Drosophila 幼虫中研究先天性和昼夜节律调控光行为的光偏好实验

摘要

本文介绍了一种果蝇幼虫的明暗偏好实验。该检测方法可提供有关光感知及光行为的先天性与昼夜节律调控的信息。

摘要

光作为一种环境信号，在多个层面上调控动物的行为。Drosophila 幼虫神经系统被用作独特模型，以回答有关光信息如何在快速行为与昼夜节律行为之间被处理和共享的基本科学问题。当暴露于光照时，Drosophila 幼虫表现出典型的避光行为。为了比较性地研究光依赖性行为，可采用相对简单的明暗偏好测试。在脊椎动物和节肢动物中，参与感知和处理视觉输入的神经通路，与处理光周期性昼夜节律信息的通路存在部分重叠。光感受系统与昼夜节律系统如何相互作用以维持行为输出的协调性，这一引人入胜的问题在很大程度上仍未被探索。Drosophila 是研究这些问题的重要生物学模型，因其脑内神经元数量较少，且具备可用于神经元操控的丰富遗传工具。本文所展示的明暗偏好实验可用于研究多种视觉行为，包括光趋性行为的昼夜节律调控。

引言

本文介绍一种基于幼虫对黑暗（或光亮）偏好的行为检测方法。在觅食阶段（L1 至早期 L3），幼虫会表现出强烈且刻板的负趋光反应¹。该行为检测旨在评估幼虫的畏光行为，通过比较一组幼虫在涂有琼脂的培养皿中自由移动时对光照或黑暗区域的选择偏好。该行为检测不仅能够提供关于视觉系统敏感性、信号整合能力及时间可塑性的信息，还可揭示光敏感性及其信号处理过程如何受到昼夜节律系统的调控。

Drosophila 幼虫的眼（也称为 Bowlig 器官，BO）是感知光线的主要器官。每只眼由 12 个感光细胞（PR）组成，其中 8 个感光细胞表达对绿光敏感的视紫红质6（rhodopsin6, rh6），另外 4 个感光细胞表达对蓝光敏感的视紫红质5（rhodopsin5, rh5）^2,3。除了感光细胞外，覆盖幼虫体壁的 IV 类多树突神经元也被发现能够响应有害强度的光照^4,5。此外，已知位于幼虫中枢脑部的生物钟起搏神经元表达光敏蛋白隐花色素（Cryptochrome, Cry），该蛋白在脑内作为内在的蓝光感受器发挥作用^6,7。引人注意的是，在昼夜不同时间点进行本实验检测时，野生型动物的避光行为表现出明显的昼夜节律特征。在觅食的三龄幼虫中，测试其明暗偏好时发现，黎明时避光性更强，而黄昏时避光性较弱⁷。有趣的是，只有 Rh5-PRs 参与介导避光行为，而 Rh6-PRs 则非必需。然而，Rh5-PRs 和 Rh6-PRs 均参与光对分子生物钟的重置过程⁸。Cry 信号通路必须与其他感光通路协调作用，以在一天的不同阶段调控出适当的行为输出。感光细胞中的乙酰胆碱在避光行为以及分子生物钟的同步化中发挥关键作用。阻断感光细胞向昼夜节律起搏神经元的乙酰胆碱神经传递，会降低在明暗偏好实验中的避光反应⁸。利用相同的实验方法，最近已鉴定出两对对称的神经元，可切换 Drosophila 三龄幼虫的光偏好行为⁹。这两对神经元可能在晚期幼虫阶段发挥作用，此时幼虫离开食物，推测是为了寻找合适的化蛹场所。然而，视觉通路如何以昼夜节律方式相互作用并调控幼虫视觉行为的问题，目前仍 largely 未被解答。光偏好实验可用于比较不同昼夜时间点、不同果蝇品系以及不同昼夜节律状态下，在不同光质条件下的行为差异。该实验制备简便、成本低廉，此前已在多个实验室中被成功用于描述和研究幼虫的光诱导行为。

