实验的一个关键点是实验持续时间。在此，我们测试了5分钟；然而，对于其他基因型或不同光照质量，使用该实验时长可能无法清晰地表现出差异。对于某些刺激（如味觉），我们发现持续20分钟的较长时间实验能够获得更明确的偏好结果，且变异性更小。在使用运动能力或感觉敏感性受影响的基因型时，幼虫可能需要更长时间探索实验培养板，此时测试不同的实验时长可能是合理的。在这种情况下，对照组和实验组的时长应进行同等调整。

该检测方法还允许检测昼夜节律周期中不同时间点之间的差异，如本文及先前报道所示^7,13。光刺激引起的光反应受到生物钟的强烈调控，可能是通过调节光感受器的敏感性实现的。幼虫对光的反应在白天的.......

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
琼脂	Sigma-Aldrich	A5093-500G	2.5%；Sigma-Aldrich，9471 Buchs，瑞士
培养皿	Greiner Bio-One GmbH	633180	直径90 mm；Greiner Bio-One GmbH，4550 Kremsmeinster，奥地利
LED灯	OSARAM	80012 White	LED灯，80012 White
环境检测仪	PCE	PCE EM882	照度、温度、相对湿度%
恒温培养箱	Aqua Lytic (Liebherr)	ET636-6
光照定时器	Timer T	6185.104	230V/50HZ（请根据所在国家的规格进行核对）
通用恒温控制器	Conrad	UT200
加湿器	Boneco
黑色胶带	Tesa		5 cm
胶水	Uhu
培养箱灯	Phillips	Softtone	5W
定时钟	Ziliss		Ziliss，瑞士
Excel软件	Microsoft		Excel
Origin软件8.5版	OriginLab
面包酵母	Migros 瑞士
铁制支撑架 17×28 cm	Fisher Scientific	S47808
乙酸	Sigma Aldrich	A6283-100ML	20%乙酸稀释于H2O
红光灯	Phillips	PFE712E*8C
药匙	Fisher Scientific	14-373-25A
电源	EA	EA PS 2042-06B	可选
铝箔	Prix Coop
加热器	GOON	NSB200C
微波炉	Intertronic
标准玉米粉果蝇培养基
蒸馏水