方案

1. 幼虫饲养

1. 在配备光照和定时器的果蝇培养箱中，将果蝇品系或遗传杂交在25 °C、12小时光照-12小时黑暗循环条件下，置于玉米粉培养基上进行大规模培养。
2. 将酿酒酵母用蒸馏水稀释成流体状糊剂（10 g 酿酒酵母加入 3–4 ml 蒸馏 H₂O）。在玉米粉培养基表面加入少量酵母糊剂液滴，并盖好试管。静置干燥至少一小时，以避免成年果蝇粘附在酵母糊剂上。在培养基表面添加少量用水稀释的酵母液滴可促进产卵。替代方法可使用酿酒酵母糊剂或20%乙酸（AcOH）（Sigma Aldrich，瑞士 A6283-100ML）。操作时，将棉签尖端浸入溶液中，然后在玉米粉培养基表面涂抹。
3. 将成年果蝇（至少四天大，但不超过十天）放入盛有玉米粉培养基的试管中。每管放入足够数量的成年果蝇，以获得充足的幼虫用于多次重复偏好测试，并实现统计学比较。对于遗传杂交，通常每管使用至少20只雌蝇和5–10只雄蝇，但某些品系需要更多雌蝇以获得足够的幼虫后代。
4. 让成年果蝇产卵12小时后转移至新的试管中。成年果蝇可在早晨或傍晚转移。通常我们连续转移成年果蝇7至10天，必要时更换新的成年果蝇。
5. 将每12小时收集一次的卵置于培养箱中，在25 °C、12小时光照-12小时黑暗循环、60%湿度条件下培养幼虫。若需检测视觉行为的昼夜节律成分，则在收集卵后48小时（相当于经历两个光-暗循环）将幼虫转移至持续黑暗（DD）环境中。为此，使用一个无光照的独立培养箱，但保持温度和湿度等其他条件一致。务必在光周期即将转入黑暗阶段前将试管转移至DD培养箱。在转移前，将试管放入纸板箱中或用铝箔包裹，以防止转移过程中暴露于光照（纸板箱包装或铝箔包裹操作必须在“光照开启阶段”完成，即在培养箱转移前进行）。自此之后直至实验开始，必须确保动物完全避免任何光照暴露。
6. 在产卵后第4天（84至108小时）收集处于早期L3阶段的取食幼虫（feeding larvae），用于后续测试时间点的实验（参见第4节“光偏好测试”中的第4.4点）。

2. 测试设置

1. 在温度和湿度恒定的暗室中进行实验。
2. 为使培养皿的两个象限保持黑暗，用黑色胶带和铝箔覆盖皿盖。操作时，先标记皿盖圆周的中心点，并在盖缘标记四个相互间隔90°的点。为方便操作，可在纸张或计算机辅助下绘制一个20 cm的正方形，将其分为四个10 cm的象限。裁剪10 cm见方的铝箔和黑色胶带（图1A）。将铝箔作为第一层覆盖在两个相对的象限上，再用黑色胶带完全覆盖铝箔，并注意同时覆盖皿盖边缘。
   此前曾使用过两种略有差异的实验方法。本文采用“四分板”法，即将培养皿均分为四个相等的象限¹⁰。另一种为“半板”法，即将培养皿分为两半（一半暴露于光下，一半处于黑暗）^1,7,8。迄今为止，尚未发表两种方法之间存在显著差异的报道。
3. 在光源正下方的桌面上粘贴一个用于标记象限的图样。以象限交点为中心，在纸上标出培养皿的圆周轮廓。利用这些标记作为参照，确保每次测试平板均放置在光源下的相同位置。
4. 借助铁质支架（Fisher Scientific, S47808），在培养皿上方安装一盏灯，可选用普通白炽灯泡（Phillips, Softtone 5W）或LED灯（LED lamp, 80012 White, Osram）。调节灯的高度，使整个测试平板均匀受光。我们强烈推荐使用LED灯，因其比传统灯泡发射更特定的波长，且产热更少。
5. 使用照度计（Environment Meter PCE EM882）调节光照强度。通过上下移动灯的位置，使光照强度达到所需的350–760 lux范围。将灯连接至可调电源可更灵活地调节光照强度，而无需移动灯的位置（图1B）。

3. 培养皿制备

1. 使用双蒸水（Millipore）配制 200 ml 的 2.5 % 琼脂（Sigma-Aldrich, 瑞士 A5093-500G）。
2. 将培养皿（直径 90 mm；Greiner Bio-One GmbH, 4550 Kremsmünster, 奥地利）排成行放置在桌面上，以便倾注热的琼脂糖溶液。
3. 将琼脂糖在微波炉中加热至完全透明且呈液态。确保液体中不含气泡。注意：转移时需小心，因为溶液可能非常烫！
4. 将热的琼脂糖溶液迅速倒入培养皿中，使整个表面均匀覆盖一层约两到三毫米厚的溶液。操作需迅速，以防止在完成所有培养皿涂布前琼脂糖提前凝固。让培养皿自然冷却。平板置于室温下保存，并仅限在制备当天使用。

4. 光偏好测试

1. 在实验室内使用红光条件下操作，以防止测试前光照对果蝇产生影响，因为 Drosophila 无法感知光的红光波长。使用安装在灯具中的红色灯泡（Phillips, PFE712E*8）照亮工作区域。
2. 所有实验过程中维持温度为 25 °C。必要时通过加热器或制冷设备控制室内温度。
3. 从在持续黑暗条件下培养两天的试管中取出部分培养基（来自第1节）。由于幼虫通常在培养基表面挖掘，使用刮勺（Fisher Scientific, 14-373-25A）取最上层约 5 mm 深的培养基。将培养基铺展在培养皿盖的外侧，加入少量水，并用刮勺轻轻混匀。
4. 从培养基中收集取食阶段的三龄幼虫（L3）。由于将测试幼虫对光的偏好，仅选择早期/取食阶段的三龄幼虫至关重要，因为此阶段幼虫具有明确的负趋光性。晚期/游走期三龄幼虫或在培养基上爬行的较大幼虫可能已改变其趋光行为。取食阶段的三龄幼虫（负趋光性）可通过其前气门张开并以指状向外突出进行识别；后气门各有三个开口，以及四组大型分枝毛。唾液腺延伸至第二腹节¹¹。在显微镜下进行幼虫分期较为方便，但不应使用白光。若实验前需在体视显微镜下进行分期，则必须使用红光灯照明幼虫。
5. 用自来水短暂清洗幼虫，并收集早期取食阶段的三龄幼虫（仍在红光条件下）。在将幼虫转移至测试培养皿前，使用湿润的画笔轻轻蘸取幼虫，并用纸巾或滤纸小心吸去多余水分。切勿过度干燥幼虫，以免对其造成伤害并影响其行为。
6. 使用湿润的画笔小心地将幼虫转移至培养皿中。将约 30 只幼虫作为一个群体放置在培养皿中央。盖上已预先划分象限的皿盖，并将培养皿置于光源下准备开始实验（参见第2节）。
7. 打开白光灯并启动计时器。让幼虫在培养皿中自由爬行 5 分钟后，迅速移去皿盖，统计处于黑暗象限和光照象限中的幼虫数量。可用记号笔标记每只幼虫的位置以方便计数。也可选择拍摄培养皿照片，事后进行计数。对于光偏好不明确的幼虫，例如在皿壁上爬行或钻入琼脂中的幼虫，应视为中性偏好，在计算光偏好指数时仅计入幼虫总数。
8. 计数完成后，丢弃带有幼虫的培养皿，并为下一次实验更换新的测试培养皿。将使用过的培养皿收集至高压灭菌用塑料袋中，以便后续处理和处置。
9. 完成足够数量的实验后，可开始测试新的基因型。每种基因型进行 10–15 次重复实验即足以用于分析。

5. 数据分析

1. 为便于后续统计分析，可将数据转移至计算机中的电子表格软件（如 Microsoft Excel 或 Origin Lab 的 Origin）中。将数据按以下方式排列：第一列为处于黑暗区域的动物数量，第二列为处于光亮区域的动物数量，第三列为培养皿中动物的总数（包括“中性”幼虫）。
2. 使用以下公式计算每次实验的避暗偏好指数（PREF）：
   PREF（避暗）=（黑暗区幼虫数 - 光亮区幼虫数）/ 幼虫总数
3. 使用适合分组数据的统计方法对数据集进行比较分析。本研究中采用 Wilcoxon 检验对两组数据进行统计学比较；若在多组比较中满足正态分布假设，则可采用方差分析（ANOVA）结合 Tukey 多重比较 post hoc 检验。
4. 绘制图表以清晰展示不同组别及昼夜周期中各时间点之间的比较结果。我们使用 Origin 软件（Origin Lab）进行统计显著性检验并生成相应图表，但其他任何统计软件也可用于此目的。

结果

根据上述方案，我们在两个不同的昼夜节律时间点（CT0 和 CT12），检测了野生型 Canton-S 果蝇在早期三龄幼虫阶段的明暗偏好。成虫在 12 小时光照-12 小时黑暗的条件下培养，并允许其产卵 12 小时。幼虫在前两天继续生长于相同的光暗周期条件下。由于我们希望在恒定条件下（即昼夜节律钟自由运行状态）检测昼夜节律的调节作用，因此在接下来的三天中，将幼虫转移至持续黑暗环境中，直至进行实验测试（图 3A）。

此处，我们使用了350 lux，因为已有研究表明，该光照强度是检测光反应差异的最佳条件 果蝇 在昼夜节律周期中，与其他光照强度（70 和 600 勒克斯）相比的幼虫表现⁷比较CT0与CT12时，可观察到光敏感性的差异，因而光反应也存在差异。 果蝇，CT0 对应黎明时刻，CT0 至 CT12 的半周期被视为主观日，CT12 至 CT24 则被视为主观夜¹²光照敏感性在从黑暗转为光照后的短时间内较高，此时约有77%的幼虫偏好黑暗，相比之下，在主观夜晚早期偏好黑暗的幼...

讨论

本文所述的光偏好实验利用了幼虫天生的趋光行为。该检测方法易于建立，可在低成本下进行多次重复实验，并提供有关光感知与信息处理的宝贵数据。该实验范式能够相对快速地量化偏好光照或黑暗的个体数量。此类偏好可用粗略百分比表示，也可用偏好指数（PREF）表示。PREF的计算方法为：偏好光照的动物数减去偏好黑暗的动物数，再除以动物总数。

光照偏好实验的一个关键点是实验持续时间。在此，我们测试了5分钟；然而，对于其他基因型或不同光照质量，使用该实验时长可能无法清晰地表现出差异。对于某些刺激（如味觉），我们发现持续20分钟的较长时间实验能够获得更明确的偏好结果，且变异性更小。在使用运动能力或感觉敏感性受影响的基因型时，幼虫可能需要更长时间探索实验培养板，此时测试不同的实验时长可能是合理的。在这种情况下，对照组和实验组的时长应进行同等调整。

该检测方法还允许检测昼夜节律周期中不同时间点之间的差异，如本文及先前报道所示^7,13。光刺激引起的光反应受到生物钟的强烈调控，可能是通过调节光感受器的敏感性实现的。幼虫对光的反应在白天的...

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
琼脂	Sigma-Aldrich	A5093-500G	2.5%；Sigma-Aldrich，9471 Buchs，瑞士
培养皿	Greiner Bio-One GmbH	633180	直径90 mm；Greiner Bio-One GmbH，4550 Kremsmeinster，奥地利
LED灯	OSARAM	80012 White	LED灯，80012 White
环境检测仪	PCE	PCE EM882	照度、温度、相对湿度%
恒温培养箱	Aqua Lytic (Liebherr)	ET636-6
光照定时器	Timer T	6185.104	230V/50HZ（请根据所在国家的规格进行核对）
通用恒温控制器	Conrad	UT200
加湿器	Boneco
黑色胶带	Tesa		5 cm
胶水	Uhu
培养箱灯	Phillips	Softtone	5W
定时钟	Ziliss		Ziliss，瑞士
Excel软件	Microsoft		Excel
Origin软件8.5版	OriginLab
面包酵母	Migros 瑞士
铁制支撑架 17×28 cm	Fisher Scientific	S47808
乙酸	Sigma Aldrich	A6283-100ML	20%乙酸稀释于H2O
红光灯	Phillips	PFE712E*8C
药匙	Fisher Scientific	14-373-25A
电源	EA	EA PS 2042-06B	可选
铝箔	Prix Coop
加热器	GOON	NSB200C
微波炉	Intertronic
标准玉米粉果蝇培养基
蒸馏水